Protocollo analitico

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1 LIFE Project Number LIFE03 ENV/IT/323 - FALL Protocollo analitico Determinazione di fibre di amianto in percolati di discarica Scritto da Luca Zamengo* e Sergio Malinconico** Revisionato da Stefano Polizzi* e Federica Paglietti** *Università Ca Foscari di Venezia **ISPESL Venezia, 10/7/2007

2 INDICE pag. 1. SCOPO E APPLICAZIONE 3 2. STRUTTURA 3 3. DEFINIZIONI E ABBREVIAZIONI 4 4. CAMPIONAMENTO Materiale necessario al campionamento Modalità di campionamento Conservazione dei campioni 6 5. PRETRATTAMENTO 7 6. PROCEDURE DI ANALISI Sensibilità analitica e volume di filtrazione Analisi SEM Filtrazione Coating Osservazione Conteggio Filtri bianchi Analisi TEM Creazione della replica Dissoluzione della membrana Estrazione della replica Osservazione Conteggio Filtri bianchi Scheda tecnica: approccio statistico Analisi MOCF Preparazione del campione (vetrini) Campi microscopici da esaminare Criteri di conteggio DIR CEE 83/ Calcolo della concentrazione Conteggio Limite di rilevabilità Filtri bianchi CONCLUSIONI APPENDICI Schema per la registrazione dati Immagini 31 2

3 1. SCOPO E APPLICAZIONE Il metodo qui proposto è stato elaborato al fine di quantificare il contenuto di fibre di amianto presenti in percolati di discarica ed in generale in liquidi che presentano un alto contenuto di materiale organico interferente come effluenti, acque residue, fanghi liquidi, ed altri. Attualmente non esistono metodi approvati per la determinazione delle fibre di amianto in simili liquidi ed è consuetudine eseguire queste analisi modificando o rielaborando le metodiche ufficiali valide per le misurazioni in campioni di acqua destinata all uso domestico. In questo documento sono esposte metodiche e procedure per condurre analisi con tecniche di microscopia elettronica a scansione SEM, microscopia elettronica in trasmissione TEM e microscopia ottica a contrasto di fase MOCF. Il metodo permette di valutare la concentrazione numerica delle fibre di amianto standard (vedi 3) e quelle di dimensioni inferiori, la loro identificazione minerale e di evidenziare e quantificare ulteriori fibre asbestiformi. Le dimensioni minime delle fibre di amianto riconoscibili variano in funzione sia della tecnica adottata e della relativa sensibilità analitica sia della quantità di materiale interferente organico ed inorganico presente nel campione da analizzare. 2. STRUTTURA Il protocollo descrive inizialmente il processo di campionamento adottato per la discarica di Barricalla (TO) e le procedure per la conservazione dei campioni. Successivamente si descrive il processo di pre-trattamento di digestione acida sotto irraggiamento di microonde, utilizzato al fine di diminuire l interferenza proveniente dalle sostanze organiche presenti nei campioni di percolato grezzo. Una terza parte è dedicata alla descrizione del metodo di preparazione delle membrane utilizzate come supporto per le fibre da osservare. Da ultimo sono descritte le procedure di misura specifiche per le tre tecniche analitiche utilizzate per quantificare e classificare mineralogicamente le fibre di amianto. Un capitolo conclusivo discute alcune indicazioni sui limiti di applicazione delle tre tecniche, emerse durante i due anni di analisi effettuate sui percolati della discarica Barricalla nell ambito del Progetto LIFE-FALL 3

4 3. DEFINIZIONI E ABBREVIAZIONI Aggregato di fibre: insieme di fibre orientate casualmente. Amianto o asbesto: termine commerciale applicato ad un gruppo di silicati idrati che tendono a separarsi in sottili fibre, flessibili e resistenti a trazione e al calore, chimicamente inerti. Anfiboli: gruppo di silicati ferro-magnesiaci di struttura cristallina con caratteristica sfaldatura secondo due facce prismatiche e di formula generale: A2,3B5(Si, Al)8O22(OH)2 dove A=Mg, Fe2+, Ca, Na o K e B =Mg, Fe2+, Fe3+, o Al. Alcuni di questi elementi possono essere sostitutiti da Mn, Cr, Li, Ti, Pb, o Zn. Gli anfiboli sono caratterizzati da struttura a tetraedri a catena doppia con rapporto Si:O pari a 4:11. Campo: porzione di superficie osservata ad un certo ingrandimento tramite tecniche di microscopia Crisotilo: minerale fibroso del gruppo dei serpentini: Mg3Si2O5(OH)4. Costituisce il più diffuso ed importante tipo di amianto per uso industriale e commerciale. EDS: Energy Dispersive Spectrum - misura delle energie e delle intensità di raggi X caratteristici mediante un rivelatore a stato solido ed un analizzatore multicanale. Fascio di fibre: fibra composta da più fibre parallele con diametro inferiore unite longitudinalmente. Fibra standard:, particella con lunghezza superiore a 5 µm e diametro inferiore a 3 µm e con rapporto dimensionale lunghezza/diametro 3:1 (normativa italiana D.Lgs 277/91) Fibrilla: una singola fibra, di dimensioni inferiori a quelle standard, che non può essere separata in componenti più piccole senza perdere l apparenza e le proprietà fibrose. MFL: milioni di fibre per litro. Rapporto dimensionale: il rapporto lunghezza /diametro di una fibra. Replica: procedura nella preparazione del campione TEM con la quale si produce una sostanziale copia sottile (replica) di una superficie. SAED: Selected Area Electron Diffraction - tecnica in microscopia elettronica con la quale si studia la configurazione cristallina di una piccola area di campione. Sensibilità analitica: concentrazione calcolata in MFL equivalente al conteggio di una fibra sulla superficie di campione analizzata. Questo fattore dipende dalla quantità di liquido filtrata e dalla dimensione della superficie di membrana osservata. 4

