Il controllo della crescita microbica rappresenta il principale obiettivo sia

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1 Il controllo della crescita microbica rappresenta il principale obiettivo sia dei microbiologi clinici sia di quelli che si occupano di ricerca di laboratorio; esso costituisce inoltre una battaglia quotidiana in tutti quei luoghi in cui sono richieste misure igieniche, in casa, negli ospedali, nei ristoranti e così via. Esistono diversi metodi fisici e chimici per attuare tale controllo, come disinfettanti chimici e antisettici, mentre per un utilizzo in vivo sono disponibili molti farmaci con una potente attività antimicrobica. Tuttavia, lo strumento fondamentale è rappresentato dalla sterilizzazione, raggiunta generalmente con metodi fisici, come il vapore pressurizzato e il calore all interno di un autoclave di cui mostriamo qui un esemplare. 14 CTRLL DELLA CRESCITA MICRBICA I METDI FISICI PER IL CTRLL DELLA CRESCITA MICRBICA Sterilizzazione mediante calore Sterilizzazione mediante radiazioni Sterilizzazione per filtrazione 400 II METDI CIMICI PER IL CTRLL DELLA CRESCITA MICRBICA Controllo della crescita mediante l uso di agenti chimici Antisettici, disinfettanti e sterilizzanti 404 III AGETI ATIMICRBICI UTILIZZATI I VIV Farmaci antimicrobici sintetici Farmaci antimicrobici naturali: gli antibiotici Antibiotici b-lattamici: penicilline e cefalosporine Antibiotici prodotti dai procarioti 412 IV CTRLL DEI VIRUS E DEI PATGEI EUCARITICI Farmaci antivirali Farmaci antimicotici 415 V RESISTEZA AI FARMACI ATIMICRBICI E RICERCA DI UVI FARMACI Resistenza ai farmaci antimicrobici La ricerca di nuovi farmaci antimicrobici 421

2 394 Capitolo 14 CTRLL DELLA CRESCITA MICRBICA ISB Glossario agente antimicrobico Composto chimico che uccide i microrganismi o ne inibisce la crescita. agente antivirale Composto che blocca la replicazione del virus e la sua azione o che ne blocca soltanto la replicazione. agente battericida Agente che uccide i batteri. agente batteriostatico Agente che inibisce la crescita dei batteri. agente chemioterapico Agente antimicrobico che può essere utilizzato per via sistemica. agente fungicida Agente che uccide i funghi. agente fungistatico Agente che inibisce la crescita dei funghi. aminoglicosidi Gruppo di antibiotici, tra cui la streptomicina, che contiene aminozuccheri associati mediante legami glicosidici. analogo di fattore di crescita Agente chimico che è strettamente correlato a un fattore di crescita e ne blocca l assorbimento. antibiotico Sostanza chimica prodotta da un microrganismo che uccide altri microrganismi o ne inibisce la crescita. antibiotico a largo spettro Antibiotico che agisce sia sui batteri Gram-positivi sia su quelli Gram-negativi. antibiotici b-lattamici Gruppo di antibiotici, tra cui la penicillina, che contiene l anello b-lattamico eterociclico a quattro termini. antisettico Agente antimicrobico sufficientemente poco tossico da poter essere applicato a tessuti viventi. autoclave Apparecchio per la sterilizzazione che distrugge i microrganismi con la temperatura e il vapore acqueo sotto pressione. chinoloni Composti sintetici antibatterici che interagiscono con la DA girasi impedendo così il superavvolgimento del DA batterico. decontaminazione Trattamento che rende un oggetto o una superficie tale da poter essere maneggiata o toccata senza rischio di contaminazioni. disinfettante Agente antimicrobico utilizzabile solo su oggetti inanimati. disinfezione Processo attraverso il quale si eliminano quasi tutti i patogeni, ma non tutti i microrganismi, da oggetti e superfici inanimate. inibizione Riduzione della crescita microbica causata dalla diminuzione del numero di organismi presenti o dalle alterazioni nell ambiente microbico. interferoni Proteine antivirali specie-specifiche, prodotte dalle cellule infettate, che prevengono l infezione virale delle cellule adiacenti. lisi Perdita dell integrità cellulare con rilascio dei componenti citoplasmatici. MIC (Minimum Inhibitory Concentration) Minima concentrazione inibente: la concentrazione minima di una sostanza, necessaria per inibire la crescita microbica. RTI (on-ucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor) Inibitore non nucleosidico della trascrittasi inversa. RTI (ucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor) Inibitore nucleosidico della trascrittasi inversa. pastorizzazione Distruzione di tutti i microrganismi che causano malattie o riduzione del numero dei microrganismi responsabili del deterioramento degli alimenti. penicillina semisintetica Penicillina naturale modificata chimicamente. PI Inibitore delle proteasi. resistenza ai farmaci antimicrobici Acquisizione da parte di un microrganismo della capacità di crescere in presenza di un farmaco antimicrobico al quale è generalmente sensibile. sterilizzazione Uccisione o rimozione di tutti gli organismi viventi e dei loro virus da un terreno di coltura. tetraciclina Antibiotico caratterizzato da un anello naftacenico a quattro termini. Con questo capitolo cominciamo a spostare la nostra attenzione dallo studio dei microrganismi in quanto tali allo studio dei microrganismi in relazione al resto del mondo vivente e all ambiente, in particolare in relazione all uomo, concentrandoci sugli agenti e i metodi utilizzati per tenere sotto controllo la crescita microbica. In generale, questo tipo di sorveglianza può essere effettuato limitando la crescita microbica attraverso il processo di inibizione, o distruggendo gli organismi con la sterilizzazione attraverso l uccisione o la rimozione di tutti gli organismi vivi da un terreno di crescita. Gli agenti che distruggono o uccidono i batteri sono detti battericidi. ella pratica, la sterilità spesso non è conseguibile, ma in molti casi si può inibire la crescita rapida degli organismi con metodi di decontaminazione e disinfezione. Gli agenti che inibiscono la crescita dei batteri sono detti batteriostatici. Le misure di controllo microbico comprendono la decontaminazione, la disinfezione e la sterilizzazione. Continuamente applichiamo metodi di decontaminazione, per esempio quando puliamo il tavolo dopo un pasto, rimuoviamo potenziali nutrienti per i microrganismi e microbi contaminanti, prevenendo così la crescita microbica. Le misure antimicrobiche più dirette prevedono la disinfezione con specifici agenti chimici o fisici, allo scopo di inibire la crescita microbica o distruggere i microrganismi; per esempio, di norma usiamo l alcol per pulire e disinfettare le ferite. Infine, quando necessario, per distruggere tutti i microrganismi utilizziamo metodi di sterilizzazione controllata. Quest ultima, sebbene difficile da ottenere, previene completamente la contaminazione e la crescita dei microrganismi. Queste misure sono particolarmente necessarie quando si preparano terreni di coltura o strumenti chirurgici. Lo scopo finale di tutte queste procedure è la riduzione della carica microbica, o numero di microrganismi vitali presenti. Il controllo microbico in vivo è cosa molto diversa. Dal punto di vista clinico, gli agenti battericidi e batteriostatici utilizzabili sono quelli che riducono o ostacolano la crescita microbica senza causare danni alla cellula ospite. Una grande varietà di agenti chemioterapici naturali e sintetici possiedono queste caratteristiche. In questo capitolo esamineremo dapprima i metodi di controllo microbico utilizzati in vitro, per poi passare alla trattazione dei farmaci antimicrobici utilizzati in vivo sull uomo.

