Diagnosi post mortem di tubercolosi nei bovini:

Transcript

1 Contributi pratici A. Dondo, S. Zoppi, M. Angelillo G. Buonincontro, A. Garrone S. Squadrone, A. Benedetto, M. Goria I.Z.S. del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta Diagnosi post mortem di tubercolosi nei bovini: esiti e considerazioni sul protocollo diagnostico applicato nel periodo in Piemonte Introduzione L infezione da Mycobacterium bovis, in passato importante causa di tubercolosi nell uomo e negli animali, è stata ampiamente controllata in Europa attraverso i programmi di eradicazione. Tuttavia tale infezione persiste tuttora in alcuni Stati Membri della Comunità Europea, con una prevalenza negli allevamenti variabile da Paese a Paese. L Italia con il Decreto Ministeriale n 592 del si prefiggeva l eradicazione della tubercolosi dagli allevamenti bovini e bufalini entro tre anni. Come noto le maggiori difficoltà si presentano proprio nelle fasi finali del processo di eradicazione per l individuazione delle fonti residue di infezione, spesso occulte o di difficile individuazione, e per discriminare le false positività alla prova intradermica dai casi in cui l infezione è realmente presente, soprattutto in relazione al proporzionale aumento dei soggetti falsi positivi, che inevitabilmente si accompagna alla riduzione della prevalenza della malattia. In Piemonte, con il D.P.G.R. n. 20 del 5/03/2001 si è dato il via al piano straordinario per l eradicazione della tubercolosi nelle province ancora prive di qualifica e i risultati conseguiti alla conclusione di tale piano sono stati sostanzialmente aderenti agli obiettivi del programma ed alle previsioni avanzate alla sua stesura. L utilizzo in parallelo della prova tubercolinica e del test del gamma interferone ha consentito di elevare il livello di sensibilità degli interventi diagnostici in vita accelerando l estinzione dei focolai ancora aperti e favorendo l individuazione di residue sacche occulte di infezione. In questo contesto la diagnosi post mortem dell infezione, eseguita mediante esame anatomo-patologico in fase di ispezione dei capi macellati, è importante che avvenga in modo accurato, ma soprattutto deve essere integrata da indagini di laboratorio che assicurino un compendio diagnostico di sicura efficacia per l individuazione e l identificazione dell agente eziologico responsabile della malattia. Quindi diventa fondamentale la presenza sul territorio di laboratori forniti di attrezzature adeguate e personale esperto in grado di eseguire, nei tempi richiesti e con affidabilità, le procedure di isolamento e di identificazione dei micobatteri responsabili di infezione tubercolare a partire da materiale patologico proveniente da diverse specie animali. Al fine di effettuare un continuo monitoraggio sul territorio e il coordinamento dei relativi interventi, è stata implementata la collaborazione con l Osservatorio Epidemiologico Veterinario Regionale. Il citato D.M. n 592, nell allegato 2, elenca le metodiche ufficialmente applicabili per evidenziare lesioni e micobatteri tubercolari da materiale patologico; in particolare, oltre alle tecniche microbiologiche classiche, tra queste vengono annoverate le tecniche anatomo-istopatologiche, l ibridazione in situ e la reazione a catena della polimerasi (PCR). Nel corso degli ultimi anni, per rispondere al meglio alle prescrizioni legislative dei decreti nazionali e regionali per l eradicazione della tubercolosi, uno degli obiettivi che i laboratori dell Istituto hanno inteso tenacemente perseguire, è stato quello di individuare ed affinare il protocollo diagnostico per la ricerca e l identificazione dell agente eziologico, adeguando allo scopo il livello di sicurezza dei laboratori preposti. Grazie a diversi progetti di ricerca nazionali e regionali e alle collaborazioni con partner internazionali, è stato possibile negli anni studiare, elaborare e perfezionare un protocollo diagnostico in linea con le prescrizioni legislative, sia nazionali che regionali, e conforme alle indicazioni tecnico-scientifiche dell O.I.E.. Tutto ciò al fine di garantire la massima sensibilità diagnostica