5 4. CAMPIONAMENTO Il campionamento viene effettuato per ogni singola cella, tramite un rubinetto appositamente predisposto, posizionato nel primo tratto di tubatura disponibile subito dopo l uscita del tubo di convogliamento dall invaso stesso. La scelta di posizionare il punto di prelievo così vicino alla sorgente è stata fatta in quanto è necessario ridurre il più possibile il tempo di contatto del percolato con l aria presente all interno delle tubazioni. Infatti la presenza di aria produce un inversione del potenziale redox (che all interno del corpo della discarica è negativo) verso valori positivi. Questa inversione, dovuta al contatto con l ossigeno presente nell aria, induce delle reazioni di precipitazione e co-precipitazione di sali che si depositano quindi all interno delle tubazioni stesse. Nel nostro caso la presenza di fenomeni di precipitazioni di sali, diretti od indotti, va evitata al massimo in quanto in questa fase è molto probabile, date le dimensioni ridotte delle fibre, che durante la precipitazione vengano inglobate anche delle fibre di amianto e che quindi si perda una parte non quantizzabile delle informazioni Materiale necessario per il campionamento - Contenitori in PE da 500 ml a collo largo con contro tappo - Contenitore (secchio) in PE della capacità di almeno 10 lt. - Acido nitrico concentrato - Pipetta graduata in PE - Guanti in lattice monouso - Maschera facciale con caratteristiche di conformità alla norma EN 149:2001 FFP3 - Occhiali - Etichette adesive - Carta - Contenitore per rifiuti opportunamente etichettato 4.2. Modalità di campionamento 1) Verificare che tutto il materiale sia ben pulito. 2) Attivare l alimentazione elettrica dell elettropompa ed aspettare che questa funzioni a regime (circa 10 minuti dall accensione). Il funzionamento a regime si individua da una diminuzione del rumore della pompa stessa e dal fatto che si sente fluire in pressione il percolato all interno della tubatura di mandata. 3) Aprire con accortezza il rubinetto di campionamento e lasciar fluire nel contenitore da 10 lt evitando il più possibile la formazione di turbolenze. 4) Chiudere il rubinetto Dopo aver ulteriormente omogeneizzato il liquido in modo da impedire eventuali fenomeni di sedimentazione effettuare il campionamento e riempire i due contenitori fino all apposita tacca 5

6 5) Aggiungere 2ml di acido concentrato per ogni contenitore, eventualmente aspettare qualche istante fino alla fine dello sviluppo di effervescenza (causato dalla eventuale presenza di carbonati) 6) Richiudere i contenitori verificando tramite capovolgimento che il controtappo faccia bene tenuta 7) Pulire con cura i contenitori ed etichettarli. Le etichette devono riportare almeno le seguenti informazioni: - data del prelievo - ora del prelievo - lotto della discarica - numero della cella - firma dell operatore 4.3. Conservazione dei campioni Per quanto concerne la conservazione di campioni, da sottoporre a successive analisi per la ricerca delle fibre di amianto, non sono stati tabulati metodi ufficiali riconosciuti, relativamente a matrici complesse quali i percolati, per cui abbiamo previsto di associare due tipi di conservazione: - l aggiunta di un acido concentrato, quale l acido nitrico, permette in parte di impedire eventuali fenomeni di precipitazione da parte di elementi metallici - la conservazione in ambiente refrigerato a 4 C impedisce l eventuale sviluppo di gas dovuti ad attività di tipo metabolico-batterico (nel percolato sono stati comunque individuati batteri solfato riduttori e muffe) I campioni dovranno comunque essere trasportati nel più breve tempo possibile in un frigorifero con temperatura di circa 4 C. Per maggior sicurezza il controcampione che verrà tenuto in archivio sarà ulteriormente chiuso in un sacchetto di PE morbida. 6

7 5. PRETRATTAMENTO Per il riconoscimento e il conteggio delle fibre di amianto in percolati attraverso analisi in microscopia ottica o elettronica è necessario operare un pre-trattamento dei campioni per ridurre l interferenza dovuta al carico organico presente nei liquidi. Le fibre di amianto presentano particolare affinità con le sostanze organiche disperse nel liquido e senza adottare un pretrattamento dei campioni è possibile incorrere in frequenti errori determinati dai seguenti fenomeni: - Le fibre di amianto tendono ad aggregarsi con le sostanze organiche. - Le fibre di amianto associate alle sostanze organiche tendono ad aderire alle pareti dei contenitori. - Le fibre inglobate da sostanze organiche vengono nascoste durante l osservazione SEM. - Le fibre inglobate da sostanze organiche non si trasferiscono alla replica TEM. Come pre-trattamento è stata adottata la digestione acida sotto irraggiamento di microonde che presenta il vantaggio, rispetto ad altri tipi di ossidazione con metodi termici tradizionali, di operare direttamente sul campione liquido e limitare sensibilmente i tempi di reazione. È stato verificato che tale trattamento non danneggia le fibre di amianto mediante analisi di un campione di crisotilo puro. I percolati campionati provengono da celle di differente età, coltivate con rifiuti di diversa tipologia e provenienza e possiedono di conseguenza differenti caratteristiche quali/quantitative. La difficoltà di ottenere un unico procedimento utile alla digestione di percolati con differenti caratteristiche quali/quantitative è intrinseca alle proprietà, variabili e dipendenti da molteplici fattori, del percolato stesso (ad es. frequenza e intensità delle precipitazioni, età della cella coltivata, tipo di rifiuto smaltito, grado di avanzamento della stabilizzazione). Utilizzando la stazione di lavoro a microonde MARS5 CEM è stata definita una procedura standard per il pre-trattamento di campioni di percolato con COD inferiore a una certa soglia (2000 mg/l di O 2 ) e sono state identificate possibili procedure alternative per campioni con COD maggiore. Inoltre, per i campioni MOCF è stato suggerito un trattamento alternativo nel caso le membrane risultassero danneggiate dalla soluzione acida. La stazione a microonde impiegata si avvale di un set di 14 vessel in Teflon PFA ciascuno di volume 100 ml predisposti all attività in pressione. Ogni vessel è munito di una valvola di sicurezza per lo sfiato ed il rilascio della pressione (nel caso venga superata, durante la reazione, la soglia massima prestabilita). È possibile monitorare in tempo reale gli andamenti di pressione e temperatura tramite due rivelatori collegati ad un vessel-campione dotato di opportuni dispositivi ed ottenere grafici e dati relativi al processo in esame come in Figura 1. Non è possibile definire delle condizioni operative standard per liquidi contenenti quantità incognite e variabili di inquinanti organici, ma in genere è necessario condurre delle misurazioni preliminari con crescenti aliquote di percolato e reagenti, monitorando i parametri di reazione e valutando la colorazione del liquido risultante. Sperimentalmente si è potuto verificare come anche una flebile colorazione del liquido risultante (solitamente giallastra e corrispondente ad una digestione non completamente avvenuta) comprometta la successiva analisi microscopica. 7

