Hanno realizzato le attività sperimentali e lo studio: Referente scientifico:

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1 - Istituto Sperimentale Italiano Lazzaro Spallanzani - Milano Studio sull origine embrionale dell infertilità bovina Rapporto di ricerca Dicembre

2 Sperimentazione condotta nell ambito del progetto di ricerca N. 868 Studio sull origine embrionale dell infertilità bovina finanziato con il Piano per la ricerca e lo sviluppo 2005 della Regione Lombardia, DG Agricoltura. Hanno realizzato le attività sperimentali e lo studio: Istituto Sperimentale Italiano Lazzaro Spallanzani CIZ Srl, Consorzio per l Incremento Zootecnico, Laboratorio di Tecnologie della Riproduzione Referente scientifico: prof. Cesare Galli, Istituto Sperimentale Italiano Lazzaro Spallanzani Per informazioni: Regione Lombardia Direzione Generale Agricoltura U.O. Programmazione, interventi e ricerca per le filiere agroindustriali Struttura ricerca e innovazione tecnologica Via Pola 12/ MILANO Tel 02/ fax 02/ e.mail agriricerca@regione.lombardia.itt 2

3 Report scientifico sull attività sperimentale Studio sull origine embrionale dell infertilità bovina. (Embryofert) data inizio del progetto , durata del progetto 1 anno La riduzione della fertilità nell allevamento bovino sta assumendo proporzioni preoccupanti. La percentuale di non ritorno a seguito di inseminazione artificiale è scesa di circa l 1% all anno negli ultimi 10 anni. Poiché la maggior parte delle perdite di gravidanza si verifica durante il periodo embrionale preimpianto e generalmente entro il quattordicesimo giorno dalla fecondazione, l obiettivo del progetto è stato quello di stabilire se il grado di consanguineità possa influire sullo sviluppo embrionale e quindi sulla fertilità.il disegno sperimentale è stato articolato in due moduli. Nel primo sono stati confrontati embrioni incrocio (crossbred) e embrioni di razza pura (purebred) cresciuti in vitro per circa una settimana fino allo stadio di blastocisti. Nel secondo il confronto tra i due tipi di embrioni è stato esteso alla seconda settimana di sviluppo trapiantando gli embrioni di sette giorni in riceventi temporanee e raccogliendoli con un lavaggio uterino in giorno 12. Modulo1 Gli ovociti utilizzati per questi esperimenti sono stati raccolti esclusivamente da ovaie di bovine frisone macellate. In ogni esperimento gli ovociti raccolti sono stati maturati in vitro, successivamente suddivisi in due gruppi e fecondati parallelamente con tori bruni o frisoni in prova di progenie ottenendo rispettivamente embrioni incrocio (crossbred) o di razza pura frisona (purebred). In ogni esperimento sono stati valutati i seguenti parametri relativi allo sviluppo e indicativi della qualità embrionale: - percentuale di segmentazione a 30 ore dalla fecondazione - percentuale complessiva di segmentazione - compattazione degli embrioni in giorno 6 - percentuale di blastocisti in giorno 7 e 8 Gli embrioni ottenuti sono stati sottoposti ad una colorazione differenziale delle cellule della massa embrionale e del trofoblasto e ad analisi per valutare l attività metabolica mediante misurazione del turnover degli aminoacidi. Parallelamente è stata analizzata l espressione genica di gruppi di embrioni in giorno 7 considerando alcuni geni determinanti per lo sviluppo e il metabolismo embrionale, tra i quali: - geni implicati nello sviluppo pre e post impianto: FGF4, gp130, PED, INF-τ - geni relativi al metabolismo: GLUT-5, MnSOD, IGFrI - geni correlati all apoptosi e allo stress ossidativo, Bax, G6PDH Modulo2 Dieci bovine di razza frisona sono state sottoposte a prelievo di ovociti mediante ovum pick up. Il prelievo è stato ripetuto 8 volte ogni due settimane e gli ovociti raccolti sono stati alternativamente fecondati con gli stessi tori bruni utilizzati nel modulo 1 o con il padre della bovina donatrice ottenendo rispettivamente embrioni incrocio (crossbred) ed embrioni di razza pura inbred (purebred-inbred). Lo sviluppo embrionale è stato valutato in vitro fino al settimo giorno, successivamente gli embrioni ottenuti sono stati trasferiti in gruppo in riceventi al settimo giorno post ovulazione e raccolti con lavaggio uterino in giorno 12. Gli embrioni raccolti sono stati valutati e misurati individualmente.

