C. elegans. Cooperazione tra determinanti citoplasmatici e reazioni induttive per specificare il destino dell embrione

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1 C. elegans Cooperazione tra determinanti citoplasmatici e reazioni induttive per specificare il destino dell embrione.allo stadio a 32 blastomeri ogni singola cellula uccisa porta alla mancanza della discendenza

2 Caenorhabditis elegans 1974: Sydney Brenner first introduced Caenorhabditis elegans in the scientific community as a model organism. The nematode has been extensively used as a model system to study cellular biology. One of the most intriguing fields of molecular biology that have been investigated using this model host and that led to the 2002 Nobel Prize in Physiology or Medicine, is programmed cell death.

3 Apoptosis Kuranaga, 2011: evolutionarily conserved method employed by multicellular organisms to maintain tissue homeostasis during development and differentiation; Bailly and Gartner, 2013: it can also serve as a way to prevent growth of cells mutated due to DNA damage.

4 Apoptosi Vogt, 1842: la morte cellulare è parte del normale sviluppo. Lockshin and Williams, 1965: propongono il termine morte cellulare programmata (Programmed Cell Death) osservando che alcune cellule destinate a morire durante la metamorfosi di anfibi e insetti sembrano essere guidate da un programma intrinseco alla cellula stessa. Kerr, Wyllie and Currie, 1972: introducono il termine apoptosi (dal greco antico: come il cadere delle foglie) per descrivere la morte cellulare associata con una serie di caratteristiche morfologiche comuni e ben definite. Horvitz and Sulston, fine degli anni 70: caratterizzazione genetica dei componenti critici che regolano i meccanismi apoptotici utilizzando il nematode C. elegans.

5 Apoptosis in C. elegans About half of all neurons born will die through a preprogrammed suicide mechanism called apoptosis Motor neuron expressing different colored fluorescent proteins in a C. elegans larva. Image courtesy of David Miller, Ph.D., Vanderbilt Department of Cell & Developmental Biology

6 Apoptosis in C. elegans Seven Apoptotic cells (arrows) which appear as raised button objects in a C. elegans embryo are shown. Some apoptotic cells are not visible at this focus plane. Confocal fluorescent image of a wild-type C. elegans embryo (anterior to the left) apoptotic cells with condensed DNA

7 La caratteristica.. unica di questo organismo è rappresentata da un numero costante di cellule: cells

8 Ricerca di mutazioni in cui il pattern di morte cellulare è alterato: identificazione di regolatori apoptotici poi ritrovati anche in mammiferi Ced 9 agisce come freno La clonazione dei geni apoptotici di C. elegans e la loro caratterizzazione hanno permesso di comprendere gli eventi molecolari dell apoptosi e di identificare gli effettori omologhi dei mammiferi ced 4 Apaf 1 ced 9 Bcl-2

9 C. elegans apoptotic genes Ced-9: mutazioni che inattivano ced-9 portano a morte cellulare estesa a tutte le cellule, livelli aumentati di espressione di ced-9 bloccano l apoptosi. Ced-3 e ced-4: mutazioni che li inattivano portano alla conservazione di tutte e 131 le cellule condannate a morte Nei doppi mutanti ced-9/ced-3 la morte cellulare non si verifica: CED-9 agisce a monte di CED-3 inibendo la via apoptotica.

10 Studi genetici in C. elegans Larva appena schiusa con mutazione del gene ced-1 che impedisce la fagocitosi delle cellule morte.

11 Studi genetici in C. elegans Larva appena schiusa con mutazione del gene ced-1 e ced-3. L assenza di cellule morte dimostra che l apoptosi non avviene. La proteina CED-3 è necessaria per l apoptosi.

12 Evolutionary conservation of apoptotic patrhways EGL-1 funziona da attivatore a monte del processo di morte cellulare programmata regolandola positivamente: interagisce direttamente con CED-9 per indurre il rilascio CED-4

13 Il gene bcl-2 è stato isolato in tumori umani Il primo gene per l apoptosi clonato nei mammiferi è stato il gene bcl-2 Promuove la sopravvivenza delle cellule Le proteine Bcl-2 e CED-9 sono omologhe e fungono da proteine regolatrici che inibiscono la via apoptotica

14 La famiglia Bcl-2: regolazione della sopravvivenza e dell apoptosi Adams, J. & Cory, S. (1998). Science 281: Queste proteine possono essere localizzate sulla membrana nucleare, su quella mitocondriale esterna e su quelle del reticolo endoplasmatico

15 Bcl-2 family Geni anti apoptotici Bcl-2 Bcl-XL Geni proapoptotici Bax Bad La sensibilità della cellula agli stimoli apoptotici dipende dall equilibrio dei due gruppi

16 Perché una cellula dovrebbe suicidarsi?

17 A volte la morte cellulare rappresenta un evento positivo per l organismo 1. L apoptosi é richiesta per un normale sviluppo embrionale 2. L apoptosi é necessaria per la distruzione di cellule che rappresentano una minaccia per l integrità dell organismo

18 Vari processi dello sviluppo coinvolgono l apoptosi A. Eliminazione di organi transitori e di tessuti Pronefro e mesonefro nei vertebrati superiori Chiusura del tubo neurale, loop cardiaco Coda e branchie degli anuri Organi larvali negli insetti olometaboli B. Rimodellamento tissutale Sviluppo degli arti C. Omeostasi cellulare turnover fisiologico delle cellule mature in tessuti continuamente proliferanti

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21 Sindattilia 1/2500 nascite