8 E quindi necessario stabilire le condizioni di reazione per massimizzare la conversione in CO 2 della frazione organica presente nel liquido e favorire il completamento della digestione ottenendo un liquido trattato pressoché incolore. Tale conversione, che contribuisce all innalzamento della pressione interna al vessel, deve però essere mantenuta in regimi tali da consentire la conservazione e l integrità della valvola di sicurezza che, nei vessel utilizzati, è fissata ad una pressione di rottura di 250 psi, corrispondente a circa 17atm. La rottura della valvola causa la fuoriuscita del gas di reazione e l impossibilità del completamento della digestione. E necessario quindi dosare il volume di percolato per vessel in funzione del carico organico da trattare e quindi della pressione massima raggiungibile senza rottura della valvola di sicurezza. È necessario inoltre conoscere preventivamente i limiti di temperatura ammissibili per il materiale costituente il vessel per evitare fenomeni di termodegradazione da surriscaldamento. La procedura standard definita per il pre-trattamento di campioni di percolato con COD inferiore a mg/l di O 2 prevede per ogni turno di trattamento in successione: 1. Sonicazione del campione di percolato grezzo per 15 min (vedi nota 1). 2. Prelievo delle aliquote necessarie al caricamento dei vessels. 3. Caricamento vessels ed aggiunta dei reagenti. 4. Chiusura e bloccaggio dei vessels con pinza dinamometrica. 5. Predisposizione ed assegnazione numerica dei vessels su piatto rotante. 6. Alloggiamento nella camera del digestore del piatto rotante. 7. Connessione di un vessel campione ai rivelatori di pressione e temperatura. 8. Controllo della libera rotazione del piatto rotante. 9. Impostazione del programma di trattamento. 10. Avvio del programma di trattamento. 11. Controllo parametri T e P durante lo svolgimento della digestione. 12. Raffreddamento a programma completato fino a ca. 30 C. 13. Estrazione e sonicazione dei vessels ancora chiusi per 15 min. 14. Apertura delle valvole di rilascio sotto cappa. 15. Apertura e sblocco dei vessels. In Tab.1 sono esposte le condizioni operative programmabili sullo strumento e adottate per la digestione completa dei percolati campionati. Percolato/vessel (ml) 25 H 2 SO 4 conc. /vessel (ml) 0.5 H 2 O 2 35% /vessel (ml) 4 Max vessel/turno (N ) 14 Percolato/turno (Max ml) 350 Temp. rampa I (C ) 90 Temp. rampa II (C ) 160 Pressione max rampa I(psi) 80 Pressione max rampa II(psi) 250 Potenza rampa I (W - %) % Potenza rampa II (W-%) (vedi nota 4 a fine pagina) % Mantenimento a 90 (min) 1 Mantenimento a 160 (min) 1 Tot irraggiamento (min) 22 Raffreddamento (min) 15 Tab.1 Condizioni operative adottate per la digestione dei percolati campionati alla discarica di Barricalla (TO). 8

9 Dal grafico presentato come esempio in Fig.1 si vede che la digestione completa di 25 ml di percolato secondo le condizioni esposte in Tab.1, sviluppi, ad una temperatura di 160 C, una pressione di ca. 200 psi (13.6atm) rientrando così nei limiti di sicurezza definiti dalla strumentazione impiegata. PSI C Time (MIN) Figura 1. Andamento della pressione e temperatura durante l irraggiamento di microonde. Lo svolgersi della reazione di digestione del percolato e costantemente monitorata in tempo reale. Al termine del pre-trattamento il liquido, dopo essersi raffreddato, è filtrato per deposizione su membrana per la successiva analisi in microscopia. Si sono, tuttavia, presentati dei casi in cui il metodo per il pre-trattamento dei campioni di percolato grezzo, deve necessariamente essere modificato per una corretta mineralizzazione. I motivi più probabili che possono richiedere una modifica sono: a) il carico organico del percolato è tropo alto. b) la membrana in estere misto di cellulosa, usata per le analisi MOCF, risulta degradata superficialmente dopo la filtrazione. Nel primo caso è consigliabile ridurre il volume di percolato in ciascun vessel per turno di trattamento (fino ad un minimo di 10 ml). In questo modo senza aumentare le quantità di reagenti si può ottenere una più completa mineralizzazione del campione. È altresì consigliabile per simili campioni, verificare che le membrane, dopo la filtrazione, non siano ugualmente cariche di interferenti inorganici che andrebbero a ostacolare l osservazione delle fibre di amianto. Per questi percolati è sempre consigliabile filtrare minori quantità di campione, ricercando il compromesso migliore con la sensibilità analitica. Nel secondo caso, l acidità della soluzione può influire sulla membrana in estere misto di cellulosa, degradando parte della superficie ed eliminando la quadrettatura stampata utile per l osservazione MOCF (vedi foto a fine paragrafo). In questo caso è preferibile la sostituzione dell acido solforico impiegato per la mineralizzazione con miscele meno aggressive di acido nitrico-cloridrico; 9

10 Per questi motivi sono stati definiti due metodi alternativi specifici per i percolati dei due lotti campionati, lotto 3 (COD inferiore ai mg/l) e lotto 2 (COD superiore) e in funzione del tipo di tecnica microscopica che sarà adottata per le analisi. Questi metodi prevedono l utilizzo di una miscela reagente alternativa all acido solforico e delle quantità di percolato adeguate al carico organico iniziale del liquido. Tali metodi sono riassunti nelle tabelle seguenti: MOCF Lotto 2 Lotto 3 10 ml percolato 25 ml percolato 2 ml HNO 3 (20%) 2.5 ml HNO 3 (10%) 1.2 ml HCl (12%) 2 ml H 2 O 2 (6%) SEM/TEM Lotto 2 Lotto 3 10 ml percolato 25 ml percolato 1.5 ml HNO 3 (15%) 2.5 ml HNO 3 (10%) 1 ml H2O 2 (10%) 2 ml H 2 O 2 (8%) 1 ml HCl (10%) 1.5 ml HCl (6%) Le percentuali tra parentesi rappresentano in rapporto volumetrico con il percolato utilizzato. L HNO 3 è diluito al 20%, H 2 O 2 al 35%. Immagini rappresentative della degradazione subita dalle membrane in EMC (adottate per le analisi MOCF) a seguito dell impiego di acido solforico per il pre-trattamento dei campioni. 10