4 RISULTATI E DISCUSSIONE Modulo1 Produzione e valutazione dello sviluppo degli embrioni crossbred e purebred Complessivamente sono stati maturati 2274 ovociti, raccolti esclusivamente da ovaie di bovine frisone. Per ridurre la variabilità legata alla qualità delle ovaie, gli ovociti raccolti in ogni esperimento sono stati divisi in due gruppi, maturati e successivamente fecondati rispettivamente con il toro bruno o frisone per ridurre la variabilità legata alla qualità dell ovocita. L esperimento è stato ripetuto 6 volte utilizzando sempre tori diversi, complessivamente 1135 ovociti sono stati fecondati con 6 diversi tori frisoni e 1139 con 6 diversi tori bruni, ottenendo un totale di 262 embrioni purebred e 281 embrioni crossbred. I dati relativi alla divisione e allo sviluppo sono indicati rispettivamente nelle tabelle 1 e 2 Nonostante la percentuale di divisione sia leggermente più alta nel gruppo degli embrioni frisoni (78,79% vs 74,35%), gli altri parametri esaminati dimostrano che gli embrioni crossbred si dividono più rapidamente degli embrioni di razza pura (28,78% vs 26,41%), hanno una più alta percentuale di sviluppo sia in giorno 7 (24,13% vs 19,92%) che in giorno 8 (34,79% vs 27,93%) ed è stata rilevata differenza statisticamente significativa nella compattazione degli embrioni in giorno 6 (30,04% vs 26,01%). Tab.1 Percentuale di divisione complessiva e a 30 ore dalla fecondazione. Tipo di embrione Numero totale di segmentazione a 30 h Totale ovociti ovociti post IVF segmentati Purebred (26,41 %) 898 (78,79 %) Crossbred (28,78 %) 847 (74,35 %) Tab.2 Sviluppo comparato di embrioni crossbred e purebred Tipo di embrione Numero totale di ovociti divisi Morule compatte in giorno 6 Blastocisti in giorno 7 Blastocisti in giorno 8 Purebred (26,01 %) a 170 (19,92 %) 262 (27,93 %) Crossbred (30,04 %) b 177 (24,13 %) 281 (34,79 %) a, b Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative (Ttest p<0,05) Conta differenziale delle cellule Non sono state rilevate differenze significative nel numero di cellule che costituiscono l embrione nei due gruppi e nemmeno nel rapporto tra i due tipi cellulari presenti nel nella blastocisti e cioè le cellule del trofoblasto (troph) e del nodulo embrionale (ICM). Grafico 1

5 PB CB ICM Troph Total PB purebred CB crossbred Valutazione del turnover degli aminoacidi Nell embrione gli aminoacidi hanno un ruolo essenziale in molti processi metabolici nei quali vengono utilizzati come fonte di energia e come precursori per la sintesi proteica e degli acidi nucleici. Dato che periodo in cui la sintesi proteica aumenta corrisponde allo stadio in cui la morula compatta (Morris et al., Reproduction (2002) 124, ) gli embrioni ottenuti sono stati prelevati dal medium di coltura in giorno 6 e incubati per 16 ore in medium contente aminoacidi essenziali e non essenziali. Dopo la rimozione dell embrione il medium è stato quindi sottoposto ad analisi cromatografica per misurare la produzione e la deplezione dei singoli aminoacidi (grafico2). Sono state riscontrate alcune differenze significative nelle variazioni dei singoli amminoacidi, ma non nel turnover complessivo degli stessi (grafico 3).