3 414 Capitolo 14 CTRLL DELLA CRESCITA MICRBICA ISB IV CTRLL DEI VIRUS E DEI PATGEI EUCARITICI I farmaci che controllano la replicazione dei virus e dei patogeni eucariotici, come i funghi, spesso colpiscono anche le cellule eucariotiche ospiti; quindi, per il trattamento di queste infezioni saranno utili soltanto quei composti che interferiscono in modo preferenziale con vie metaboliche e componenti strutturali specifici del patogeno. Esiste un numero limitato di questi farmaci e qui parleremo dell attività di alcuni di essi Farmaci antivirali I virus utilizzano le cellule eucariotiche che li ospitano per riprodursi e per svolgere le loro funzioni metaboliche. Dal momento che per molti aspetti della loro replicazione i virus dipendono dalle strutture e dalle vie metaboliche della cellula ospite ( cap. 9), è spesso difficile inibire la moltiplicazione virale senza ledere la cellula stessa. Tuttavia, esistono diversi agenti che sono più tossici per i virus che non per l ospite; inoltre, la cellula ospite produce alcune sostanze che colpiscono in maniera specifica i virus. Agenti chemioterapici antivirali A causa della stretta interconnessione delle strutture e delle funzioni virali con le funzioni della cellula ospite, lo spettacolare successo clinico ottenuto con le sostanze antibatteriche non è stato seguito da analoghe scoperte nell ambito dei composti antivirali. Tuttavia, grazie agli sforzi fatti per trovare misure di controllo efficaci per l AIDS ( vol. 2, cap ), nel controllo delle infezioni virali sono state fatte alcune importanti conquiste utilizzando agenti chimici (tab. 14.5). Gli agenti per la chemioterapia antivirale, che hanno avuto più successo e che sono anche i più utilizzati, sono gli analoghi dei nucleosidi. Il primo composto a conquistare l approvazione universale in questa categoria è stato la zidovudina, o azidotimidina (AZT). L AZT inibisce i retrovirus, il gruppo al quale appartiene il virus dell immunodefi- TABELLA 14.5 Composti chemioterapici antivirali Categoria/farmaco Meccanismo d azione Virus bersaglio Analoghi nucleosidici Acyclovir Inibitori della polimerasi virale erpes virus, Varicella zoster Ganciclovir Citomegalovirus Trifluoridina erpes virus Valacyclovir erpes virus Vidarabina erpes virus, vaccinia, virus dell epatite B Didanosina (dideossinosina o ddi) Inibitori della trascrittasi inversa IV a Lamivudina (3TC) IV, virus dell epatite B Stavudina (d4t) IV Zalcitabina (ddc) IV Zidovudina (AZT) ( vol. 2, fig ) IV Ribavirina Blocca il capping dell RA virale Virus respiratorio sinciziale, influenza A e B, febbre di Lassa Amine sintetiche Amantadina Bloccano la rimozione del capside Influenza A Rimantadina Influenza A Analoghi nucleotidici Cidofovir Inibitore della polimerasi virale Citomegalovirus, herpes virus Analogo del pirofosfato Acido fosfonoformico (Foscarnet) Inibitore della polimerasi virale erpes virus, IV, virus dell epatite B Inibitore non nucleosidico della trascrittasi inversa (RTI) evirapina Inibitore della trascrittasi inversa IV Inibitore dell RA polimerasi Rifamicina Inibitore dell RA polimerasi Vaccinia, pox virus Inibitori della proteasi Indinavir (fig ) Inibitori delle proteasi IV Ritonavir IV Saquinavir (fig ) IV elfinavir IV Abacivir IV Lopinavir IV Interferoni Interferone a Interferiscono con la replicazione Ampio spettro, la loro attività è specie-specifica Interferone b virale mediante l induzione Interferone g di proteine specifiche a Virus dell immunodeficienza acquisita.

4 ISB FARMACI ATIMICTICI 415 cienza umana (IV), l agente responsabile dell AIDS ( vol. 2, fig ). L azidotimidina è chimicamente correlata alla timidina, di cui è un dideossi derivato privo del gruppo ossidrile al 3 ; essa inibisce la moltiplicazione dei retrovirus bloccando la sintesi dell intermedio di DA (retrotrascrizione) ed è largamente utilizzata nella lotta contro IV. ella tabella 14.5 sono elencati altri analoghi di nucleosidi sviluppati per il trattamento di IV. Quasi tutti gli analoghi di nucleosidi, o inibitori nucleosidi della trascrittasi inversa (ucleoside Reverse Transcriptase Inhibitos, RTI), funzionano con lo stesso meccanismo, inibendo l allungamento dell acido nucleico virale a livello della polimerasi della cellula ospite. Poiché queste sostanze interferiscono parzialmente anche con la replicazione degli acidi nucleici della cellula ospite, questi farmaci mostrano quasi sempre una certa tossicità per l ospite. Inoltre, molti di essi perdono, nel tempo, il loro potenziale antivirale a causa della comparsa di virus resistenti al farmaco somministrato ( vol. 2, cap ). L analogo nucleotidico cidofovir funziona nello stesso modo (tab. 20.5). Esistono diversi altri composti chimici che funzionano inibendo la polimerasi virale: la nevirapina, un inibitore non nucleosidico della trascrittasi inversa che si lega direttamente all enzima e ne inibisce l attività; l acido fosfonoformico, che agisce come un analogo del pirofosfato inorganico, inibendo il normale legame internucleotidico; la rifamicina, un antibiotico che lega e inibisce la RA polimerasi. Una classe relativamente nuova di farmaci antivirali è rappresentata dagli inibitori delle proteasi (Protease Inhibitors, PI); essi sono particolarmente efficaci per il trattamento delle infezioni da IV: prevengono l infezione legandosi al sito attivo della proteasi di IV, inibendo così il processamento dei polipeptidi virali e la maturazione del virus ( vol. 2, cap e par ). Interferone Gli interferoni sono sostanze antivirali prodotte da molte cellule animali in risposta all infezione di alcuni virus. Sono proteine a basso peso molecolare ( MW) che inibiscono la moltiplicazione virale nelle cellule normali inducendo la produzione di proteine antivirali. Gli interferoni prodotti dalle cellule infettate si legano a specifici recettori sulle cellule adiacenti non infettate, promuovendo in questo modo la sintesi di proteine antivirali la cui funzione è quella di prevenire la propagazione dell infezione. Esistono tre tipi di interferoni: l IF-a, prodotto dai leucociti; l IF-b, prodotto dai fibroblasti e l IF-g, prodotto dalle cellule del sistema immunitario note come linfociti ( vol. 2, cap ); tutti e tre sono degli efficaci inibitori virali. Essi sono stati scoperti nel corso di studi sull interferenza virale, un fenomeno in cui l infezione con un dato virus interferisce con la successiva infezione da parte di un altro virus, da qui il nome interferone. Si è osservato che gli interferoni si formano non solo in risposta a particelle virali vitali, ma anche in presenza di particelle virali inattivate con radiazioni o del solo acido nucleico virale. L interferone viene prodotto in quantità maggiore da cellule infettate con virus poco virulenti, mentre le cellule infettate con virus molto virulenti ne producono in quantità limitate. I virus virulenti, probabilmente, inibiscono la sintesi proteica cellulare prima che esso possa venir prodotto. L interferone è anche indotto da una varietà di molecole di RA a doppio filamento, sia naturali sia sintetiche. Poiché le molecole di RA a doppio filamento sono assenti nelle cellule non infettate, ma si ritrovano, come forme replicative, in