nell individuazione e nell identificazione delle diverse specie di micobatteri, M. bovis in particolare, da materiali biologici di varia natura, spesso massivamente contaminati da flora microbica aspecifica. Il lavoro è stato quindi affrontato su diversi versanti: per quanto attiene agli aspetti prettamente diagnostici, gli obiettivi prevedevano, da un lato di affinare le metodiche convenzionali di isolamento, cercando di migliorare l efficacia delle tecniche di decontaminazione e selezionando i terreni colturali più sensibili, dall altro di sviluppare l approccio alle metodiche di biologia molecolare (sonde a DNA e PCR), applicate sia all individuazione dei micobatteri direttamente su campioni di materiale patologico, sia all identificazione e caratterizzazione dei ceppi isolati con le procedure convenzionali. Lo scopo del presente lavoro è pertanto quello di offrire una valutazione retrospettiva 351 AGOSTO

2 del protocollo diagnostico adottato presso i laboratori della Sede dell Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Piemonte, Liguria e Valle d Aosta ed effettuare un bilancio complessivo dell attività svolta per la diagnosi di tubercolosi, analizzando l operato nel quadriennio Il periodo di tempo preso in considerazione include anche le attività collegate al Piano straordinario per l eradicazione della tubercolosi bovina nelle province di Torino e Cuneo, che ha generato un ulteriore incremento dell attività diagnostica di routine, in quanto anche la prova del gamma interferone è stata riconosciuta come prova ufficiale per la diagnosi in vita di tubercolosi bovina, in linea con il Regolamento CE n del 08/07/02 e la Decisione 2002/943/CE del 28/11/02. Tab. n 1: campioni di organi esaminati durante gli anni presso l IZS di Torino Anno Totale Materiali e metodi Campionamento Dal 1 Gennaio 2001 al 30 Settembre 2004 sono stati esaminati 2566 campioni di organi (visceri e/o linfonodi) così ripartiti durante il quadriennio di attività come riportato in Tabella n 1. Al fine di standardizzare il più possibile il campionamento in sede di macello, è stata predisposta ad hoc una scheda di prelievo campioni. Figura n. 1 Selezione dei campioni di organi I campioni, come schematizzato in Figura n 1, provenivano da: animali con lesioni sospette segnalate in corso dell attività ispettiva in sede di macellazione; animali risultati positivi alle prove diagnostiche in vivo (prova tubercolinica o gamma IFN test), in cui non sono state riscontrate lesioni macroscopicamente visibili all esame anatomo-patologico a seguito dell abbattimento del capo; animali provenienti da allevamenti infetti macellati in seguito a provvedimento di abbattimento totale. La tipologia di campioni di organi differiva in relazione alla presenza o meno di lesioni sospette. In caso di lesione a carattere granulomatoso riferibile a tubercolosi, il campione era costituito dall organo sede di lesione (polmone, fegato o sierose e/o linfonodi annessi). Figura n. 2 linfoadenite e epatite tubercolare (complesso primario completo) In caso di organi provenienti da animali dichiarati infetti in vita che non presentavano lesioni macroscopicamente visibili, il campione era costituito da un pool di linfonodi (linfonodi della testa, mediastinici, epatici, meseraici, sopramammari) possibili bersaglio dell infezione tubercolare. Esame anatomo-patologico All arrivo in laboratorio, i campioni, prima di essere processati per l esame batteriologico, venivano ulteriormente controllati dal punto di vista anatomo-patologico e sulla base dell esito di tale controllo venivano classificati secondo il seguente criterio: GRUPPO A: campioni con lesioni di tipo granulomatoso riferibili a tubercolosi (Fig. n 2); GRUPPO B: campioni con assenza di lesioni macroscopicamente visibili (NVL); GRUPPO C: campioni con lesioni di tipo essudativo di presunta natura non specifica se riferita ad infezione tubercolare (Fig. n 3). Figura n. 3 epatite apostematosa a focolai Esame batteriologico In via preliminare i campioni sono stati accuratamente privati di tessuto adiposo e connettivale prima di procedere con le fasi successive per l esame colturale. Previo sminuzzamento, l omogeneizzazione dei campioni avveniva in Stomacher: l omogenato veniva suddiviso in due aliquote per essere sottoposto a due differenti metodi di decontaminazione: idrossido di sodio 2% e acido esadecilpiridinio 1,5% rispettivamente. Ciascuna aliquota decontaminata, dopo concentrazione in centrifuga, veniva seminata su una batteria di terreni selettivi che prevedeva: Stonebrink, Lowenstein Jensen Medium, Lowenstein Jensen w/o glicerina. AGOSTO 352