22 L apoptosi è il risultato di un equilibrio Aumento Apoptosi AIDS Malattie neurodegenerative Malattia di Alzeheimer, Morbo di Parkinson, Malattia di Huntington Inhibizione Apoptosi Cancro linfoma Follicolare carcinomi con mutazione di p53 Malattie Autoimmuni Lupus erytematoso sistemico Infezioni Virali Herpesvirus, poxvirus, adenovirus

23 Il processo apoptotico APOPTOSI NECROSI For every cell, there is a time to live and a time to die.

24 Apoptosi vs necrosi Richiede alcune ore Irreversibilità Fisiologico Riduzione dei contatti Processo controllato Evento acuto che si completa in pochi minuti Può regredire e la cellula recuperare funzionalità Trauma Lisi cellulare Rilascio di citoplasma Risposta infiammatoria

25 Fasi dell apoptosi Eventi molecolari, biochimici e morfologici Induzione Death signals Esecuzione Riconoscimento e Fagocitosi condensation fragmentation engulfment Degradazione

26 FASI DELL APOPTOSI- 1 FASE DI INDUZIONE I diversi stimoli ed eventi apoptogeni seguono due (o forse più) distinte pathways: una attivata dai "segnali di morte" che giungono ai recettori di superficie, l'altra attivata da segnali endogeni e regolata dal mitocondrio. Si ritiene che tali pathways siano regolabili e reversibili fino al momento in cui convergono nell'attivazione delle caspasi.

27 Fattori che scatenano l apoptosi

28 Stimoli apoptotici estrinseci 1. Legame (di ligandi che inducono morte) ai recettori di superficie 2. Recettori che si legano ai linfociti T citotossici (4) intrinseci seguono ad uno stress cellulare coinvolgimento dei mitocondri 1. Esposizione a radiazioni 2. Esposizione a sostanze chimiche 3. Esposizione ad agenti virali 4. Mancanza del fattore di crescita 5. Stress ossidativo

29 Death receptors Recettori specifici sulla superficie cellulare trasmettono il segnale apoptotico, grazie a specifici ligandi Questi recettori appartengono alla superfamiglia dei TNF, svolgono anche altre funzioni Recettori della morte meglio caratterizzati: CD95 (or Fas), TNFR1 (TNF receptor-1) e i recettori DR4 and DR5 TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand).

30 Tumour Necrosis Factor Receptor-1 (TNFR1) Il legame porta ad una trimerizzazione del recettore che lega TRADD e FADD (molecole adattatrici) e la procaspasi 8

31 Attivazione dell apoptosi attraverso CD95/Fas Il ligando per CD95 è un trimero, legato al recettore promuove l associazione del DD (Death Domain) con altre molecole FADD= Fas associate death domain Il complesso CD95/FADD lega la pro-caspasi 8 Caspasi 8 Caspasi 9

32 La via di segnalazione mitocondriale

33 Ruolo dei mitocondri Proteine antiapoptotiche della famiglia di Bcl2 si trovano sulla membrana esterna e promuovono la sopravvivenza della cellula I mitocondri possono favorire l apoptosi attraverso il rilascio di citocromo C Citocromo c + Apaf- 1+ ATP + pro-caspasi 9 Bax e bad= pore forming protein Caspasi 9 Cascata delle caspasi

34 FASI DELL APOPTOSI- 2 FASE DI ESECUZIONE L'attivazione delle caspasi è determinata da un evento proteolitico e determina a sua volta un'ulteriore cascata di eventi proteolitici e nucleolitici preordinati, che amplificano il segnale e portano alle tipiche modificazioni morfologiche dell'apoptosi. La finalità è quella di predisporre la cellula ad essere facilmente fagocitata

35 Attivazione delle caspasi (cysteinyl aspartate-specific proteinases ) Proteine che tagliano specifici substrati: proteine strutturali del citoscheletro e proteine nucleari (enzimi che riparano il DNA) Nell uomo sono state identificate più di 10 proteine

36 Cistein proteasi -Nella cellula si trovano nella forma inattiva (zimogeno). -Passano nella forma attiva in seguito all induzione del processo apoptotico. Le caspasi possono essere suddivise in due classi principali: 1. iniziatrici (o di avvio) 2. effettrici. Le caspasi di avvio sono responsabili dell attivazione delle caspasi effettrici.

37 Nuclear activation Un evento tipico dell apoptosi è la suddivisione del DNA in nucleosomi E un evento che segue l attivazione delle caspasi Poly(ADB ribosio) polimerasi Ripara il DNA caspase activated Dnase ICAD normalmente inattiva, durante l apoptosi diventa CAD (nucleasi) Substrato per le caspasi, è coinvolta nei processi di riparazione del DNA

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39 La cellula in apoptosi subisce modificazioni morfologiche e biochimiche che portano alla sua frammentazione e ne favoriscono la fagocitosi

40 CELLULA APOPTOTICA AL MICROSCOPIO ELETTRONICO

41 Elettroforesi del DNA di cellule in apoptosi 1- DNA di cellule in apoptosi: si può osservare il ladder (scaletta), formato da frammenti di peso molecolare discreto (multipli di nucleosomi) 2- DNA ad alto peso molecolare di cellule integre 3- DNA di cellule in necrosi: i frammenti sono di peso molecolare vario, per lo più piccolo

42 Fagocitosi: segnali eat-me nelle cellule di mammifero

43 Fagocitosi di cellule apoptotiche

44 Cell surface modifications: phosphatidylserine exposure