cellule infettate da virus a RA, si ritiene che esse possano essere utilizzate dalla cellula come segnale dell avvenuta infezione e, quindi, come stimolo per la produzione di interferone. Gli interferoni non sono virus-specifici, ma sono ospite-specifici: l interferone prodotto da un membro di una specie riconosce recettori specifici soltanto sulle cellule della stessa specie; quindi, l interferone prodotto da un animale in risposta, per esempio, al virus dell influenza, inibisce la replicazione di altri virus nella stessa specie, ma non ha alcun effetto sulla moltiplicazione di qualsiasi virus in animali di specie diverse. Gli interferoni rivestono grande interesse come sostanze antivirali e anche come possibili agenti antitumorali. Sono oggi disponibili e approvate diverse preparazioni di interferone ricombinante. Tuttavia, l uso dell interferone come agente chemioterapico non è molto diffuso, in quanto, per stimolare la produzione di proteine antivirali nelle cellule non infettate, deve essere somministrato localmente ad alte concentrazioni. Quindi, l utilità clinica di questi agenti antivirali dipende dalla nostra abilità di somministrare l interferone nell ospite in aree limitate attraverso iniezioni o aerosol. In alternativa, lo stesso risultato può essere raggiunto con appropriati segnali che stimolano la produzione di interferone (per esempio stimolazione con frammenti di acido nucleico virale, virus non virulenti o perfino con acidi nucleici sintetici) dati alle cellule ospiti prima dell infezione virale Verifica I virus utilizzano il macchinario metabolico della cellula ospite per moltiplicarsi. Tuttavia, è possibile interferire con molti enzimi e processi virus-specifici, mediante l uso di agenti chemioterapici, per inibire la replicazione virale. Tra gli agenti antivirali efficaci nelle applicazioni cliniche sono annoverati gli analoghi di nucleosidi che funzionano inibendo le polimerasi virali. Alcuni altri agenti, come gli inibitori delle proteasi, interferiscono con le fasi della maturazione virale. Le cellule ospiti producono esse stesse sostanze proteiche antivirali, dette interferoni, che bloccano la replicazione virale. Perché esistono così pochi agenti chemioterapici antivirali efficaci? Quali fasi del processo di maturazione virale sono inibite dagli analoghi nucleosidici? Quali dagli inibitori delle proteasi? Quali dagli interferoni? Farmaci antimicotici Come i virus, anche i funghi pongono dei problemi per l allestimento di un efficace chemioterapia. Dal momento chefanno parte degli Eucarioti, il loro macchinario metabolico è per lo più simile a quello delle cellule animali,

5 416 Capitolo 14 CTRLL DELLA CRESCITA MICRBICA ISB uomo compreso; quindi, gli agenti chemioterapici attivi sulle vie metaboliche dei funghi, spesso interferiscono con le stesse vie nelle cellule ospiti, presentando una notevole tossicità. Per questo motivo, molti farmaci antimicotici possono essere usati soltanto per applicazioni topiche (superficiali). Esistono, tuttavia, alcuni farmaci con una tossicità selettiva per i funghi. I farmaci per il trattamento di infezioni da funghi stanno diventando sempre più importanti se consideriamo che questo tipo di infezioni è quello prevalente negli individui immunosoppressi ( vol. 2, capp e 28.7). Tratteremo qui in dettaglio la tossicità selettiva di diverse classi di composti chimici efficaci contro i funghi. Funzioni associate alla membrana: i polieni si legano all ergosterolo e distruggono l integrità della membrana Sintesi della parete cellulare: le polioxine inibiscono la sintesi della chitina Sintesi dell ergosterolo: gli azoli e le allilamine ne inibiscono la sintesi Inibitori dell ergosterolo Due importanti gruppi di composti antimicotici agiscono interagendo con l ergosterolo o inibendo la sua sintesi (tab. 14.6). ella maggior parte dei funghi, il colesterolo presente nella membrana cellulare degli eucarioti superiori è sostituito dall ergosterolo ( cap. 4.5). Il primo gruppo di sostanze antimicotiche comprende i polieni, una classe di antibiotici prodotta dalla specie Streptomyces. I polieni si legano all ergosterolo, e tale legame interferisce con la funzionalità della membrana, causando, alla fine, alterazioni della permeabilità di membrana e la morte cellulare (fig ). Un secondo gruppo di composti antimicotici comprende gli azoli e le allilamine, agenti che inibiscono selettivamente la biosintesi dell ergosterolo e possiedono, quindi, un ampia attività antimicotica. Il trattamento con gli azoli porta all incapacità di produrre una membrana normale, con danneggiamenti della membrana stessa e alterazione di attività fondamentali ad essa associate, come il trasporto dei nutrienti. Anche le allilamine inibiscono la biosintesi dell ergosterolo, ma sono utilizzate soltanto per via topica, poiché non sono facilmente assorbite dalle cellule e dai tessuti animali. Sintesi degli acidi nucleici: la 5-fluorocitosina è un analogo di nucleotide che inibisce la sintesi degli acidi nucleici Formazione dei microtubuli: la griseofulvina distrugge l aggregazione dei microtubuli durante la mitosi Figura Bersagli di alcuni agenti chemioterapici antimicotici. Dal momento che i funghi sono cellule eucariotiche, gli agenti antibatterici sono generalmente inefficaci. Altri agenti antimicotici Esiste un certo numero di altri farmaci antimicotici che interferiscono con specifiche funzioni e strutture dei funghi (tab. 14.6). Per esempio, la maggior parte delle pareti cellulari dei funghi contengono la chitina, un polimero della - acetilglucosamina peculiare dei funghi e degli insetti ( vol. 2, cap ). umerose poliexine inibiscono la sintesi della parete cellulare interferendo con la biosintesi della chitina. Tuttavia, nessuno di questi inibitori è utilizzato nelle applicazioni cliniche, mentre trova un largo impiego in agricoltura come fungicida. Altri farmaci inibiscono la biosintesi del folato, interferiscono con la topologia del DA durante la replicazione, o, come la griseofulvina, distruggono i microtubuli durante la mitosi ( cap. 7.6). L analogo di base 5-fluorocitosina è un inibitore efficace della sintesi degli acidi nucleici nei funghi. Alcuni farmaci antimicotici molto efficaci hanno anche altre applicazioni bio- TABELLA 14.6 Farmaci antimicotici (fungicidi) Categoria Bersaglio Esempi Uso Polieni Sintesi dell ergosterolo Anfotericina B rale Analoghi degli acidi nucleici Sintesi del DA 5-Fluorocitosina rale Polioxine Sintesi della chitina Polioxina A Agricolo Polioxina B Agricolo Azoli Sintesi dell ergosterolo Fluconazolo rale Itraconazolo rale Ketoconazolo rale Clotrimazolo Topico Miconazolo Topico Voriconazolo rale Allilamine Sintesi dell ergosterolo Terbenafina rale