3 Figura n. 4 crescita di M. tuberculosis (A); M. bovis (B) e M. avium (C) su STONEBRINK L incubazione avveniva per i primi 15 giorni a 37 C in atmosfera modificata con l aggiunta di 5% CO2 e per il restante periodo a 37 C in atmosfera normale (Fig. n 4). Al fine di aumentare le probabilità di isolamento di micobatteri a lenta crescita, l esame batteriologico si considerava concluso a 90 giorni dalla semina. Tuttavia, a partire dall inizio dell anno 2004, sia per aderire alle linee guida del Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (O.I.E.) che per accelerare l estinzione o le procedure di bonifica dei focolai di tubercolosi bovina, si è ridotto a 60 giorni il tempo per la conclusione dell esame colturale. Diagnostica molecolare Heminested PCR in campioni di tessuto Dai campioni di tessuto, omogenati e decontaminati, il DNA è stato estratto utilizzando il kit QIAamp DNA Minikit (Qiagen). La procedura indicata dal produttore è stata opportunamente modificata per migliorare l efficacia estrattiva del metodo nei confronti dei micobatteri. Il DNA bersaglio dell amplificazione per il rilevamento dei micobatteri appartenenti al Mycobacterium tuberculosis complex è l elemento d inserzione IS6110. Il prodotto finale della heminested-pcr corrisponde ad un amplicone di 200 bp, che viene generato al termine di due fasi successive di amplificazione. L esito della reazione di amplificazione è stato rilevato mediante elettroforesi in gel d agarosio al 2% contenente Etidio Bromuro. Identificazione e tipizzazione molecolare dei ceppi isolati Il DNA delle colonie isolate mediante crescita su terreni selettivi è stato estratto tramite bollitura; per la tipizzazione e differenziazione delle diverse specie di micobatteri (Mycobacterium spp, M. tb complex, M. avium e M. tuberculosis) è stata messa a punto una Multiplex PCR, variazione in house dei metodi descritti da Kulski et al. (1995) e da Sinclair et al. (1995). Questo sistema Multiplex PCR si basa sulla simultanea amplificazione di differenti target molecolari: l rrna 16S, l elemento di inserzione IS986 e il gene mpt40. La distinzione delle differenti specie di micobatteri avviene sulla base del profilo elettroforetico generato dai prodotti di amplificazione. Le colonie che così sono state classificate come appartenenti a M. tb complex, cluster tassonomico in cui sono raggruppati diversi micobatteri tubercolari (M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. bovis, M. bovis BCG), sono state successivamente sottoposte a Spoligotyping, metodica solitamente usata per la caratterizzazione molecolare, e di cui si sfrutta la capacità di individuare i ceppi di M. bovis tra quelli classificati come M. tb complex. Il target genetico alla base del metodo, descritto da Kamerbek et al. (1995), è il locus DR, regione cromosomica contenente sequenze conservate e ripetute (Direct Repeat) di 36 bp, intervallate da sequenze non ripetute (spacer). La presenza o meno dei singoli spacer costituisce caratteristica descrittiva dell identità del microrganismo analizzato, oltre che dell assetto genico del locus bersaglio. Essa viene determinata mediante ibridazione con sonde molecolari specifiche. La metodica di amplificazione, seguita da ibridazione rilevata con tecnica ELISA (Ferretti et al, 1998), è stata modificata ed eseguita in forma ridotta relativamente al numero di spacer esaminati, in modo da adattare il metodo alla routine di laboratorio per l identificazione di M. bovis. Nella Figura n 5 è schematizzato il protocollo diagnostico adottato per la diagnosi di micobatteriosi. Figura n. 5 processazione di un campione per la ricerca di Mycobacterium spp.