11 6. PROCEDURE DI ANALISI Le tre tecniche analitiche prevedono le seguenti fasi primarie in comune: a) Campionamento b) Conservazione c) Pretrattamento Le metodiche di Campionamento e Conservazione sono descritte nel 4. La metodica di Pre-trattamento del campione di percolato grezzo è descritta nel 5. Successivamente, in funzione della tecnica utilizzata, si adotteranno diverse procedure per la: d) Filtrazione e) Preparazione f) Osservazione g) Conteggio In appendice 8.1 è riportato uno schema proposto per la registrazione dei conteggi. Note alle procedure 1) Molti edifici e strutture contengono amianto o altri materiali fibrosi che possono interferire con le analisi. E di primaria importanza che tutte le fasi di preparazione siano eseguite in un ambiente dove la contaminazione del campione sia minimizzata. L area destinata alla preparativa dei campioni deve essere separata da fonti potenzialmente contaminanti come pavimentazioni, soffitti, coibentazioni e materiali di varia natura contenenti amianto. Sarà necessario inoltre predisporre set di filtri bianchi da sottoporre alle stesse procedure di quelli adoperati per la filtrazione del percolato. Su tali bianchi saranno effettuate letture in microscopia che forniranno il valore del fondo ambientale. 2) Si è scelto di analizzare sia alla MOCF che al SEM per ogni campione, 1 mm 2 di superficie delle membrane sopra menzionate, prendendo come riferimento il valore indicato nel D.M. italiano 6/9/1994 per l analisi al SEM di filtri provenienti dal campionamento di particolato aerodisperso in quanto unico riferimento disponibile Sensibilità analitica e volume di filtrazione La preparazione delle membrane da osservare tramite tecniche di microscopia è un punto critico delle procedure. L obiettivo è quello di produrre un filtro sul quale sia distribuito uniformemente il particolato presente nel liquido minimizzando la sovrapposizione di particelle. Come primo passaggio si effettuerà l omogeneizzazione del campione di liquido da filtrare (già sottoposto a digestione acida con microonde) tramite sonicazione, ovvero l'azione controllata di onde ultrasoniche ad alta intensità. Tale processo produce nei liquidi il fenomeno della cavitazione, ossia la formazione durante la fase di pressione negativa di milioni di piccole bolle che, in una delle successive fasi di compressione, implodono con un drastico e improvviso cambiamento della temperatura e della pressione nella zona interessata. Andranno quindi evitati fenomeni di cavitazione intensi per non giungere alla rottura e quindi alla comminuzione delle fibre minerali presenti nel liquido. Il liquido, dopo una sonicazione della durata di 15 minuti viene sottoposto a filtrazione. 11

12 Il volume che deve essere filtrato dipende dal diametro del sistema filtrante utilizzato, dal contenuto dei solidi sospesi del liquido in esame ed in alcuni casi dalla concentrazione di fibre nel liquido. Dalla pratica si deduce che il parametro limitante è usualmente il contenuto di solidi sospesi prevalentemente di natura organica. La tabella 2 mostra le limitazioni della sensibilità analitica in funzione del volume di liquido filtrato applicabili durante osservazioni di superfici pari 1mm². In generale è stato osservato, nel corso di numerosi tests di prova, che anche la più pallida colorazione assunta dalla superficie del filtro è indice di eccessivo deposito. Non è possibile assicurare che la filtrazione di volumi inferiori a 50 ml per filtri da 47 mm o 10 ml per filtri da 25 mm porti all uniforme deposizione di particolato sulla superficie; si è pertanto stabilito di usare volumi superiori a questi o di procedere con diluizioni con acqua distillata. Volume filtrato (ml) su filtri da 47 mm** di diametro Sensibilità analitica* (ff/litro) Volume filtrato (ml) su filtri da 25 mm** di diametro ml Sensibilità analitica* (ff/litro) , , , , , , , , , , , ,00 Tab.2 Limitazioni della sensibilità analitica in funzione del volume di liquido filtrato. *Concentrazione corrispondente all osservazione di una fibra su un area di 1 mm². ** Assumendo che l area effettiva di filtrazione con l apparecchiatura impiegata sia 199 mm² per filtri da 25mm di diametro e 1134 mm² per filtri da 47 mm di diametro (l area effettiva di filtrazione è il risultato della differenza tra l area totale dei filtri e l area di una corona circolare esterna di larghezza di circa 4,5 mm occupata dall apparecchiatura stessa) Analisi SEM L analisi in Microscopia Elettronica a Scansione (SEM) permette il riconoscimento morfologico delle fibre di amianto e la loro classificazione mineralogica mediante l elaborazione di Spettri a Dispersione di Energia EDS. Il SEM consente inoltre di definire con grande precisione le dimensioni delle fibre stesse (vedi esempi in Appendice 8.2), classificandole come standard, qualora abbiano lunghezza > 5 μm e larghezza < 3 μm, o come micronizzate, qualora abbiano dimensioni inferiori. In quest ultimo caso non è garantito l esito dell analisi EDS in quanto il diametro minimo del raggio incidente potrebbe superare il diametro della fibra che si sta cercando di classificare e conseguentemente l analisi mineralogica resta dubbia. La procedura messa a punto è di seguito riportata Filtrazione a. Omogeneizzare il campione tramite sonicazione. b. Filtrare per deposizione, su membrana in policarbonato da 0.45 µm, il volume scelto di percolato pre-trattato ( 5.1). 12