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7 Analisi dell espressione genica L espressione genica è stata analizzata su gruppi di 15 embrioni in giorno 7 allo stadio di blastocisti ed è illustrata nel grafico 4. Secondo l'analisi statistica con il Student Ttest 3 geni risultano significativamente più espressi nei crossbred rispetto ai purebred : MnSOD, gp130 ed FGF4. MnSOD è una superossidodismutasi ed è indicativa dell attività mitocondriale. Dati presenti in letteratura (Lonergan et al., Biology of Reproduction (2003) 69, ) dimostrano che il livello di MnSOD è correlato positivamente alla vitalità embrionale indicando perciò una maggiore vitalità degli embrioni crossbred rispetto ai purebred. Gp130 è una glicoproteina che costituisce parte del recettore del LIF. Sia gp130 che l FGF4 sono due geni implicati nelle fasi di preimpianto, impianto e post-impianto. Embrioni murini KO per gp130 muoiono tra il giorno 12 e il termine della gravidanza e studi precedenti hanno dimostrato un espressione aberrante dell FGF4 negli embrioni NT (Daniels et al., Mol Repr Dev (2001) 60 (3), ). Un maggiore livello di espressione negli embrioni crossbred potrebbe renderli più competenti allo sviluppo pre, postimpianto e all impianto stesso. Un altro gene analizzato è il PED, Preimplantation Embryo Development gene, che regola la crescita embrionale nel periodo pre-impianto. Un recente lavoro ha dimostrato che la vitalità embrionale è correlata positivamente con l espressione di PED (Fair et al., Biology of Reproduction (2004), 70, ). Anche in questo caso gli embrioni crossbred mostrano un espressione di questo gene leggermente più alta rispetto ai purebred. Un altro gene più espresso negli embrioni crossbred è la connessina 43 (Cx43). Si tratta di una proteina implicata nella comunicazione cellulare ed il livello di espressione è positivamente correlato con la criotolleranza degli embrioni. Altri geni analizzati mostrano un espressione simile in entrambi i gruppi, è il caso di Glut5, implicato nel trasporto e metabolismo del glucosio, IGFr1 indicativo del legame con i fattori di crescita e per INFt gene responsabile del riconoscimento della gravidanza. Un altro dato rilevante è fornito dall espressione dei due geni legati allo stress e all apoptosi, Bax e G6PDH; in particolare Bax è un gene pro-apoptotico e G6PDH è indicato come sentinella dello stress ossidativo. Entrambi sono maggiormente espressi negli embrioni purebred indicando una condizione di minor tolleranza dello stress come già dimostrato in letteratura in esperimenti in cui venivano confrontati embrioni di diversa origine e vitalità(lonergan et al., Biology of Reproduction (2003) 69, ).

8 Grafico 4. Espressione genica degli embrioni purebred e crossbred 1,4 1,2 1 0,8 0,6 * PB CB 0,4 0,2 * * 0 MnSod Ped Glut5 gp130 FGF4 IGFrI INFt Cx43 Bax G6PDH Modulo 2 Produzione e confronto dello sviluppo degli embrioni crossbred ed inbred purebred in giorno 7. Complessivamente sono stati prelevati e maturati 1628 ovociti dei quali 815 sono stati fecondati con 4 diversi tori bruni scelti tra quelli già utilizzati nel modulo 1 e 813 sono stati fecondati con i padri delle rispettive donatrici. Lo sviluppo è stato seguito in vitro individualmente per ogni donatrice valutando le percentuali di divisione, compattazione in giorno 6 e sviluppo in giorno 7. Gli embrioni che in giorno 7 hanno raggiunto lo stadio di blastocisti sono stati trasferiti in gruppo in una ricevente sincronizzata diversa in ogni esperimento, questo si è reso necessario perché in prove preliminari il riutilizzo della stessa ricevente si è presentato problematico a causa dello scarso recupero degli embrioni. Gli embrioni rimanenti sono stati mantenuti in vitro fino all ottavo giorno per valutare la percentuale di sviluppo. Dai dati ottenuti si osserva che gli embrioni crossbred hanno percentuali di segmentazione (74,34% vs 66,27%) e di sviluppo in giorno 7 (22,97% vs 20,86%) significativamente più altre rispetto agli embrioni purebred-inbred. Anche le percentuali di compattazione in giorno 6 (24,09% vs 21,41%) e di sviluppo in giorno 8 (26,29% vs 24,38%) sono risultate più alte fornendo un quadro complessivo di maggior competenza allo sviluppo degli embrioni crossbred. (Tabella3)

