14/04/2015. Genetica dei Procarioti - 5. Quorum Sensing

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1 A.A Dipartimento di Scienze della Vita CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6) Quorum Sensing Genetica dei Procarioti - 5 Prof. Laura Marri ricevimento: previo appuntamento telefonico o Bacteria produce and secrete chemical signal molecules (autoinducers) Concentration of molecules increases with increasing bacterial density When critical threshold concentration of molecule is reached, bacteria alter gene expression Gram negative and Gram positive bacteria use different signaling molecules (Acyl Homoserine lactones vs peptides) GRAM - 1

2 GRAM + Serratia liquefacens wild type Ceppo mutante AHL 2

3 AHL Acyl Homoserine Lactone autoinduttori (b) Competence and sporulating stimulating factor (CSF) autoinducer of Bacillus subtilis. (c) AI-2 autoinducer. (d) The N- butyryl-homoserine lactone of Pseudomonas aeruginosa. 3

4 Una coltura di E. coli in terreno complesso (LB) entra in fase di morte dopo tre giorni di incubazione. In questa fase, il 90-99% della popolazione muore ossidazione di proteine e DNA, programma simile all apoptosi eucariotica che determina la morte delle cellule al raggiungimento di una densità elevata EDF (extracellular death factor) attiva l operone mazef responsabile del modulo tossina-antitossina che determina la morte delle cellule al raggiungimento di una densità elevata mazf encodes a stable toxin, MazF: a sequencespecific endoribonuclease that preferentially cleaves single-stranded mrnas at ACA sequences maze encodes a labile antitoxin, MazE, that counteracts the action of MazF Any stressful condition that prevents the expression of mazef will lead to a reduction of MazE levels in the cell, permitting the MazF toxin to act 4

5 Biosensori batterici per la rivelazione di AHLs Chromobacterium violaceum proteina della famiglia LuxR promotore della famiglia LuxI A mutant of C. violaceum ATCC 31532, designed strain CV026, does not produce C6-HSL but does produce violacein in response to the presence of exogenous C6-HSL (McClean et al., 1997) gene reporter the proper production of AHL molecules has been blocked by mutation of the AHL synthase but the gene encoding the production of the purple pigment violacein remains AHL-responsive. In the presence of specific AHLs with acyl chain lengths shorter than C 10, this strain will therefore produce purple pigment due to violacein production 5

6 Controllo post-traduzionale SECREZIONE PROTEINE Nei batteri Gram-positivi le proteine secrete o sono rilasciate nell ambiente esterno oppure sono legate covalentemente al petidoglicano da specifici enzimi associati alla membrana e vanno a costituire le proteine di superficie Proteine specifiche si trovano: associate alla IM nello spazio periplasmatico OM in alcuni casi secrete completamente dalla cellula Le proteine legate alle membrane comprendono: almeno 8 sistemi IM Gram - almeno 8 sistemi OM Molte proteine sono secrete attraverso entrambe le membrane cellulari (IM, OM) dei batteri GRAM-negativi Alcune usano la via Sec per attraversare la IM ed un altra via per la OM Altre dipendono da altri sistemi per attraversare entrambe le membrane Citocromi F1/Fo ATP sintasi Proteine di trasporto Porine CITOPLASMA 1 2 Sec-pathway Il trasporto è realizzato attraverso un meccanismo dipendente da una SEQUENZA SEGNALE chaperone translocation competent state delivering protein Met X Lys/Arg Z(10-12x) Gly/Ala Regione basica core idrofobico N-terminus proteina matura 5-6 residui X = residuo idrofilico o idrofobico Z= residuo prevalentemente idrofobico PERIPLASMA forma un canale 20aa translocation complex peptidase 6

7 La proteina matura inizia il processo di ripiegamento, se a destinazione periplasmatica, oppure può essere presa in consegna da un successivo sistema di trasporto se destinata a OM/ ambiente extracellulare Phylogenetic tree of sequenced homologues of the SecY protein of E. coli and Sec61 protein of Saccharomyces cerevisiae A+B two-step process homologues follow the phylogenies of the host organisms with few exceptions 7

8 Type III T3S apparato che trasloca effettori in one step attraverso la parete usando una struttura ancestralmente correlata al flagello batterico 8