13 c. Risciacquare tutti i contenitori e i materiali utilizzati con acqua distillata e filtrare sulla stessa membrana anche l acqua di lavaggio. d. Rimuovere accuratamente la membrana e riporla su di un vetrino portaoggetti. e. Posizionarla, numerandola in essiccatore per un tempo di 3 ore. f. Rimuovere la membrana dall essiccatore, ritagliarne una porzione (ca. 1cm²) e fissarla su portacampioni SEM. Per lo sviluppo del seguente protocollo si è utilizzato: - Sistema filtrante multiuso Nalgene a membrane sostituibili (volume utile 150 ml) - Membrane Millipore in policarbonato (diametro 47mm, porosità 0.45 µm) Coating Depositare uno strato sottile, compreso generalmente tra 5 e 30 nm, di materiale conduttivo (ad es. oro o grafite) tramite sputtering sulla superficie della membrana per evitare fenomeni di caricamento durante l osservazione SEM. Per lo sviluppo del seguente protocollo si è utilizzato: - Sputter Coater SC7620 Polaron - Target: Au - Gas ionizzato: Argon - Pressione: 6x10-2 mbar - Voltaggio applicato: 1kV - Corrente: 15 ma - Tempo di sputtering: 15 sec Osservazione Eseguire l osservazione di un numero campi a 2000X corrispondenti a 1 mm² di area superficiale. Fare attenzione a non esaminare più volte lo stesso campo. Per lo sviluppo del seguente protocollo si è utilizzato: - Microscopio elettronico JEOL JSM 5600LV con microanalisi EDS - Software interfaccia Link ISIS - Osservazioni condotte a 20KV - N di campi osservati: Area di un campo: 63.7 x 47.5 μ m² = 3025 x10-12 m² - Area totale osservata: 1 mm² Conteggio Le fibre sono conteggiate a seconda di come si presentano, ad esempio: secondo le immagini relative alla Fig. 2b), cioè presenti come una o più fibre che si dipartono da uno stelo comune, devono essere conteggiate singolarmente 13

14 quando soddisfano le dimensioni geometriche date per definizione (L > 5 μm, D < 3 μm e rapporto L/D > 3 μm,); secondo le immagini della Fig. 2c), vanno contate individualmente quando semplicemente intersecate, non lette invece quando presenti in un groviglio irregolare; secondo le immagini di Fig. 2d), in cui si osservano a contatto con un estremità o sovrapposte a materiale particolato. In quest ultimo caso vi è difficoltà nel conteggiarle. Nelle figure 2a), 2b), 2c) e 2d) è riportato, nell angolo in basso a destra di ogni quadrante, il valore di conteggio da attribuire all immagine esemplificativa proposta. La stima della lunghezza delle fibre viene riferita alla curvatura della fibra stessa (cioè alla lunghezza reale) e secondo i dettami generali di conteggio, contenuti al punto 10 dell all. 5 al D.Lgs 277/91. Per il calcolo della concentrazione delle fibre, C, si è utilizzata la formula: C = ( n π d 2 ) / (4 NAV) [fibre/ m 3 ]. dove: - n è il numero di fibre conteggiate sulla porzione del filtro esaminata - N è il numero dei campi osservati per ricoprire l area di 1 mm² a 2000 ingrandimenti - d è il diametro effettivo della membrana in metri - A è l area di un campo a 2000x, in m² - V è il volume di liquido filtrato, in m³ Filtri bianchi Al fine di verificare la non contaminazione dei filtri bianchi, si effettuerà la letture degli stessi, uno ogni 25 filtri usati o, in alternativa uno per ogni set. Il numero di fibre ivi riscontrate, in un numero di campi pari a quello esaminato per i campioni di percolato, non potrà essere superiore a 4; in caso contrario occorrerà scartare l'intero set di filtri al fine di non inficiare la corretta valutazione del numero di fibre effettivamente presenti sul filtro. I filtri bianchi dovranno essere esposti all aria, in laboratorio, nel luogo ove si esegue il filtraggio, per un intero turno lavorativo (8 ore). Note: 1)Le fibre di amianto sulle membrane, durante l analisi in microscopia elettronica, possono presentarsi sotto vari aspetti: a) fibre singole; b) fibre divise; c) fibre raggruppate; d) fibre con altre particelle. Le fibre sono conteggiate a seconda di come si presentano: Nelle figure 2a), 2b),2c) e 2d) è riportato, nell angolo in basso a destra di ogni quadrante, il valore di conteggio da attribuire all immagine esemplificativa proposta. La stima della lunghezza delle fibre viene riferita alla curvatura della fibra stessa (cioè alla lunghezza reale) e secondo i dettami generali di conteggio vengono considerate le fibre quando soddisfano le dimensioni geometriche date per definizione (L > 5 μm, D < 3 μm e rapporto L/D > 3,) DLgs 277/91; 2)Al fine di una più completa ed esauriente valutazione delle analisi è opportuno considerare anche le fibre che: presentano un diametro <1µm e non si rende possibile il riconoscimento tramite analisi EDS nel qual caso verranno catalogate come fibre sospette presentano una lunghezza inferiore a 5 µm ma mantengono il rapporto dimensionale 3:1. nel qual caso verranno catalogate come fibrille e fibrille sospette. 14

15 Fig. 2a)Rappresentazione esemplificativa di fibre singole Fig.2b)Rappresentazione esemplificativa di fibre divise 15

16 Fig. 2c) Rappresentazione esemplificativa di fibre raggruppate Fig. 2d)Rappresentazione esemplificativa di fibre con altre particelle 16

17 6.3 Analisi TEM L analisi in Microscopia Elettronica in Trasmissione (TEM) permette il riconoscimento morfologico anche delle fibre più piccole (vedi esempi in Appendice 8.2), difficilmente osservabili al SEM, e la loro classificazione mineralogica mediante l elaborazione di Spettri a Dispersione di Energia EDS e di Pattern di Diffrazione Elettronica SAED. Il TEM è in grado di rilevare la presenza di fibre ultrafini, con diametri inferiori ai decimi di micron e lunghezze minori di 1 µm, superando decisamente i limiti di risoluzione del microscopio elettronico a scansione. Sono stati condotti test al fine di ottimizzare la metodica di preparazione dei campioni TEM impiegando la tecnica della Replica Estrattiva. In particolare il procedimento adottato prevede i seguenti punti in successione: - creazione della replica - dissoluzione della membrana - estrazione della replica Creazione della replica a. Dopo la fase di filtrazione ed essiccazione, ritagliare le membrane di policarbonato con porosità di 0,45 μm in porzioni di dimensioni (15x3) mm prelevate dalla zona diametrale del filtro. b. Fissare le membrane cautamente ad un vetrino, numerarle e porle nella camera di deposizione di un Carbon Vacuum Evaporator per il ricoprimento con uno strato sottile di carbone e la creazione della replica. c. Portare il vuoto nella camera di evaporazione ad un livello di circa 10-4 Torr (0.013 Pa). d. Evaporare il carbone con intermittenza per evitare un surriscaldamento della membrana. e. Depositare uno strato sottile di circa 30 o 50 nm sulle striscioline di membrana Dissoluzione della membrana a. Dopo il ricoprimento al carbonio, lasciare galleggiare le porzioni di membrana direttamente in un bagno di cloroformio per alcune ore. b. Utilizzare una capsula-petri profonda almeno 2 cm e riempirlo per ¾ con cloroformio. c. Sistemare con cura la membrana sulla superficie del liquido, evitando di sostare a lungo tra i vapori di cloroformio che tenderanno ad arricciarne la superficie. d. Dopo alcune ore (in genere 3 ore) il policarbonato della membrana sarà dissolto dal cloroformio e. Sullo strato di carbonio rimarranno saldati gli oggetti prima presenti sulla membrana Estrazione della replica a. Il contenuto della replica galleggiante è raccolto inserendo dal basso una grid TEM con idonea pinzetta, e sollevando una porzione della replica. 17