4 Risultati La rappresentazione generale dei risultati ottenuti nell arco di tempo considerato, con l applicazione del protocollo diagnostico descritto, non può essere svincolata da un analisi approfondita che tenga conto di tutti quei parametri (anamnesi, clinica, epidemiologia, campionamento, metodologie diagnostiche, ecc.) che caratterizzano la diagnosi di tubercolosi sia in campo che in laboratorio. Sulla base dell esame anatomopatologico, i 2566 campioni sono stati così ripartiti nei tre gruppi: 645 compresi nel GRUPPO A, 1849 nel GRUPPO B e 72 nel GRUPPO C (Tab. n 2). Esprimendo i risultati nella loro totalità, senza elaborare alcuna correlazione tra il metodo microbiologico tradizionale e il metodo molecolare, su 2566 campioni, l esame batteriologico ha portato all isolamento di 842 ceppi di micobatteri (provenienti da 833 campioni, poiché si sono registrati 11 casi di infezione mista), di cui 730 sono stati identificati come M. bovis. La ricerca diretta di micobatteri appartenenti al M. tb complex condotta con tecnica di heminested-pcr, ha dato esito positivo in 674 campioni. Su 1506 campioni le prove Tab. n. 2 ripartizione dei campioni secondo il quadro anatopatologico diagnostiche post mortem (esame batteriologico ed esame molecolare con PCR) hanno contemporaneamente fornito esito negativo. In particolare dalla Tab. n 3, si può osservare che M. bovis è stato isolato da 592 campioni appartenenti al GRUPPO A (lesioni specifiche), 128 al GRUPPO B (no visible lesions) e 10 al GRUPPO C (lesioni non specifiche). M. avium è stato isolato su 18 campioni, di cui 3 appartenenti al GRUP- PO A, 15 appartenenti al GRUPPO B e nessuno nel gruppo C. Mycobacterium spp. è stato isolato da 95 campioni, di cui 11 appartenenti al GRUPPO A, 81 appartenenti al gruppo B e 3 al gruppo C. È da rilevare che in 11 casi è stata riscontrata una infezione mista, di cui un caso riguardava una coinfezione da M. bovis e M. avium (gruppo A) e in 8 casi si registrava l isolamento contemporaneo di M. bovis e di Mycobacterium spp. (4 in gruppo A e 4 in gruppo B). Tab. n. 3 isolamenti batteriologici ripartiti per gruppo a seconda dell esito dell esame anatomo-patologico AGOSTO 354

5 Nella Tab. n 4, sono stati confrontati i risultati ottenuti dall isolamento batteriologico con quelli ottenuti da tecniche di biologia molecolare (PCR). In 392 casi si è ottenuto un risultato concordante tra le due prove eseguite (esame batteriologico, PCR), nello specifico si tratta di 343 capi appartenenti al GRUPPO A, di 42 al GRUPPO B e di 7 al GRUPPO C. In 16 casi l amplificazione genica da tessuto ha rilevato la presenza di DNA specifico per micobatteri appartenenti a M. tb complex su campioni da cui è stato isolato Mycobacterium spp., di cui 3 appartenenti al GRUPPO A, 12 al GRUPPO B e 1 al GRUPPO C. Si segnala la positività alla PCR per M. tb complex da 1 campione appartenente al GRUP- PO B su cui è stato isolato esclusivamente M. avium. Infine, è interessante rilevare la positività alla PCR su 282 capi negativi all isolamento batteriologico, di cui 19 appartenenti al GRUPPO A, 213 appartenenti al GRUPPO B e 50 al GRUPPO C. Tab. n. 4 confronto fra isolamento batteriologico e PCR diretta da tessuto EB= esame colturale Discussione L attività descritta nel presente lavoro ben rappresenta la consistenza degli investimenti effettuati nel corso degli anni in termini di risorse umane, economiche e strutturali finalizzati alla diagnostica della tubercolosi nella attività ordinaria e nella ricerca scientifica applicata. Nella valutazione dei dati presentati in questo lavoro risulta importante, in particolare, analizzare la discordanza degli esiti tra diagnosi batteriologica e diagnosi molecolare nelle differenti tipologie di campioni, così come suddivisi nei tre gruppi (A, B, e C) in base alla presenza o meno delle lesioni e alla loro natura. I due metodi hanno registrato performance differenti e ciò è riconducibile alla natura dei campioni tissutali di partenza, nonché alle caratteristiche intrinseche delle due metodiche, che pur partendo dallo stesso campio- ne seguono uno sviluppo differente. Nel gruppo A, campioni con riscontro di lesioni tipiche, in caso di esito positivo all esame PCR (tab. 4.1) la maggior parte dei campioni ha avuto esito concordante con l esame batteriologico, e, in alcuni casi, la diagnosi molecolare ha confermato la presenza dell infezione non altrimenti registrata con l esame batteriologico. Questi casi interessano una percentuale pressoché costante negli anni con un andamento progressivamente migliore, direttamente correlato al progressivo affinamento tecnico della metodologia molecolare applicata (circa 2% negli anni , circa 6% negli anni ): ciò è anche dimostrato dalla costanza con la quale tutti i dati della casistica presentata confermano il trend positivo dei risultati lungo il periodo di tempo considerato. Relativamente ai campioni del gruppo A che hanno avuto esito negativo alle indagini molecolari (tab. 4.4), va rilevato che nella maggior parte di essi l esito era discordante con quello ottenuto con l esame batteriologico, ovvero l esame PCR forniva esiti falsamente negativi quando la presenza dell infezione era confermata sia dal riscontro di lesioni tipiche che dall isolamento di M. bovis da questi campioni. Nella maggioranza di questi campioni va tuttavia considerato che le lesioni riscontrate erano di natura calcifica (dati non mostrati) a cui potrebbe essere associata una presenza più consistente di sostanze chimicamente interferenti, che possono inibire la reazione polimerasica. La rimozione poco efficiente di tali sostanze ad opera dei sistemi di purificazione utilizzati durante le analisi, potrebbe spiegare l apparente minore sensibilità riscontrata nel confronto diretto del metodo molecolare con l e- 355 AGOSTO

6 same colturale. Viceversa, nei campioni NVL (gruppo B), in cui le lesioni non sono morfologicamente rilevanti e presumibilmente sono connotati da una carica microbica minore, oltre che da una ridotta concentrazione di sostanze che possono generare inibizione della reazione polimerasica, la PCR sembra mostrare una maggiore sensibilità (tab 4.2). Tale riscontro si è manifestato sin dai primi anni di applicazione del metodo ( ), con un andamento progressivamente migliore, confermando quanto sopra considerato. Analoghi risultati sono stati registrati anche per i campioni inseriti nel gruppo C (lesioni non tipiche- tab. 4.3 e 4.6). Tuttavia la migliore sensibilità delle tecniche molecolari per la ricerca diretta di DNA appartenente a micobatteri tb complex in campioni tissutali deve essere confermata con una valutazione più estesa, che tenga conto delle caratteristiche sanitarie dell allevamento, nonché degli animali, relativamente alla presenza dell infezione tubercolare (anamnesi storica, dati epidemiologici, prove diagnostiche in vita). Queste valutazioni attualmente sono ancora in corso. Relativamente alle valutazioni sulla specificità delle indagini molecolari, queste sono state condotte dal punto di vista teorico: la heminested-pcr è stata messa a punto su un target molecolare estremamente specifico ed esclusivo dei micobatteri appartenenti al tb complex, che è stato verificato attraverso prove di allineamento dei primers e della sequenza tra essi compresa su microrganismi tassonomicamente correlati. Per questa ragione, la specificità analitica della prova può essere considerata estremamente elevata. Nella valutazione complessiva dei dati presentati in tab. 4, alcune considerazioni meritano ancora attenzione. Nei quattro anni di attività presentati, su 645 campioni con lesioni specifiche, 34 non hanno avuto una conferma dell infezione da entrambi i metodi d indagine di laboratorio (circa 5,2%, tab. 4.1 e 4.4). Inoltre, sui campioni negativi al riscontro di lesioni riconducibili a tubercolosi (gruppi B e C), considerando le due metodiche in modo indipendente, il 7,2% è risultato positivo all esame batteriologico e il 16,2% alla heminested-pcr e questo dato sale al 20,9% se i due metodi di conferma post mortem sono associati in parallelo. Lo studio preliminare di questi risultati sembra avvalorare quindi l utilizzo combinato delle due metodiche, che permette di aumentare significativamente la sensibilità del protocollo diagnostico applicato. La necessità di maggiore sensibilità diagnostica è infatti un elemento cruciale per raggiungere l eradicazione, molto più ardua da conseguire proprio nelle fasi finali, in cui i tassi d infezione sono estremamente ridotti. L attività diagnostica applicata alla tubercolosi descritta nel presente lavoro, intesa nella sua globalità, non solo ha permesso di acquisire dati ed esperienza, ma ha reso possibile la creazione di infrastrutture, quali una vasta ceppoteca e un database specifico che oltre alla registrazione dei dati epidemiologici classici, consente anche la gestione di informazioni epidemiologico-molecolari. Tutto ciò potrà consentire ulteriori approfondimenti anche su base retrospettica, utili al trasferimento delle conoscenze scientifiche nella attività pratica, con ricaduta diretta del servizio reso nella Sanità Pubblica regionale e nazionale. Riconoscimenti Il presente lavoro è stato in parte reso possibile grazie ai finanziamenti per la ricerca sanitaria e il progresso scientifico del Ministero della Salute, della Regione Piemonte e della Comunità Europea. La bibliografia è disponibile presso gli autori