6 ISB RESISTEZA AI FARMACI ATIMICRBICI 417 logiche; per esempio, la vincristina, la vinblastina e il taxolo hanno attività antitumorali. Sfortunatamente, il prevedibile risultato dell uso di farmaci antimicotici è la comparsa di popolazioni di funghi resistenti e di nuovi funghi patogeni. Per esempio, specie di Candida, normalmente non patogene, possono causare malattie in individui che sono stati trattati con farmaci antifungini. Queste specie patogene di Candida resistenti non sono trattabili con nessuno degli agenti antimicotici normalmente usati. Con l aumentare dell impiego di agenti chemioterapici, sia antibatterici sia antimicotici, aumenta la possibilità di infezioni opportunistiche da funghi e la corrispondente necessità di specifici agenti antimicotici. dovuta a diverse cause. (1) ell organismo è assente il bersaglio su cui agisce l antibiotico; per esempio, alcuni batteri, come i micoplasmi, non sono dotati di parete e sono, quindi, resistenti alle penicilline. (2) L organismo potrebbe essere impermeabile all antibiotico; per esempio, la maggior parte dei batteri Gram-negativi sono resistenti alla penicillina G. (3) L organismo potrebbe essere in grado di alterare la molecola dell antibiotico rendendolo inattivo; molti stafilococchi producono la b-lattamasi che taglia l anello b-lattamico della maggior parte delle penicilline (fig ). (4) L organismo potrebbe modificare il bersaglio dell antibiotico. (5) Delle mutazioni genetiche potrebbero alterare la via metabolica che viene bloccata da un antibiotico; in questo modo l organismo sviluppa una via biochi Verifica Gli agenti antimicotici ricadono all interno di un ampia varietà di categorie chimiche. Come nel caso dei virus, è difficile ottenere una tossicità specifica; tuttavia, esiste un certo numero di agenti chemioterapici efficaci. Il trattamento delle infezioni da funghi è un problema emergente di sanità pubblica. Perché esistono così pochi antibiotici antimicotici efficaci nelle applicazioni cliniche? 2 C C 2 Quali fattori contribuiscono all insorgenza di nuove infezioni da funghi? V RESISTEZA AI FARMACI ATIMICRBICI E RICERCA DI UVI FARMACI La resistenza ai farmaci antimicrobici è uno dei problemi più gravi che si presentano con molti dei comuni microrganismi patogeni. Qui analizzeremo alcuni dei motivi per cui si osserva resistenza ai farmaci e presenteremo alcune possibili strategie per superarla Resistenza ai farmaci antimicrobici La resistenza ai farmaci antimicrobici è definita come la capacità acquisita di un organismo di resistere agli effetti di un agente chemioterapico al quale è normalmente suscettibile. La maggior parte delle resistenze coinvolgono geni di resistenza che sono trasferiti attraverso scambi genetici. Per proteggere se stessi, i microrganismi che producono antibiotici sviluppano dei meccanismi di resistenza per neutralizzare e distruggere i propri antibiotici; i geni che codificano prodotti coinvolti in questi meccanismi di resistenza possono, occasionalmente, essere trasferiti a un altro organismo. 3 C C 3 C Fosforilazione Adenilazione 2 Cloramfenicolo C Streptomicina R S C 3 C 3 C β-lattamasi C C C CCl 2 Acetilazione Penicillina Meccanismi di resistenza on tutti gli antibiotici sono attivi contro tutti i microrganismi. Alcuni microrganismi sono naturalmente resistenti ad alcuni antibiotici. La resistenza intrinseca può essere Figura Siti di attacco sugli antibiotici degli enzimi codificati da geni portati dai plasmidi R. Tra gli antibiotici aminoglicosidici correlati alla streptomicina, quelli con un gruppo aminico libero possono essere inattivati mediante -acetilazione (si veda anche fig ).

7 418 Capitolo 14 CTRLL DELLA CRESCITA MICRBICA ISB Tabella 14.7 Meccanismi di resistenza dei batteri agli antibiotici Meccanismo Esempio Basi genetiche Meccanismo di resistenza di antibiotico della resistenza presente in: Permeabilità ridotta Penicilline Cromosomale Pseudomonas aeruginosa Enterobatteri Inattivazione dell antibiotico Penicilline Plasmidica e cromosomale Staphylococcus aureus (p.e. penicillasi; enzimi Enterobatteri di modificazione come metilasi, eisseria gonorrhoeae acetilasi, chinasi e altri) Cloramfenicolo Plasmidica e cromosomale Staphylococcus aureus Enterobatteri Aminoglicosidi Plasmidica Staphylococcus aureus Alterazione del bersaglio Eritromicina Cromosomale Staphylococcus aureus (p.e. RA polimerasi, rifamicina; Rifamicina Enterobatteri ribosoma, eritromicina Streptomicina Enterobatteri e streptomicina; DA girasi, orfloxacina Enterobatteri chinoloni) Staphylococcus aureus Sviluppo di vie biochimiche Sulfonamidi Cromosomale Enterobatteri alternative Staphylococcus aureus Efflusso Tetracicline Plasmidica Staphylococcus aureus Cloramfenicolo Cromosomale Bacillus subtilis mica di resistenza. Per esempio, molti patogeni sviluppano resistenza ai farmaci sulfonamidici (si vedano par e fig ); le sulfonamidi inibiscono la produzione di acido folico nei batteri, ma i batteri resistenti hanno modificato il proprio metabolismo in modo da poter assorbire dall ambiente l acido folico preformato, annullando la necessità della via metabolica bloccata dal farmaco. (6) L organismo potrebbe essere in grado di trasportare all esterno qualunque antibiotico entri nella cellula (efflusso). ella tabella 14.7 sono riportati alcuni esempi specifici di resistenza batterica agli antibiotici. Com è già stato discusso nel capitolo 10.8, la resistenza agli antibiotici può essere codificata geneticamente dal microrganismo a livello cromosomale, o a livello plasmidico dai cosiddetti plasmidi di resistenza (fattori R); specifici tipi di resistenza hanno normalmente una base genetica localizzata su uno dei due elementi (tab. 14.7). Proprio a causa dell ampia diffusione della resistenza agli antibiotici, è necessario che ogni batterio isolato da materiale clinico venga analizzato per la sensibilità agli antibiotici utilizzando il metodo della concentrazione minima inibente (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) o il metodo della diffusione in agar (si vedano par e figg e 14.11). Alcuni dettagli per stabilire la sensibilità agli antibiotici di isolati clinici sono riportati nel capitolo 24.3 (vol. 2). Meccanismo della resistenza mediata dai plasmidi R In laboratorio, è spesso possibile isolare, da colture sensibili a un antibiotico, delle cellule resistenti. La resistenza di queste cellule è generalmente associata a mutazioni in geni cromosomali. Al contrario, la maggior parte dei batteri resistenti isolati da pazienti contiene i geni di resistenza agli antibiotici sui plasmidi R. Il meccanismo biochimico della resistenza conferita dai plasmidi R è differente da quella conferita da geni cromosomali. ella maggior parte dei casi, la resistenza mediata da geni cromosomali insorge a causa di una modificazione del bersaglio dell antibiotico (per esempio un ribosoma). Al contrario, la resistenza determinata dai plasmidi R è, in molti casi, associata a geni che codificano nuovi enzimi che inattivano l antibiotico (fig ), oppure enzimi che ne prevengono l assunzione o che lo espellono attivamente. Per esempio, sono noti ceppi portatori di plasmidi R che conferiscono resistenza a diversi antibiotici con una struttura contenente unità aminoglicosidiche, quali la streptomicina, la neomicina, la kanamicina e la spectinomicina; tale resistenza è dovuta alla produzione di enzimi che modificano chimicamente questi composti aminoglicosidici, mediante fosforilazioni, acetilazioni o adenilazioni, con alterazione della molecola e perdita della sua attività. el caso della penicillina, la resistenza mediata dal plasmide R è dovuta alla produzione di una penicillasi (blattamasi) che rompe l anello b-lattamico. La resistenza al cloramfenicolo mediata da un plasmide R è dovuta, invece, alla presenza di un enzima che determina l acetilazione dell antibiotico. La presenza, in un singolo plasmide R, di geni che codificano diversi enzimi in grado di inattivare antibiotici differenti, fa sì che molti di essi possano conferire resistenze multiple agli antibiotici. rigine dei plasmidi di resistenza Sebbene non siano disponibili prove dirette sull origine dei plasmidi R che conferiscono una resistenza multipla agli antibiotici, tuttavia, una serie di linee di evidenze indirette suggerisce che i plasmidi R esistessero ancor prima dell avvento degli antibiotici. L ampio uso di antibiotici non ha fatto altro che creare della condizioni selettive per la diffusione dei plasmidi R portatori di uno o più geni di resistenza (si veda il riquadro Il punto su... L uso non medico degli antibiotici). Per esempio, un ceppo di Escherichia coli,