18 b. In genere da una replica di 15x3 mm si possono ricavare 2 o 3 grid con sufficiente margine. c. Le repliche al carbonio sono depositate su grid di rame (300 mesh) di 3 mm di diametro Osservazione Ogni particella con un rapporto dimensionale di 3:1 o superiore e di origine non-biologica deve essere esaminata come sospetta fibra di amianto. Le fibre sono inizialmente classificate in base alla loro morfologia, successivamente si esaminano gli spettri di composizione (EDS) e i pattern di diffrazione (SAED): Per le fibre con morfologia tubolare, sospette di essere fibre di crisotilo, è consigliabile esaminare il pattern di diffrazione prima di eseguire l analisi EDS in quanto l alta densità di corrente impiegata per l analisi può danneggiare la fibra e rendere impraticabile il successivo confronto di diffrazione. Se al contrario la fibra non possiede morfologia tubolare viene ritenuta sospetta anfibolo. In questo caso l ordine dei controlli non è rilevante essendo fibre caratterizzate da alta resistenza e di difficile degradazione. L utilizzo della diffrazione elettronica su fibre a simmetria cilindrica come quelle di crisotilo è applicabile sotto qualsiasi orientazione. Al contrario per gli anfiboli è necessario allineare, parallelamente al raggio incidente, un asse cristallografico principale della struttura cristallina della fibra. Il numero di fibre che devono essere contate dipende dalla precisione statistica richiesta. In assenza di fibre, l area della grid che deve essere esaminata dipende dalla sensibilità analitica richiesta. Per ragioni statistiche dovrebbero essere contate fibre su almeno 4 openings (aperture della grid). La precisione del conteggio dipende non solo dal numero totale di fibre contate, ma anche dalla loro uniformità e disposizione tra le openings. Nella pratica è stato trovato che terminare un conteggio alla centesima fibra osservata o alla ventesima openings esaminata porta a risultati soddisfacenti che non richiedono ulteriori conferme (EPA 100.1). L osservazione è condotta a 20000X. Per lo sviluppo del seguente protocollo si è utilizzato: - Microscopio JEOL JEM-3010 con microanalisi EDS - Software di supporto Oxford Link ISIS per l analisi EDS - Digita lmicrograph per le analisi diffrattometriche - Osservazioni condotte a 300KV Conteggio Per il conteggio verrà eseguita una scansione delle grid in ordine sistematico in modo da non aver doppi conteggi. È probabile che si presentino numerosi casi particolari durante l osservazione, per questo si sono definite delle regole di conteggio in accordo a quanto descritto sulla metodica EPA Per le fibre che toccano i lati delle opening scegliere due lati primari su ogni openings e 18

19 contare come mezze fibre le estremità che sporgono da esclusivamente questi due lati. Infatti si ipotizza che statisticamente la lunghezza visibile di fibra sia metà di quella reale. In fig. 3a) si nota che vengono conteggiate come 1 fibra le porzioni sporgenti solo da i lati superiore e sinistro e così per tutte le opening Non contare 1 fibra Non contare 1 fibra osservate in successione. Fig.3a) Conteggio di fibre che si posano sui lati delle openings In fig. 3b) si analizza il caso in cui le fibre si estendano al di la del campo visivo. E indispensabile osservare sistematicamente i quadranti del campo visivo in modo da non eseguire un doppio conteggio di fibre. E consigliabile considerare come il caso precedente solo due quadranti e valutare solo quelle sporgenti da questi due quadranti. Nel caso in cui una fibra attraversi completamente il campo visivo questa non va considerata. Al contrario nel caso in cui una fibra è completamente contenuta, questa va contata come una fibra. 1 fibra 1 fibra Non contare Non contare Non contare 1 fibra Fig.3b) Conteggio di fibre che si estendono al di fuori del campo visivo 19

20 Un fascio di fibre parallele ed un aggregato di fibre casuali saranno contati rispettivamente come unica fibra di dimensioni medie e come tante fibre quante compongono l aggregato purché nitidamente distinguibili come mostrato in fig. 3c). 8 fibre 3 fibre Fig.3c) Conteggio di fasci ed aggregati di fibre. Altri casi particolari possono derivare da fibre attaccate o parzialmente nascoste a particelle estranee non-fibrose. In questo caso vanno registrate le dimensioni effettive della fibra se queste sono nitidamente visibili, se invece sono parzialmente oscurate dalla particella andrà considerata come lunghezza la lunghezza doppia della parte visibile oppure la lunghezza totale fibra-particella come in fig.3d). Fig 3d) conteggio di fibre attaccate a particelle estranee non-fibrose. Per il calcolo della concentrazione di fibre si impiega la seguente formula: C = n A f / A V 1000 [MFL milioni fibre per litro] dove - N: numero di fibre conteggiate - A f : area effettiva di filtrazione in mm 2 della membrana - A: area totale esaminata in mm 2 - V: volume del campione filtrato in ml 20