9 Tabella 3 Tipo di embrione Numero totale di ovociti Numero totale di ovociti divisi Morule compatte in giorno 6 Blastocisti in giorno 7 Blastocisti in giorno 8 Purebred (66,27 %) a 98 (21,41 %) 79 (20,86 %) a 110 (24,38 %) Crossbred (74,34 %) b 138 (24,09 %) 127 (22,97 %) b 155 (26,29 %) a, b Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative (ChiTest p<0,05) Produzione e confronto dello sviluppo degli embrioni crossbred ed inbred purebred in giorno 12 I risultati ottenuti dalle raccolte degli embrioni in giorno 12 confermano quelli ottenuti in vitro, suggerendo una maggiore competenza sia allo sviluppo che presumibilmente al successivo impianto degli embrioni crossbred. Nonostante le percentuali di raccolta siano simili in entrambi i gruppi (51,81% vs 51,51%), facendo quindi supporre un equivalente capacità di sopravvivenza almeno fino al giorno 12, il grado di sviluppo risulta notevolmente diverso. Durante il periodo di preimpianto, approssimativamente dal giorno 12 al giorno 17, il trofoblasto della blastocisti bovina si allunga esponenzialmente ed essa assume progressivamente una morfologia ovoide, tubulare e filamentosa. I risultati delle raccolte mostrano una percentuale significativamente superiore di blastocisti ovoidi nel gruppo degli embrioni crossbred (56,25%) rispetto al gruppo dei purebredinbred nel quale più del 70% delle blastocisti raccolte aveva forma sferica (76,66%). (Tabella 4) Conseguentemente a questo anche le dimensioni medie degli embrioni crossbred sono risultate maggiori rispetto ai purebred-inbred (Tabella 5), senza tuttavia raggiungere differenze statisticamente significative. Tabella 4 Tipo di embrione Numero di embrioni trasferiti Numero di embrioni raccolti Numero di blastocisti ovoidi Numero di blastocisti sferiche Inbred (51,51 %) 7 (23,33 %) b 23 (76,66 %) b Purebred Crossbred (51,81 %) 27 (56,25 %) a 21 (43,75 %) a a, b Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative (ChiTest p<0,05) Tabella 5 Tipo di embrione Lunghezza media Larghezza media Inbred Purebred 0,37 ± 0,45 0,30 ± 0,29 Crossbred 0,49 ± 0,24 0,41 ± 0,18 CONCLUSIONI Il problema dell infertilità nell allevamento bovino da latte è e rimane uno dei principali fattori che determinano la redditività delle aziende. L infertilità ha origini multifattoriali che vanno oltre la mortalità embrionale intrinseca nella qualità dell embrione, e includono cause secondarie imputabili a patologie cliniche e sub-cliniche delle vacche come ad esempio le endometriti o le dismetabolie oppure cause di tipo gestionale come l alimentazione. L ipotesi del progetto embryofert era di

10 verificare se il livello di consanguineità avesse un effetto sulla vitalità dell embrione. Questa ipotesi è stata verificata in due modelli utilizzando tipologie di embrioni ai due estremi opposti per grado di consaguineità e fino al dodicesimo giorno di sviluppo. I dati sperimentali generati nel modulo in vitro hanno dimostrato differenze significative tra le due categorie di embrioni (crossbred e purebred) nello sviluppo in vitro e nell espressione di un panel di geni rilevanti per lo sviluppo e la vitalità embrionale. Anche nel modulo in vivo gli embrioni crossbred hanno dimostrato una maggiore capacità di sviluppo rispetto agli embrioni con un elevato grado di consaguineità (inbred prurebred). Non è escluso che le differenze rilevate in questo studio nella fase preimpianto (fino al giorno 12) siano ulteriormente rilevabili anche nella fase post-impianto con una maggiore percentuale di aborti. Questa ipotesi deve essere verificata in un ulteriore studio con un numero adeguato di embrioni impiantati le cui gravidanze devono essere portate a termine. Un secondo aspetto che riteniamo utili approfondire è quello di verificare l interazione di cause predisponenti o scatenanti (definite come secondarie) con il tipo di embione come ad esempio l infiammazione (endometriti, dismetabolie, ecc), cioè la capacità dell embrione di sopravvivere a condizioni ambientali avverse e quindi le differenze rilevate potrebbero ampliarsi ulteriormente. In conclusione questo studio ha reppresentato un importante inizio nel verificare le diverse e concatenate ipotesi, sulle cause della riduzione della fertilità. I dati prodotti durante l anno di durata del progetto embriofert sono in parte stati presentati al congresso della Società Italiana per il Progresso della Zootecnia ed abbiamo in preparazione un manoscritto che verrà pubblicato su una rivista internazionale.