8 ISB RESISTEZA AI FARMACI ATIMICRBICI 419 Il punto su... L uso non medico degli antibiotici egli Stati Uniti e nei paesi sviluppati gli antibiotici sono molto usati, a piccole dosi, al di fuori della pratica clinica, come integratori nell alimentazione degli animali, per stimolarne la crescita e accorciare il tempo necessario per immetterli sul mercato. Per esempio, l aggiunta di 25 milligrammi (mg) di penicillina ogni 500 grammi (g) di mangime per polli fa risparmiare 900 milioni di kg di alimenti ogni anno, perché porta a un incremento di peso molto più rapido. Si ritiene che gli antibiotici agiscano inibendo i microrganismi responsabili delle infezioni di bassa entità e riducendo le conseguenti infiammazioni intestinali dell epitelio, permettendo un assorbimento dei nutrienti più efficace. Questa ipotesi è confermata dagli studi sugli animali germ-free (privi di germi), nei quali l arricchimento degli alimenti con antibiotici non accelera la crescita. La presenza di bassi livelli di antibiotico nei mangimi animali fa sì che, a causa della costante esposizione agli antibiotici, si selezionino microrganismi resistenti. Studi biologico-molecolari su ceppi di Salmonella isolati da polli hanno dimostrato che la resistenza a un dato antibiotico è rapidamente trasmessa, nell intestino, a specie batteriche diverse e perfino a batteri appartenenti a generi diversi. In un altro studio, oltre l 80% dei ceppi di Salmonella isolati da carni in vendita nei supermercati erano resistenti almeno a un antibiotico, e i ceppi più resistenti avevano acquisito almeno tre geni di resistenza. Studi su microrganismi isolati da lavoratori nelle aziende zootecniche, hanno dimostrato che molti di questi individui avevano acquisito resistenza agli agenti antimicrobici utilizzati nei mangimi. Da quanto riportato, appare chiaro che l uso degli antibiotici nell alimentazione degli animali amplia l insieme di microrganismi resistenti agli antibiotici che possono infettare l uomo. Da un altro studio è emerso che alcuni ceppi di Enterococcus faecacium, già resistenti alla maggior parte degli antibiotici, hanno acquisito la resistenza al Synercid, un farmaco relativamente nuovo usato nell uomo per il trattamento selettivo delle infezioni resistenti, a distanza di appena due anni dall approvazione del farmaco da parte della Federal Drug Administration. I ricercatori sospettano che i ceppi resistenti siano derivati da bestiame al quale è stato somministrato, negli ultimi venticinque anni, un analogo del Synercid. Studi a lungo termine su animali alimentati dapprima con mangimi addizionati di antibiotici e poi sottoposti a una dieta priva di antibiotici hanno dimostrato che i batteri resistenti agli antibiotici non scompaiono dall intestino molto rapidamente. I geni di resistenza sono integrati in plasmidi stabili o nei cromosomi della flora intestinale, e, in assenza di controselezione, sono mantenuti per un certo tempo, anche in assenza di antibiotici nei mangimi. L uso non medico degli antibiotici ha, quindi, rafforzato una semplice lezione di ecologia microbica: l ambiente seleziona la specie che meglio si adatta ad esso. Comunque, nella speranza di ridurre la diffusione della resistenza agli antibiotici in Europa, alcuni paesi europei hanno proibito l aggiunta di antibiotici, utilizzati in clinica, nei mangimi animali. L rganizzazione Mondiale della Sanità ha redatto un documento che scoraggia l uso di antibiotici nei mangimi; tuttavia, negli Stati Uniti si continua ancora a fare uso di grandi quantità di antibiotici negli allevamenti di bovini, polli e suini. congelato nel 1946, conteneva un plasmide con geni che conferiscono la resistenza alla tetraciclina e alla streptomicina, sebbene questi antibiotici siano stati introdotti in clinica soltanto molti anni dopo. È stata anche dimostrata l esistenza di ceppi contenenti plasmidi R con geni per la resistenza alle penicilline semisintetiche prima che queste fossero prodotte. Forse di significato ecologico perfino maggiore, è la presenza di plasmidi R che conferiscono resistenza agli antibiotici in alcuni batteri del suolo Gram-negativi non patogeni; in questo caso, i plasmidi di resistenza potrebbero dare vantaggi selettivi a quegli organismi che sono i maggiori produttori di antibiotici (Streptomyces, Penicillium) e che sono comuni organismi del suolo. Quindi, sembra che i plasmidi R non siano un fenomeno recente, bensì esistessero nella popolazione microbica naturale prima ancora che venissero scoperti e usati gli antibiotici in medicina e in agricoltura. Più tardi, il vasto impiego degli antibiotici in campo medico e agricolo ha fornito le condizioni ideali per la loro diffusione. Quindi, i plasmidi R sono la prevedibile conseguenza della selezione naturale. Essi pongono dei limiti importanti al trattamento prolungato con un qualsiasi antibiotico usato come efficace agente chemioterapico. Diffusione della resistenza ai farmaci antimicrobici L uso inappropriato ed esagerato di farmaci antimicrobici sta portando a un rapido sviluppo, nei microrganismi patogeni, di resistenze specifiche a tali sostanze. La scoperta e l impiego in clinica di molti antibiotici è andata di pari passo con la comparsa di batteri resistenti alla loro azione. Ci sono numerosi esempi di uso esagerato di antibiotici e concomitante sviluppo di resistenza. ella figura 14.25a è illustrata la correlazione fra le tonnellate di antibiotici usati e la percentuale di batteri resistenti a ogni antibiotico. I farmaci prescritti per il trattamento di una particolare infezione vengono cambiati sempre più frequentemente a causa dell aumentata resistenza sviluppata dai microrganismi patogeni. Un esempio classico è lo sviluppo di resistenza alla penicillina da parte di eisseria gonorrhoeae, il batterio responsabile della gonnorrea (fig b). ggi la penicillina non è più usata per il trattamento della gonorrea, poiché una larga percentuale di isolati clinici produce la b-lattamasi ed è resistente all antibiotico. Tutti i ceppi resistenti si sono sviluppati a partire dal L attuale farmaco d elezione è il ceftriaxone, ma, per limitare gli effetti dei geni di resistenza che rapidamente compaiono ( vol.

9 420 Capitolo 14 CTRLL DELLA CRESCITA MICRBICA ISB Percentuale di ceppi fecali resistenti di. gonorrhoeae (b) 9% 8% 7% 6% 5% 4% 3% 2% 1% 0% Percentuale di ceppi fecali resistenti (a) Gentamicina Acido nalidixico Uso dell antibiotico (tonnellate) Anno 2, cap ), è consigliabile modificare i protocolli terapeutici quasi tutti gli anni. umerose indagini fatte in tutto il mondo suggeriscono che gli antibiotici sono usati nella pratica clinica molto più spesso di quanto sia necessario. I dati indicano che il trattamento con antibiotici è giustificato per il 20% degli individui in cui è diagnosticata una malattia infettiva. Tuttavia, gli antibiotici sono prescritti nell 80% dei casi; inoltre nel 50% dei casi le dosi raccomandate e la durata del Cloramfenicolo Ampicillina Sulfonamidi Kanamicina Streptomicina Figura Comparsa dei batteri resistenti agli antibiotici. (a) Relazione tra uso di antibiotici e percentuale di batteri isolati da pazienti affetti da diarrea resistenti all antibiotico. Si noti come gli antibiotici maggiormente utilizzati, come indicato dalla quantità prodotta commercialmente, siano quelli per i quali i ceppi resistenti sono più frequenti. (b) Percentuale di casi dichiarati di gonorrea provocata da ceppi resistenti agli antibiotici. Il numero effettivo di casi resistenti riportato nel 1985 era Questo numero è salito a nel Più del 95% dei casi resistenti riportati sono dovuti a ceppi di eisseria gonorrhoeae che producono penicillasi. Dal 1990, a causa della comparsa di ceppi resistenti, la penicillina è stata sconsigliata per il trattamento della gonorrea. (Fonte: Centers for Disease Control, Atlanta, GA). Tetraciclina trattamento non sono corretti. Tutto questo è aggravato dalla mancata collaborazione dei pazienti: infatti, molti di essi non portano a termine la terapia, ma smettono di assumere i farmaci, soprattutto gli antibiotici, appena si sentono meglio. Per esempio, la comparsa di tubercolosi resistente alla isoniazide è collegata al fatto che spesso i pazienti non continuano la cura orale per il tempo stabilito dalla prescrizione, che va dai sei fino ai nove mesi ( vol. 2, cap. 27.5). In questo modo, i patogeni virulenti sono soggetti a dosi subletali di antibiotico per un breve periodo di tempo, favorendo la comparsa di organismi resistenti. Proprio a causa dell uso inappropriato e dell assenza di monitoraggio della terapia antibiotica, quasi tutti i microrganismi patogeni hanno sviluppato resistenza ad alcuni agenti antimicrobici da quando è iniziata, negli anni cinquanta del secolo XX, un applicazione su vasta scala della chemioterapia antibatterica (fig ). La penicillina e i sulfamidici, i primi agenti chemioterapici di larga applicazione, oggi non sono più molto utilizzati poiché molti patogeni hanno acquisito resistenza verso di essi. Perfino gli organismi che sono ancora sensibili alla penicillina, come Streptococcus pyogenes (il batterio responsabile delle placche alla gola, della scarlattina e della febbre reumatica; vol. 2, cap. 27.2), necessitano oggi di dosi molto più elevate di antibiotico per ottenere un trattamento efficace, rispetto a una decina di anni fa. Ci sono poi altri impieghi indiscriminati e non essenziali che contribuiscono alla comparsa di ceppi resistenti agli antimicrobici. Per esempio, gli antibiotici sono usati in zootecnia sia come additivi nell alimentazione degli animali per favorirne la crescita, sia come misura profilattica Legenda: Gram-negativi Gram-positivi Gram-positivi/ acido resistenti Salmonella sp. Shigella dysenteriae Altri batteri Gram-negativi aemophilus influenzae eisseria gonorrhoeae Pseudomonas aeruginosa* Shigella sp. Staphylococcus aureus Acinetobacter sp. Enterococcus faecalis* Streptococcus pneumoniae Mycobacterium tuberculosis* aemophilus ducreyi Salmonella typhi Figura Comparsa della resistenza agli antibiotici in alcuni patogeni umani. Il simbolo * indica che alcuni ceppi multiresistenti di questi organismi, non sono attualmente aggredibili con i farmaci antimicrobici noti.

10 ISB LA RICERCA DI UVI FARMACI ATIMICRBICI 421 (per prevenire la comparsa di malattie piuttosto che per curare quelle in corso). umerose epidemie di infezioni alimentari sono state attribuite all uso di antibiotici nei mangimi per animali. Lo sviluppo di resistenze ai farmaci potrebbe essere il risultato di un sovraccarico di antibiotici nei vari ambienti. Per esempio, i fluorochinoloni sono stati utilizzati come additivi alimentari e come agenti per la profilassi negli allevamenti soltanto per dieci anni, tuttavia è stato un impiego sufficiente a indurre la comparsa di ceppi di Campylobacter jejuni resistenti al farmaco, probabilmente per l abitudine di trattare interi allevamenti di gallinacei con fluorochinoloni allo scopo di prevenire malattie respiratorie. Gli allevatori di pollame e i produttori di farmaci si stanno imponendo delle linee guida volontarie per controllare l uso zootecnico di fluorochinoloni di seconda generazione allo scopo di prevenire la rapida comparsa di organismi resistenti. La resistenza ai farmaci può essere minimizzata se un dato agente chemioterapico è utilizzato soltanto per il trattamento di infezioni suscettibili ed è somministrato in dosi sufficientemente alte e per tempi sufficientemente lunghi da ridurre la popolazione microbica prima che possano comparire dei mutanti. Il problema della resistenza può essere eliminato con l addestramento sia del medico sia del paziente. Il fenomeno della resistenza può anche essere minimizzato combinando due agenti chemioterapici non correlati, poiché è probabile che un ceppo mutante resistente a un antibiotico sia ancora sensibile all altro. Tuttavia, con l aumentare della prevalenza di fattori R che conferiscono resistenza multipla ai farmaci nei batteri patogeni, la terapia antibiotica multipla come utile stratagemma nella pratica clinica, si sta dimostrando sempre meno attraente. Alcuni dati suggeriscono che se l utilizzo di un particolare antibiotico è interrotto, dopo un certo tempo non si osserverà più la resistenza a quella sostanza. Quest informazione implica che la resistenza possa essere reversibile e che l efficacia di alcuni antibiotici possa essere ristabilita sospendendone l uso per un certo periodo di tempo, dopo il quale la loro reintroduzione deve essere seguita attentamente con un piano di controllo per un uso accorto. Infine, come discuteremo di seguito, vengono costantemente prodotti nuovi agenti chemioterapici utilizzando diversi metodi per scoprire e progettare nuovi farmaci Verifica Un importante effetto collaterale dell uso di agenti chemioterapici antimicrobici è lo sviluppo di resistenza da parte dei microrganismi bersaglio. In molti casi, la resistenza è il risultato della selezione di geni di resistenza esistenti a causa dell uso improprio e indiscriminato del farmaco. Quindi, molti degli agenti antimicrobici rivelatisi di grande utilità nel passato, non risultano più essere tali: qualche organismo ha sviluppato resistenze verso tutti gli agenti antimicrobici noti, facendo temere un ritorno all era preantibiotica, quando le malattie infettive non potevano essere trattate in alcun modo. Quali sono le ragioni per cui compare resistenza agli antibiotici? Quali provvedimenti pratici dovrebbero essere presi per rallentare lo sviluppo della resistenza agli antibiotici? La ricerca di nuovi farmaci antimicrobici Un uso moderato e corretto degli antibiotici è assolutamente necessario per prolungare nel tempo l utilità clinica di questi farmaci. Tuttavia, la soluzione di lungo termine alla resistenza sviluppata dai microrganismi patogeni è lo sviluppo di nuovi farmaci antimicrobici attraverso alcune tecniche specifiche, qui di seguito illustrate. uovi analoghi di composti antimicrobici esistenti La produzione di nuovi analoghi di composti antimicrobici esistenti è generalmente semplice ed efficiente, in larga parte perché i nuovi composti, che sono dal punto di vista strutturale imitazioni di sostanze già note, possiedono un meccanismo d azione prevedibile. In molti casi, si possono cambiare dei parametri, quali la solubilità e l affinità, introducendo delle modificazioni minime alla struttura chimica di un farmaco senza alterarne conformazioni fondamentali per la sua attività. Il nuovo composto potrebbe essere effettivamente più potente di quello di partenza, e poiché la resistenza è spesso basata sul riconoscimento di una certa struttura, esso potrebbe evadere l azione dei fattori di resistenza. Per esempio, nella figura è illustrata la struttura base della tetraciclina e di due suoi derivati biologicamente attivi. Usando la tetraciclina come composto guida, possono essere fatte sostituzioni chimiche sistematiche ai quattro siti del gruppo R, generando una serie, quasi senza fine, di analoghi della tetraciclina. Utilizzando questa strategia di base, vengono sintetizzati e testati di routine nuovi antibiotici b-lattamici (si veda par. 14.8), nuovi composti simili alla tetraciclina (par. 14.9) e nuovi analoghi della vancomicina (fig ), che sono fino a 100 volte più potenti dei composti di partenza. L applicazione di metodi chimici automatizzati e robotizzati per la scoperta di farmaci, ha aumentato incredibilmente la nostra capacità di generare rapidamente potenziali nuovi composti antimicrobici. I metodi automatizzati robotizzati, noti come chimica combinatoriale, modificano, in maniera sistematica, prodotti antimicrobici noti allo scopo di generare un largo numero di nuovi analoghi. Per esempio, utilizzando la chimica combinatoriale e partendo dalla tetraciclina come composto guida (fig ), possono essere usati cinque reagenti diversi per introdurre sostituzioni ai quattro differenti gruppi R. I siti sostituiti darebbero 5 x 5 x 5 x 5 (cinque derivati di ognuno dei quattro siti), o 725 derivati diversi della tetraciclina, utilizzando soltanto cinque reagenti e tutto in poche ore! Questi composti possono, quindi, essere saggiati in vitro per verificarne l attività biologica su organismi diversi, sempre utilizzando tecniche automatizzate. I processi di sintesi e di screening automatizzati hanno notevolmente ridotto il tempo con cui vengono scoperti nuovi farmaci e aumentato di 10 volte o

11 422 Capitolo 14 CTRLL DELLA CRESCITA MICRBICA ISB più il numero di nuovi candidati, per l uso farmacologico, identificati ogni anno. Secondo le stime delle industrie farmaceutiche, devono essere saggiati circa 7 milioni di possibili candidati per poter identificarne uno utilizzabile come farmaco nella pratica clinica. Come abbiamo appena discusso, questo processo inizia con la sintesi, l isolamento e lo screening di possibili candidati. Lo screening comprende saggi in vitro normalmente usati per determinare la suscettibilità agli antibiotici (si veda par. 14.4); in seguito, i composti che si sono rivelati attivi in laboratorio, devono essere saggiati per l efficacia e la tossicità in animali e infine nella sperimentazione clinica, sull uomo. I saggi sugli animali richiedono, generalmente, diversi anni e fasi sperimentali multiple, per assicurarsi che il farmaco in oggetto sia efficace e sicuro da usare. Per queste stesse ragioni, le sperimentazioni cliniche per ogni nuovo farmaco si protraggono per anni. La scoperta di un nuovo chemioterapico e il suo sviluppo richiedono generalmente dai 10 ai 25 anni prima che possa essere approvato per un uso clinico. Il costo di tutte queste fasi, per ogni nuovo farmaco approvato, è stimato intorno ai 500 milioni di dollari. Progettazione computerizzata di farmaci Composti veramente nuovi sono molto più difficili da identificare rispetto agli analoghi di farmaci già esistenti; infatti, le nuove sostanze devono funzionare a livello di siti unici nel metabolismo e nella biosintesi, o essere strutturalmente diversi dai composti esistenti per superare le resistenze già sviluppate. Per trovare questi nuovi composti, i possibili candidati dovevano essere isolati da fonti naturali e saggiati in maniera sistematica per l attività antimicrobica. Tuttavia, i recenti progressi nella tecnologia grafica strutturale computerizzata permettono di disegnare molecole in modo tale che interagiscano con strutture note specifiche del microrganismo; quindi, oggi, la scoperta di nuovi farmaci inizia al computer, dove possono essere creati rapidamente e saggiati per la capacità di legarsi al bersaglio e la tossicità, a costi relativamente bassi ( vol. 2, cap e 27.8). Uno dei successi più importanti ottenuti in questo modo è stato lo sviluppo del saquinavir, un inibitore della proteasi di IV, che è utilizzato per rallentare la moltiplicazione del virus negli individui infetti (fig ). La proteasi di IV taglia un precursore proteico, codificato dal virus, per produrre il capside maturo e attiva la trascrittasi inversa necessaria per la replicazione ( vol. 2, cap ). Il saquinavir è stato disegnato al computer in modo tale che si adattasse al sito attivo della proteasi di IV, sulla base della struttura tridimensionale nota del complesso proteasi-substrato. Esso è un analogo peptidico che sostituisce il precursore proteico di IV, inibendo la maturazione del virus e rallentando la moltiplicazione virale nell ospite. Per il trattamento dell AIDS sono in uso numerosi altri inibitori della proteasi virale, progettati al computer come appena illustrato per il saquinovir (tab. 14.5, fig , vol. 2, cap ). Come dimostrato dall esempio appena descritto, la progettazione al computer basata su modelli molecolari e biochimici ( mo- (a) (b) 2 Saquinavir C(C 3 ) 2 Indinavir C(C 3 ) 2 Figura Farmaci antivirali generati utilizzando programmi di creazione di modelli molecolari computerizzati ( molecular modelling ). (a) modimero della proteasi di IV. Le singole catene polipeptidiche sono mostrate in verde e blu. Un peptide (giallo) è legato dal sito catalitico. Questa proteasi taglia un precursore proteico di IV, una tappa fondamentale per la maturazione del virus ( vol. 2, cap ). Il blocco del sito della proteasi da parte del peptide inibisce il processamento del precursore e, quindi, la maturazione di IV. Questa struttura è derivata dalle informazioni presenti nella Banca Dati delle Proteine (Protein Data Bank), (b) Questi farmaci anti-iv sono analoghi peptidici disegnati dal computer per bloccare il sito attivo della proteasi di IV. Le aree evidenziate in arancione rappresentano le regioni analoghe ai legami peptidici. Il legame di questi composti da parte della proteasi di IV previene il processamento del precursore e la maturazione del virus. Questi sono composti rappresentativi di una classe di sostanze terapeutiche note come inibitori della proteasi (PI). La concentrazione raggiunta nelle cellule infettate da IV, insieme con l elevata affinità per la proteasi virale, li rende inibitori competitivi molto potenti per i siti attivi dell enzima tanto da bloccare il processamento del precursore e la maturazione virale. Questi inibitori delle proteasi sono largamente usati per il trattamento delle infezioni da IV (si veda tab e vol. 2, cap ).