21 6.3.6 Filtri bianchi Al fine di verificare la non contaminazione dei filtri bianchi, si effettuerà la letture degli stessi, uno ogni 25 filtri usati o, in alternativa uno per ogni set. Il numero di fibre ivi riscontrate, in un numero di campi pari a quello esaminato per i campioni di percolato, non potrà essere superiore a 4; in caso contrario occorrerà scartare l'intero set di filtri al fine di non inficiare la corretta valutazione del numero di fibre effettivamente presenti sul filtro. I filtri bianchi dovranno essere esposti all aria, in laboratorio, nel luogo ove si esegue il filtraggio, per un intero turno lavorativo (8 ore). Poiché le membrane usate per le osservazioni TEM possono essere le medesime del SEM, nel caso di precedenti letture dei filtri bianchi al SEM verrà tralasciata la lettura TEM Scheda tecnica: Approccio statistico Calcolo della concentrazione media di fibre e relativi intervalli di confidenza Si vuole determinare un valore medio di fibre per apertura con il quale calcolare la concentrazione media di fibre nel campione. Si vuole inoltre fornire un intervallo che contenga questo valore con il 95% di confidenza. Assumendo che le fibre siano distribuite in modo random sulla griglietta, la distribuzione di queste fibre sulle singole aperture dovrebbe seguire una distribuzione di Poisson. Il che vuol dire che la probabilità di trovare un certo numero n i di fibre in una generica apertura i sarà data dall equazione: ni n n P( ni ) = e n! dove n è il valore medio di fibre atteso in una apertura. Se il numero di aperture esaminate, k, è sufficiente (legge dei grandi numeri), il valore medio di fibre atteso per apertura sarà dato dal numero totale di fibre, n, (contato su tutte le k aperture esaminate) moltiplicato per la frazione di area relativa ad una singola apertura, p i (rapporto tra l area di una apertura, A i, e quella di tutte le aperture osservate, A). Si ha cioè: A i n = n pi = n. Se si assume che le aperture siano tutte uguali A=kAi, allora il A numero medio di fibre atteso diventa i n = n e l equazione della probabilità: k ni n / k n P( ni ) = e. ni k n! Quindi, per esempio, se si contano 50 fibre su 20 aperture, la probabilità di trovare fibre in una singola apertura sarà del 21%: P( 3) = e 50 / = 0. 21, mentre quella di ! trovarne 6 è solo del 2.8%. In figura si possono vedere gli andamenti previsti dalla distribuzione di Poisson per 10, 50 e 100 fibre totali osservate su 20 aperture, i 21

22 corrispondenti a valori medi di 0.5, 2.5 e 5 fibre per apertura (si noti che, mentre la p è definita solo per numeri interi, la media è un numero reale). Queste curve danno cioè la probabilità di trovare un certo numero di fibre (n i ) all osservazione di una singola generica apertura. Si nota come per basso numero di fibre la distribuzione sia fortemente asimmetrica. La distribuzione diventa simmetrica per un numero totale di fibre superiore ad alcune decine di fibre totali, assomigliando sempre di più ad una distribuzione gaussiana. P(n i ) Distribuzione di Poisson per numero crescente di fibre totali osservate a parità di aperture esaminate Caratteristica della distribuzione di Poisson è che la deviazione standard risulta uguale alla radice quadrata del valor medio, così che per esempio un particolare conteggio di fibre effettuato su una sola apertura possiede lo stesso intervallo di confidenza di un altro equivalente conteggio derivante invece dall osservazione di molte aperture in sequenza. Questo significa che utilizzando questa distribuzione non è possibile determinare in modo indipendente la reale fluttuazione del numero di fibre tra le diverse aperture, e si è costretti quindi ad assumere implicitamente che la deposizione delle fibre sia effettivamente random, con il rischio di un restringimento eccessivo degli intervalli di confidenza risultanti. Per la distribuzione gaussiana invece la deviazione standard viene calcolata in base alle differenze tra il numero di fibre osservate nelle singole aperture e il valor medio, rispecchiando quindi la reale fluttuazione dei dati, anche nel caso ci siano deviazioni dalla condizione di perfetta randomness, a causa di agglomerazione delle fibre o altre cause di disomogeneità della deposizione. Da questo punto di vista, l utilizzo di una distribuzione gaussiana è preferibile. E chiaro tuttavia dalle considerazioni fatte sopra sulla forma della distribuzione di Poisson, che per conteggi di fibre basse non è possibile utilizzare la simmetrica gaussiana e si è costretti ad usare media e deviazione standard calcolate in base alla distribuzione poissoniana, assumendo implicitamente una situazione di deposizione perfettamente casuale. Per calcolare gli intervalli di confidenza al 95% per la distribuzione poissoniana ci si serve della tabella 2 (vedi sotto) che dà i limiti inferiore e superiore in funzione del numero totale di fibre n osservate. Per conteggi totali inferiori a 5 fibre, il limite inferiore di confidenza del 95% corrisponde ad 1 fibra o meno, mentre il limite superiore di confidenza del 95% per il conteggio di zero fibre corrisponde a 3,69 fibre. Non ha quindi senso definire limiti di confidenza per un numero di fibre inferiore a 5, cosicché i 22

23 risultati andranno registrati come inferiori al.. corrispondente limite di confidenza superiore del 95%. Siccome la tabella è in funzione delle fibre totali, per ottenere gli intervalli di confidenza attorno al valor medio occorre dividere i limiti ottenuti dalla tabella per il numero di aperture esaminate k. Tab. 2 Limiti di confidenza al 95% per la distribuzione di Poisson, in funzione del numero totale di fibre osservate n. n Inferiore Superiore n Inferiore Superiore n Inferiore Superiore Per la distribuzione gaussiana, invece, l intervallo di confidenza del 95% viene calcolato dalla deviazione standard σ, utilizzando la tabella della t di Student (vedi tabella 3 sotto) per (k 1) gradi di libertà (dove k è il numero di aperture esamine). Se il valore medio di fibre è n il limite inferiore n I e superiore n S sono calcolati come segue: t σ t σ n S = n + ; n I = n k k 23