9 nomenclatura di Yersinia Yop: Yersinia outer protein solo dopo il contatto con la cellula eucariotica chaperonine specifiche Shigella type III secretion system Type IV T4S ancestralemente correlato all apparato della coniugazione che transloca DNA o substrati proteici attraverso la parete (spesso in relazione alla patogenesi) I batteri usano il sistema di secrezione di tipo IV (T4S) per due motivi fondamentali: scambio genico rilascio di molecole effettrici (EFFETTORI) a cellule eucariotiche bersaglio 9

10 (a) a model for T-pilus assembly in Agrobacterium tumefaciens VirB4 VirB8 VirB5 VirB2 interaction sequence lead to the formation of VirB2 VirB5 complexes followed by T-pilus assembly (b) transmission electron microscopic image showing T-pili and flagella on A. tumefaciens. Secretion pathway and structure of the T4S system 10

11 secondary amine derivatives formed by condensation of an amino acid, either with a ketoacid or a sugar Crown gall tumors galla del colletto Ti è un esempio di plasmide batterico naturale 11

12 MGEs: segmenti di DNA codificanti enzimi o altre proteine che consentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilità intracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare) Also, virulence plasmids from Salmonella, Shigella, Yersinia, B. anthracis, E.coli, and others. PLASMIDI nella maggior parte dei casi sono molecole di DNA circolari ( kb) ma anche lineari o integrati nel cromosoma batterico (episomi) PLASMIDI Le forme molecolari circolari superavvolte durante le manipolazioni sperimentali possono rilassarsi o linearizzarsi in seguito a rotture a singolo o a doppio filamento. plasmide superavvolto supercoiled plasmide circolare rilassato nick dal 1977 plasmide linearizzato 12

13 In un gel di agarosio e bromuro di etidio le tre forme migrano a velocità diverse e possono essere distinte forma rilassata forma lineare forma superavvolata forma linerizzata ( tagliata con un enzima di restrizione in un sito unico) Large-scale purification of plasmids by cesium chloride density gradient centrifugation old school method of purifying plasmid since the 1950s Three forms of plasmid DNA hrs during this time, the CsCl forms a gradient and the molecules migrate according to their density until they float at their individual isopycnic points (the point in the gradient that equals the buoyant density of the molecule). Plasmid replication 1. Plasmid replication requires host DNA replication machinery. 2. Most wild plasmids carry genes needed for transfer and copy number control. 3. All self replication plasmids have a oriv: origin of replication 4. Some plasmids carry and orit: origin of transfer. 5. Plasmid segregation is maintained by a par locus-a partition locus that ensures each daughter cells gets on plasmid. Not all plasmids have such sequences. 6. There are 5 main incompatibility groups of plasmid replication. Not all plasmids can live with each other. 7. Agents that disrupt DNA replication destabilize or cure plasmids from cells. 13

14 Replicazione plasmidica Replicazione plasmidica REPLICONI I plasmidi si replicano per replicazione (uni o bi-direzionale) per circolo rotante richiedono proteine plasmidiche e/o dell ospite batterico un plasmide deve contenere un origine per la replicazione del DNA Replicazione plasmidica circolo rotante replicazione REPLICONI I plasmidi si replicano per replicazione (uni o bi-direzionale) per circolo rotante richiedono proteine plasmidiche e/o dell ospite batterico 14

15 Replicazione plasmidica La capacità di replicarsi autonomamente è conferita loro dalla presenza di una origine di replicazione, ori (oriv, ori vector ) Funzioni dell origine di replicazione Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l origine di replicazione oriv controlla: Il numero di copie La specificità d ospite host protein I gruppi di incompatibilità P1 NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE I plasmidi si replicano con due modalità diverse Alcuni, generalmente quelli di grandi dimensioni, si replicano in maniera coordinata con la replicazione del cromosoma batterico e si dicono sottoposti a Altri, in genere di piccole dimensioni, si replicano in maniera indipendente dalla replicazione batterica e si dicono sottoposti a controllo rilassato controllo stringente Sono presenti in molte copie - fino a per batterio. In genere sono presenti in una o poche copie per batterio. 15

16 NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE Plasmidi ori N. di copie PUC e derivati ColE pacyc e derivati p15a psc101 e derivati Psc H I H G C O P Y N U M B E R L O W Sistema di ripartizione C O P Y N U M B E R 16