12 ISB LA RICERCA DI UVI FARMACI ATIMICRBICI 423 lecula modelling ) è un metodo pratico, rapido e relativamente poco costoso per disegnare nuovi farmaci antimicrobici Verifica Per risolvere il problema degli organismi resistenti ai farmaci e incrementare l efficacia del trattamento delle malattie infettive, vengono costantemente ricercate e sviluppate nuove sostanze antimicrobiche. Tuttavia, questa è un operazione che richiede molto tempo ed è anche piuttosto costosa. La progettazione di un farmaco con programmi computerizzati è oggi un importante strumento per la ricerca di nuovi chemioterapici. Gli analoghi di farmaci già esistenti sono spesso sviluppati per essere usati come composti antimicrobici di nuova generazione. Esponete i vantaggi e gli svantaggi di questa strategia per il trattamento di malattie infettive. Come può la progettazione computerizzata dei farmaci far risparmiare tempo e denaro nella ricerca di nuovi composti chemioterapici? Domande 1. Perché il tempo di riduzione decimale (D) è importante nella sterilizzazione? Come interferisce la presenza di endospore con la D? 2. Descrivete gli effetti a livello molecolare delle radiazioni ionizzanti letali. 3. Quali sono i maggiori vantaggi dell uso delle membrane filtranti rispetto ai filtri a spessore? 4. Perché i filtri tipo nucleopore sono particolarmente utili per la preparazione di campioni per microscopia? 5. Qual è la procedura da seguire per ottenere la minima concentrazione inibente (MIC) per una sostanza chimica con attività battericida per Escherichia coli? 6. Evidenziate le differenze tra l attività dei disinfettanti e quella degli antisettici. Perché i disinfettanti non possono essere normalmente usati su tessuti viventi? 7. Gli analoghi dei fattori di crescita sono generalmente distinti dagli antibiotici da un singolo importante criterio. Descrivetelo. 8. La maggior parte degli antibiotici sono prodotti soltanto da certi gruppi di organismi. È vera questa affermazione? Quali sono i gruppi di organismi che producono antibiotici? 9. Descrivete il meccanismo d azione che caratterizza un antibiotico b-lattamico. 10. Descrivete almeno tre modi diversi attraverso i quali alcuni antibiotici inibiscono la sintesi proteica, indicando per ognuno l agente chemioterapico coinvolto. 11. Perché generalmente i farmaci antivirali mostrano tossicità verso l ospite? 12. Definite i bersagli specifici dei funghi che permettono di usare agenti chemioterapici con tossicità selettiva per questi microrganismi. 13. Delineate i meccanismi principali della resistenza agli antibiotici 14. Qual è l origine più lontana dei geni della resistenza nei batteri? 15. Partendo da un dato composto, descrivete i metodi di chimica combinatoriale utilizzati per la produzione di nuovi analoghi farmacologici. Problemi 1. Rappresentate con un grafico i risultati che vi aspettereste dalla determinazione del tempo di riduzione decimale di un organismo molto sensibile al calore. Come sarebbe influenzato l andamento del grafico se le cellule vegetative fossero sensibili al calore, ma l organismo formasse delle endospore ad esso resistenti? 2. Quali sono i potenziali svantaggi dell uso delle radiazioni per la conservazione degli alimenti? Ritenete che questi svantaggi si possano rivelare un pericolo per la salute? Perché? Che distinzione fareste tra alimenti danneggiati dalle radiazioni e alimenti contaminati da radiazioni? 3. La filtrazione è un mezzo soddisfacente di pastorizzazione di alcuni liquidi. Progettate un sistema di filtrazione per la pastorizzazione di un liquido sensibile al calore. Perché si dovrebbe preferire tale sistema rispetto al sistema di pastorizzazione con calore? 4. Progettate un esperimento che vi permetta di distinguere tra un agente citocida e uno citostatico. Potete usare il saggio della concentrazione minima inibente (MIC) nei vostri esperimenti? Spiegate. 5. Quali saggi eseguireste per decidere se un agente chimico può essere usato come antisettico? E come disinfettante? Alcune sostanze chimiche sono utilizzate per entrambi gli scopi. Descrivete le proprietà di questi composti e fate alcuni esempi. 6. Sebbene gli analoghi dei fattori di crescita possano inibire il metabolismo microbico, soltanto pochi di questi agenti sono usati nella pratica. Molti potenziali agenti, e alcuni di largo impiego come l azidotimidina (si veda tab. 14.5), mostrano una tossicità significativa per l ospite. Descrivete un analogo di fattore di crescita che sia efficace e abbia una bassa tossicità per le cellule ospiti. Perché la tossicità dell agente che avete scelto è bassa? Descrivete anche un analogo di fattore di crescita che sia efficace contro una data malattia infettiva ma sia tossico per le cellule ospiti. Perché un agente tossico come

13 424 Capitolo 14 CTRLL DELLA CRESCITA MICRBICA ISB l AZT potrebbe essere ancora usato in certe situazioni per trattare malattie infettive? Quali precauzioni prendereste per limitare gli effetti tossici di tale farmaco e massimizzarne l efficacia terapeutica? Spiegate le vostre risposte. 7. Meno dell 1% di tutti gli antibiotici conosciuti ha valore pratico o per la ricerca o in campo clinico. Indicate il motivo di questa affermazione. Pensate che sia importante espandere e continuare le ricerche per scoprire nuovi antibiotici? Quali alternative disponibili ci sono, o ci potrebbero essere, all uso degli antibiotici per il trattamento delle malattie infettive nell uomo? 8. Progettate un esperimento che vi permetta di determinare se un microrganismo possa produrre un nuovo antibiotico. Quale gruppo o gruppi di microrganismi scegliereste? Dove potreste trovare e isolare questi organismi in un ambiente naturale? Quali vantaggi fornirebbe in natura, a questi organismi, la produzione di un antibiotico? Quali metodi in vitro usereste per saggiare l efficacia del potenziale nuovo antibiotico? (Si consiglia di consultare vol. 2, capp e 31.5). 9. Sebbene gli antibiotici b-lattamici dimostrino una chiara tossicità selettiva per i Batteri, molti di questi sono naturalmente resistenti ai loro effetti. Senza considerare i geni di resistenza batterici, spiegate perché i batteri Gram-negativi sono resistenti agli effetti della maggior parte degli antibiotici b-lattamici, ma non a tutti. Spiegate anche perché alcuni antibiotici b-lattamici sono utili contro questi organismi. 10. Quali potenziali vantaggi potrebbero avere le aminoglicosidi, i macrolidi e le tetracicline rispetto alla penicillina G in chemioterapia? Spiegate. 11. Elencate le caratteristiche di un farmaco antivirale ideale con particolare riguardo alla tossicità selettiva. Esiste un farmaco di questo tipo? Quali fattori potrebbero limitarne l uso? 12. Come i virus, i funghi presentano problemi chemioterapeutici speciali. Spiegate i problemi inerenti alla chemioterapia per entrambi i gruppi ed esprimete un vostro parere sulle precedenti affermazioni. Fate esempi specifici e suggerite almeno un gruppo di agenti chemioterapici che potrebbero funzionare su entrambi i tipi di infezione. 13. Spiegate le basi genetiche della resistenza acquisita agli antibiotici b-lattamici in Staphylococcus aureus. Progettate una serie di esperimenti per annullare la resistenza agli antibiotici b-lattamici. Ritenete che questo sia fattibile? Il vostro esperimento può essere applicato sul campo per selezionare negativamente gli organismi resistenti agli antibiotici? Spiegate. 14. Disegnate un farmaco che inibisca l attività della proteasi di IV basandovi sulla struttura mostrata nella figura Come base di partenza, pensate a un meccanismo diverso dalla competizione per il sito attivo dell enzima.