24 Tab. 3 - Coefficienti t di Student per limiti di confidenza del 95% in funzione del numero k di aperture osservate k-1 t k-1 t Noto il valore di fibre medio per apertura occorre calcolare la concentrazione in MFL (milioni di fibre per litro) presente nel liquido sotto esame. A tale scopo ci si serve del fattore C, uguale alla concentrazione in MFL relativa all osservazione di una singola fibra e corrispondente alla sensibilità analitica: Af RD C = A V 1000 dove: A f : area effettiva di filtrazione in mm 2 della membrana A: area totale esaminata in mm 2 V: volume del campione filtrato in ml R D : rapporto di diluizione del campione originale (se diluito) La concentrazione in MFL per un numero generico di fibre è ottenuta moltiplicando per il fattore C il numero totale di fibre conteggiate. In modo analogo, i limiti di confidenza inferiore e superiore si ottengono moltiplicando per C quelli precedentemente calcolati relativi al numero totale di fibre. In base alle considerazioni fatte sopra, il documento EPA prescrive che il conteggio delle fibre sia riportato come segue: Caso 1: nessuna fibra osservata: il risultato sarà riportato come inferiore al 3,69 volte la concentrazione corrispondente ad una fibra. Caso 2: da 1 a 4 fibre: il risultato sarà riportato come inferiore al corrispondente limite superiore del 95% (Poisson) Caso ): da 5 a 30 fibre: saranno riportati la media e i limiti di confidenza inferiore e superiore corrispondenti al 95% (Poisson) Caso 4: più di 30 fibre: verranno calcolati gli intervalli di confidenza del 95% per entrambe le distribuzioni (Gauss e Poisson) e varrà indicato come risultato il maggiore tra i due. 24

25 6.4 Analisi MOCF (Procedura per campionamento e analisi in accordo con quanto previsto dal D.M. 6/9/94 e dal D.l. n 277 del 15/8/1991) Preparazione del campione (vetrini) Le membrane che verranno usate per le osservazioni in MOCF saranno in esteri misti di cellulosa con porosità di 0,8 μm. Una porzione del filtro, ottenuto con le medesime procedure preparative descritte per le osservazioni SEM, posta su un vetrino da microscopio, è reso trasparente mediante il metodo acetone-triacetina e coperto con vetrino coprioggetti. La procedura è descritta nel metodo indicato dalla Dir. CEE 83/477; (vapori di acetone e triacetina). Per diminuire il tempo necessario alla completa diafanizzazione, dopo la applicazione della triacetina (normalmente di ca. 24 ore), si può scaldare il preparato (vetrino più coprioggetto) per 15 minuti a circa 50 C su una piastra riscaldante Campi microscopici da esaminare Per ciò che concerne l analisi in MOCF, tenuto conto che un campo microscopico corrisponde all'area reticolo di Walton-Beckett (a 500 x è mm 2 ), verranno esaminati 130 campi per ciascun campione corrispondenti ad una superficie di 1 mm 2 della membrana filtrante prendendo come riferimento il valore indicato nel D.M. italiano 6/9/1994 per l analisi al SEM di filtri provenienti dal campionamento di particolato aerodisperso Criteri di conteggio (Dir. CEE 83/477). Con la MOCF si effettuerà una prima analisi quantitativa dei filtri in esteri misti di cellulosa al fine di conteggiare tutte le fibre standard presenti nel campione ed una analisi semiqualitativa, ove possibile, delle fibre che presentano caratteristiche ottiche peculiari. Il conteggio dei campioni verrà effettuato secondo le seguenti regole: Per fibra standard si intende qualunque particella, di lunghezza > 5µm, diametro < 3µm e rapporto lunghezza/diametro >3, che non sia in contatto con una o più particelle di diametro maggiore di 3 µm. Le singole fibre che hanno entrambe le estremità entro l'area del reticolo devono essere contate come un'unica fibra; una fibra avente una sola estremità all'interno di tale area deve essere contata come mezza fibra. Le aree del reticolo per il conteggio devono essere scelte a caso all'interno della superficie del filtro e non devono mai sovrapporsi. A tal fine si consiglia di seguire un percorso a greca. Un agglomerato di fibre che appaia compatto e intero in uno o più punti della sua lunghezza, ma appaia diviso in trefoli (fibra ramificata) in altri, deve essere contato come una unica fibra purchè avente le dimensioni standard; in tale eventualità il diametro deve essere misurato in corrispondenza della porzione di fibra intera e non ramificata. 25

26 In qualsiasi altro agglomerato in cui le singole fibre si tocchino o si incrocino (fascio), queste devono essere contate individualmente ogniqualvolta possano essere distinte sufficientemente per stabilire che abbiano dimensioni standard. Se non è possibile distinguere nessuna singola fibra rispondente a tale definizione, il fascio deve essere contato come un'unica fibra, sempre che sia conforme nel suo complesso a tali dimensioni. Se più di un ottavo di un area del reticolo è coperto da un agglomerato di fibre e/o particelle, tale area del reticolo deve essere scartata ed un'altra area deve essere esaminata per il conteggio Calcolo della concentrazione C = (10 6 N D 2 ) / (VN d 2 ) [ff/litro] dove: N = n. di fibre contate in totale; n = n. di campi del reticolo esaminati su un filtro (200 o meno in funzione del volume totale prelevato); D = in mm, diametro effettivo del filtro (verrà considerata la superficie della porzione utilizzata nell analisi, prelevata da un filtro di 47 mm di diametro); d = in micron, è il diametro del reticolo di Walton Beckett (100 micrometri); V = in litri, il volume di acqua filtrato Conteggio Per il conteggio è usato un microscopio binoculare con le seguenti caratteristiche: Illuminazione Koehler. Condensatore ABBE o acromatico a contrasto di fase incorporato nel complesso posto sotto al piatto portaoggetti e montato con possibilità di centraggio e messa a fuoco. Aggiustamento del centraggio per il contrasto di fase indipendente dal meccanismo di centraggio del condensatore. Obiettivo acromatico a contrasto di fase positivo parafocale, a 40 ingrandimenti, con apertura numerica compresa tra 0,65 e 0,70 e con assorbimento dell'anello di fase compreso tra 65 e 85%. Oculari a compensazione a 12,5 ingrandimenti: almeno un oculare deve permettere l'inserimento di un reticolo ed avere la messa a fuoco. Reticolo oculare circolare Walton-Beckett con diametro apparente sul piano oggetto di 100 µm ± 2 µm quando si usano l'obiettivo e l'oculare indicati, e controllato mediante un micrometro Limite di rilevabilità Controllare il limite di rilevabilità mediante un "vetrino di prova per contrasto di fase". Quando siano usati nel modo specificato dal fabbricante si deve poter vedere fino al codice 5 sui vetrini di prova AIA e sino al blocco 5 sul vetrino di prova HSE/NPL Mark 2. Tale procedura deve essere effettuata all'inizio di ciascuna giornata di lavoro. 26