17 Sistema di ripartizione Bacterial plasmids encode partitioning (par) loci that ensure ordered plasmid segregation prior to cell division ParM binds to DNA-binding proteins, called ParR (orange proteins) around which segments of genomic DNA are coiled pars-para-parb Sister plasmid segregation is achieved through bidirectional insertional polymerization of the ParM filaments. Actina-omologo 17

18 Controllo del numero di copie I plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l inizio della replicazione plasmidica inibizione mediante RNA + proteina dell inizio della replicazione Controllo del numero di copie RNA II Rnasi H ori la replicazione è innescata da un primer (RNA II), trascritto da un promotore situato 550 bp a monte di ori. La maggior parte dei vettori di clonaggio derivano dal plasmide ColE1 Gli ibridi DNA:RNA formati dal filamento di DNA e dall RNA II nascente, costituiscono un substrato per la Rnasi H che taglia l ibrido e fornisce l OH al 3 per la replicazione del DNA. 18

19 La maturazione di RNA II è controllata da RNA I, trascritto sul filamento opposto della stessa regione di DNA e, quindi, complementare a RNA II. RNA I-RNA II compete con l appaiamento tra RNA II e il filamento stampo, riducendo la frequenza di inizio della replicazione. Il prodotto del gene rop stabilizza il complesso RNA I-RNA II, riducendo ulteriormente la frequenza di inizio. RNA II RNA I ori rop Replicazione del plasmide ColE1 RNA II is required for priming DNA synthesis at the origin. Positive regulation. RNA polimerasi P-II RNA II RNA I RNA I (108 b) P-I origin P-I & P-II: promotori RNA I è complementare alla regione terminale 5 di RNA II 19

20 Funzioni dell origine di replicazione Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l origine di replicazione oriv controlla: Il numero di copie Lo spettro d ospite I gruppi di incompatibilità SPETTRO D OSPITE Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di specie batteriche e si dicono a specificità d'ospite limitata : narrow host range Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche e si dicono a largo spettro d'ospite: broad host range, BHR I plasmidi BHR derivano questa loro proprietà dal possesso di funzioni per il riconoscimento dell' origine di replicazione, dipendono meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico Funzioni dell origine di replicazione GRUPPI DI INCOMPATIBILITA Plasmidi con la stessa origine di replicazione sono incompatibili tra Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l origine di replicazione oriv controlla: Il numero di copie La specificità d ospite I gruppi di incompatibilità loro. Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni. Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi verrà perso. Possono invece coesistere plasmidi con origine di replicazione diverse che appartengono a diversi gruppi di incompatibilità 20

21 INCOMPATIBILITA PLASMIDICA 21

22 MARCATORI SELEZIONABILI I plasmidi naturali a volte veicolano uno o più geni non essenziali capaci di conferire loro un vantaggio selettivo in alcune situazioni. Per es. possono codificare per tossine o resistenza agli antibiotici Plasmidi coniugativi e non coniugativi capacità di trasferire materiale genetico tra batteri mediante coniugazione Plasmidi coniugativi e non coniugativi plasmidi privi di queste funzioni geniche non sono trasmissibili Per essere coniugativo un plasmide deve possedere: Una specifica regione di riconoscimento chiamata Ori T (origine di trasferimento) I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus tra (trasferimento) una delle funzioni tra: sintesi del pilo coniugativo Tuttavia... 22

23 Plasmidi coniugativi e non coniugativi Distribution of conjugative, mobilizable, and nonconjugative plasmids according to plasmid size se un plasmide possiede un Ori T può essere trasferito per coniugazione utilizzando funzioni helper che forniscono, in trans, i prodotti genici mancanti Smillie C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74: Schematic view of the genetic constitution of transmissible plasmids. Escherichia coli S17-1 λpir è in grado di mobilizzare plasmidi non coniugativi in batteri Gram-negativi grazie all integrazione stabile nel proprio cromosoma dei geni codificanti per le funzioni di trasferimento derivate dal plasmide RP4 che agiscono sulla sequenza orit presente sui plasmidi mobilizzabili orit geni tra plasmide coniugazione MPF: mating pair formation T4CP: Type IV coupling proteins Ricevente Smillie C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74: