La classificazione di Ljubljana delle lesioni iperplastiche dell epitelio laringeo: valutazione morfometrica del pleomorfismo nucleare

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1 Pathologica (2002) 94: Springer-Verlag 2002 ARTICOLO ORIGINALE G. Serio N. Gale A. Pennella A.M. Dalena C. Giardina T. Valente T. Lettini R. Ricco L. Resta La classificazione di Ljubljana delle lesioni iperplastiche dell epitelio laringeo: valutazione morfometrica del pleomorfismo nucleare The Ljubljana classification of epithelial hyperplastic laryngeal lesions: a morphometric evaluation of nuclear pleomorphism Riassunto Le lesioni epiteliali iperplastiche del laringe possono essere definite come condizioni patologiche in cui l epitelio ha un rischio variabile di trasformazione in carcinoma invasivo. Numerose classificazioni sono state proposte per definirle ma nessuna accettata concordemente. La classificazione di Ljubljana (1999) propone il seguente grading: iperplasia semplice, anomala e atipica e carcinoma in situ (CIS). Le iperplasie semplice e anomala sono considerate lesioni benigne in quanto prive di atipie cellulari; l iperplasia atipica è la lesione con rischio epiteliale in cui l epitelio presenta moderate atipie ma senza le alterazioni citomorfologiche (ipercromatismo nucleare, nucleoli evidenti, incremento del rapporto N/C, etc.) ed architetturali (alterazione della stratificazione, dell orientamento, della maturazione, etc.) tipiche delle cellule carcinomatose. Nel grading proposto, tra i parametri istologici considerati, il polimorfismo nucleare gioca un ruolo importante. Con procedure morfometriche abbiamo valutato il polimorfismo dei nuclei basali delle lesioni iperplastiche laringee al fine di validare l importanza di questo parametro nella formulazione del citato schema classificativo. Con il software SAM (Shape Analytical Morphometry), 8 casi di iperplasia semplice, 10 di anomala e 10 di atipica e 8 di G. Serio ( ) A.M. Dalena C. Giardina T. Valente R. Ricco L.Resta Dipartimento di Anatomia Patologica e di Genetica, Policlinico Universitario, Piazza G. Cesare 11, I Bari, Italia Tel.: Fax: N. Gale Istituto di Anatomia Patologica, Università di Ljubliana, Slovenia A. Pennella Servizio di Anatomia Patologica, Università di Foggia, Italia T. Lettini Consorzio di Ricerca DIGAMMA, Bari, Italia CIS sono stati valutati morfometricamente; i risultati sono stati elaborati con analisi statistica univariata. Un incremento significativo delle dimensioni nucleari (diametro massimo, perimetro, area) è stato osservato dalla iperplasia semplice all atipica al CIS; l iperplasia atipica ha mostrato i valori medi più bassi. Nessuna differenza significativa è emersa tra i nuclei dell iperplasia atipica e del CIS. Le maggiori irregolarità della forma sono state osservate nei nuclei dell iperplasia anomala. In conclusione, i nuclei basali dell iperplasia atipica e del CIS sono morfologicamente simili. Le caratteristiche nucleari dell iperplasia anomala confermerebbero trattarsi di una classe proliferante di lesioni benigne del laringe e, diversamente, l iperplasia semplice di una classe stabile di lesione benigna di tipo irritativo dello stesso epitelio. Parole chiave Laringe Iperplasia Lesioni precancerose Morfometria Key words Larynx Hyperplasia Precancerous lesions Morphometry Introduzione Le lesioni iperplastiche del laringe sono definite da un insieme di alterazioni istomorfologiche caratterizzate da iperplasia dell epitelio, talora con associati disordini citoarchitetturali e, spesso accompagnate da diversi tipi di modificazioni reattive dello stroma come l infiltrato infiammatorio, la neovascolarizzazione e la deposizione di matrice proteica extracellulare [1-3]. Da un punto di vista eziologico, esse condividono gli stessi fattori di rischio del carcinoma laringeo [4-10] e pertanto è opinione comune che esse possano rappresentare la fase iniziale del fenomeno trasformativo neoplastico [12-17]. Esiste una grande confusione terminologica e classificativa in merito. Infatti, vari Autori [18-21] descrivono identiche lesioni cliniche ed istologiche con nomi diversi e spesso ter-

2 G. Serio et al.: Lesioni epiteliali iperplastiche del larige. Studio morfometrico 291 mini clinici come leucoplachia, eritroplachia, pachidermia, cheratosi, discheratosi, epidermizzazione, iperplasia squamosa, sono impropriamente usati per la diagnosi istologica. Sono state proposte più di 20 diverse classificazioni spesso simili tra loro, la cui peculiarità in base alle caratteristiche istomorfologiche (cheratinizzazione dello strato epiteliale superficiale, iperplasia epiteliale e grado di atipia citoarchitetturale) è rappresentata dal tentativo di identificare gruppi specifici: (1) lesioni senza rischio epiteliale di progressione maligna e (2) lesioni con rischio epiteliale di progressione, le cosiddette precancerosi [12, 16-17, 21-24]. Quest ultimo gruppo di lesioni mostra, inoltre, rischi differenti di evoluzione a cui è associata una prognosi diversa. Infatti, nelle precancerosi il rischio di sviluppare un carcinoma invasivo è particolarmente elevato, ma variabile, tanto da richiedere trattamenti clinico-chirurgici differenziati [12, 13, 20]. Ad oggi, nessuna delle classificazioni proposte è concordemente accettata in quanto la confusione terminologica e i criteri di volta in volta utilizzati sottolineano la difficoltà dei patologi nel descrivere e correlare le caratteristiche istomorfologiche con il comportamento biologico. È da sottolineare ancora, che le maggiori controversie riguardano proprio quelle lesioni con rischio più elevato di progressione maligna e che spesso disorientano il clinico circa le modalità terapeutiche da applicare per un migliore risultato. Nelle varie classificazioni una variabile costante cui viene attribuito un certo peso prognostico è rappresentata dalle atipie cellulari. La recente classificazione di Ljubjana (1999) proposta da Kambic e Gale considera l architettura dell epitelio, l iperplasia cellulare e il grado di atipia nucleare e cellulare come i criteri morfologici più importanti e meglio correlabili con il rischio di trasformazione maligna. La cheratinizzazione della superficie epiteliale, già di interpretazione discutibile, si confermerebbe un parametro poco significativo. Le lesioni istomorfologiche vengono divise in 4 gradi: iperplasia semplice (simple hyperplasia SH) e iperplasia anomala (abnormal hyperplasia ABH), che insieme rappresentano un gruppo di lesioni benigne; iperplasia atipica (atypical hyperplasia ATH), considerato un gruppo potenzialmente maligno, e carcinoma in situ (CIS), lesione già maligna. Poiché la percentuale di pazienti con iperplasia atipica che sviluppa un carcinoma invasivo non è elevata (14%), viene suggerito di sostituire il termine di precancerosi abitualmente in uso, con il termine di rischio epiteliale [1, 2, 25]. Il sistema di grading proposto così formulato risponderebbe ai seguenti requisiti: semplice applicabilità, alta riproducibilità, rilevante utilità clinica e obiettiva accuratezza scientifica. In pratica lo schema classificativo risulterebbe facilmente comprensibile. Iperplasia semplice Si tratta di una lesione istologicamente caratterizzata da un ispessimento dello strato spinoso (acantosi), da uno strato Fig. 1 Iperplasia semplice: evidente l ispessimento dello strato spinoso; assenza di atipie cellulari (EE) basale regolare con mitosi regolari e dall assenza di atipie cellulari (Fig.1). Iperplasia anomala La lesione è caratterizzata da un ispessimento dell epitelio per incremento delle cellule dello strato basale e parabasale. Tali elementi cellulari mostrano nuclei moderatamente aumentati di volume con cromatina distribuita uniformemente. Regolari le mitosi nello strato basale o nelle imme- Fig. 2 Iperplasia anomala: incremento delle cellule basali e parabasali; assenti le alterazioni citoarchitetturali (EE)

3 292 G. Serio et al.: Lesioni epiteliali iperplastiche del larige. Studio morfometrico diate vicinanze. La parte superiore dell epitelio è costituita da cellule spinose mature prive di alterazioni citoarchitetturali (Fig. 2). Meno del 5% delle cellule epiteliali può presentare caratteristiche di discheratosi. Iperplasia atipica È una lesione potenzialmente maligna caratterizzata da alterazioni delle cellule epiteliali capaci di ulteriore evoluzione ma prive di quelle caratteristiche tipiche delle cellule carcinomatose. Istologicamente la stratificazione epiteliale è preservata. Le cellule epiteliali sono ben orientate rispetto alla membrana basale, i nuclei mostrano gradi lievi o moderati di atipia, sono aumentati di volume, mostrano contorno irregolare e sono frequentemente ipercromatici. I nucleoli sono evidenti. Il rapporto N/C è generalmente aumentato. Queste cellule con tali caratteristiche nucleari occupano lo strato basale dell epitelio ma possono essere presenti nell intero spessore Fig. 4 Iperplasia atipica ( basal cell type ): aumento dello spessore cellulare con incremento del rapporto nucleo/citoplasma. Le cellule sono allineate perpendicolarmente alla membrana basale (EE) allineate perpendicolarmente alla membrana basale (Fig. 4). La seconda è caratterizzata dalla presenza di cellule spinose con citoplasma più ampio e spiccatamente eosinofilo e con cellule allineate orizzontalmente alla membrana basale. Carcinoma in situ Si tratta di una lesione in cui l epitelio mostra le stesse caratteristiche istologiche del carcinoma invasivo. Le atipie cellulari e l elevato numero di mitosi, spesso bizzare, rappresentano gli aspetti più importanti di questa lesione (Fig. 5, 6). La precoce cheratinizzazione delle cellule indica una maturazione intraepiteliale disordinata e contribuisce all alterazione dell architettura. Fig. 3 Iperplasia atipica ( spinous cell type ): sono presenti moderate atipie cellulari; evidenti l eosinofilia citoplasmatica e le mitosi tipiche (EE) dello stesso. L indice mitotico è discretamente aumentato e le mitosi presenti soprattutto negli strati basali e parabasali solo occasionalmente sono osservabili in superficie. Rare le mitosi atipiche. Cellule in apoptosi possono essere presenti. La discheratosi è frequentemente osservabile (Fig. 3). Si riconoscono due varianti di iperplasia atipica: basal cell type e spinous cell type. La prima forma è caratterizzata da un incremento di cellule basaloidi prive di spine intercellulari e di eosinofilia citoplasmatica. Le cellule sono Obiettivo principale della classificazione di Ljubljana è quello di riconoscere le lesioni potenzialmente maligne (Iperplasia atipica) e di distinguerle dal carcinoma in situ. È noto, infatti, che in molti sistemi di grading correnti non è operata la distinzione tra carcinoma in situ e displasia severa [24]; diversamente la classificazione di Ljubljana [1, 2] sottolinea l importanza e la necessità di separare una condizione in cui la malignità è già sicuramente presente anche se non invasiva (carcinoma in situ), da una in cui questa caratteristica non è ancora un dato morfologico ben evidente (iperplasia atipica). La diversità clinico-morfologica di queste lesioni supportata da anni di esperienza degli Autori in Ljubljana, dall analisi quantitativa e morfometrica e dall accurato follow-

4 G. Serio et al.: Lesioni epiteliali iperplastiche del larige. Studio morfometrico 293 up dei pazienti può permettere un approccio terapeutico più razionale e meno invalidante [1, 2, 16, 26-28]. Va comunque ricordato che, poiché la diagnosi, la prognosi e la scelta del trattamento chirurgico dipendono interamente dalle caratteristiche dell epitelio di rivestimento, occorrono prelievi bioptici rappresentativi, idoneamente processati e, infine, una adeguata esperienza del patologo. L inserimento e la valutazione nei sistemi di grading di un numero sempre maggiore di parametri morfometrici rappresentano il tentativo operato dai patologi per rendere più oggettivo possibile un grading. Studi morfometrici sono stati eseguiti anche sull epitelio squamoso del laringe al fine di individuare parametri oggettivi e statisticamente significativi in grado di rendere più agevole il grading sia di lesioni carcinomatose che preneoplastiche [29-40]. Tuttavia, i risultati presenti in letteratura, non sempre soddisfacenti, non fanno che confermare, indipendentemente dal tipo di classificazione adottata, le difficoltà incontrate dai patologi nel definire queste lesioni. Scopo della morfometria analitica [29, 33-36, 38] non è solo quello di fornire parametri di valutazione oggettiva della forma, ma anche quella di fornire valutazioni interpretative della biologia delle cellule di cui la forma è la naturale espressione. Questo concetto è ancora più evidente nello studio delle cellule basali di un epitelio di rivestimento di cui esse rappresentano il comparto staminale. Per tale motivo l analisi morfometrica è stata applicata solo alle cellule basali dell epitelio laringeo suddiviso nelle quattro classi proposte dalla classificazione di Ljubljana. Fig. 5 CIS: aumentata stratificazione cellulare con marcate atipie nell intero spessore dell epitelio (EE) Fig. 6 CIS: particolare della figura precedente. Marcate atipie cellulari e numerose mitosi (EE) Materiali e metodi In accordo con i criteri proposti dalla classificazione di Ljubljana e su casi forniti dall archivio di Anatomia Patologica dell Università di Ljubljana, in 8 casi di iperplasia semplice, 10 casi di iperplasia anomala, 10 casi di iperplasia atipica e 8 casi di CIS del laringe sono state applicate procedure di morfometria analitica. Il materiale bioptico di tutti i casi selezionati per la ricerca era fissato in formalina tamponata al 10% e incluso in paraffina secondo la tecnica tradizionale. Le sezioni istologiche, dello spessore di 3-4 µm erano colorate con ematossilina-eosina (Figg. 1-6). Lo studio morfometrico è stato applicato solo sui nuclei dello strato basale che, osservati al microscopio (Zeiss) ad un ingrandimento di 1000 con obiettivo ad immersione, sono stati successivamente fotografati. Un numero totale di 756 nuclei (21 per caso) è stato analizzato. Nella selezione dei nuclei sono state accuratamente rispettate le seguenti caratteristiche: (1) posizione basale e (2) presenza di un contorno ben evidente. I 756 nuclei acquisiti e registrati come file di punti e coordinate note (Fig. 7) sono stati sottoposti allo studio morfometrico con il sistema software SAM (Shape Analytical Morphometry), che dispone di una sezione tradizionale per lo studio delle dimensioni e di una sezione del tutto originale per lo studio della forma [33, 34, 41, 42]. Per le valutazioni dimensionali sono stati considerati solo 3 parametri primari: area, perimetro e diametro massimo. Prima dell applicazione della procedura analitica tutti i nuclei sono stati normalizzati sul più piccolo valore di area e standardizzati per la posizione al fine di valutare la forma indipendentemente dalle dimensioni.

5 294 G. Serio et al.: Lesioni epiteliali iperplastiche del larige. Studio morfometrico Fig. 7a Esempio di nucleo selezionato. b Curva originale (CO) e sovrapposizione della CO e della curva fondamentale (CF) dello stesso nucleo dopo procedura di normalizzazione. c Spettro di Fourier delle prime 20 armoniche. d Fitting parabolico: situazione di massima asimmetria La procedura analitica, dettagliatamente descritta in precedenti lavori [33, 34, 41, 42], consiste di tre tappe ognuna delle quali fornisce parametri indipendenti e di significato deterministico descrittivi delle caratteristiche di forma: a) irregolarità del profilo nucleare calcolate mediante il confronto tra la curva originale (CO) e la curva di funzione (CF) ed espresse dai parametri 5-8 in Tabella 1; b) fini irregolarità del contorno nucleare valutate mediante l analisi armonica di Fourier, parametri 9-12 in Tabella 1; c) asimmetria nucleare (fitting parabolico) parametri in Tabella 1. Dopo la valutazione della distribuzione normale dei valori, è stata effettuata l analisi statistica univariata (test t di Student). Risultati Nella Tabella 1 sono riportati i valori medi (M) e le relative deviazioni standard (DS) dei parametri dimensionali ed analitici considerati per ogni tipo di lesione. La Tabella 2 mostra la significatività statistica (p) ottenuta dal confronto per coppie di lesioni degli stessi parametri. Valori medi crescenti di area, perimetro e diametro massimo si osservano a partire dalla iperplasia semplice, all i- perplasia atipica, al carcinoma in situ. In queste ultime due categorie di lesioni i valori medi sono risultati pressoché sovrapponibili. Al contrario l iperplasia anomala presenta valori medi più bassi. Le differenze statistiche tra i gruppi sono risultate altamente significative (p<0.001) per tutti i parametri tranne nel confronto iperplasia atipica/carcinoma in situ. Dall analisi dei parametri estratti dal confronto tra curva originale (CO) e curva fondamentale (CF) e quelli ottenuti dall analisi armonica di Fourier, descrittivi delle irregolarità del contorno, si evince che valori medi più elevati sono presenti nelle popolazioni nucleari appartenenti all iperplasia anomala. Il confronto statistico tra questo grado di lesione e le altre è risultato significativo (Tab. 2). Infine, dalla quantificazione delle asimmetrie nucleari si può osservare che le maggiori distorsioni sono presenti nell iperplasia anomala e atipica; tuttavia le differenze statistiche con le altre classi non sono risultate significative. Discussione La formulazione di un grading accurato delle lesioni epiteliali iperplastiche del laringe nasce dall esigenza di fornire al clinico informazioni decisive per la sua condotta terapeutica.

6 G. Serio et al.: Lesioni epiteliali iperplastiche del larige. Studio morfometrico 295 Tabella 1 Media (M) e deviazione standard (DS) dei gruppi di lesioni Iperplasia semplice Iperplasia anomala Iperplasia atipica Carcinoma in situ M DS M DS M DS M DS Parametri dimensionali 1. Diametro massimo Perimetro Area Confronto tra curva originale e curva di funzione 4. Percentuale dei punti ripetuti Radice quadrata dell errore quadratico medio 6. Media dei rapporti in x/y Indice delle ripetizioni in x/y Analisi armonica di Fourier 8. Somma delle armoniche Valore medio delle armoniche Valore assoluto dell armonica di ampiezza maggiore 11. Valore percentuale dell armonica di ampiezza maggiore Analisi di simmetria (SAE) 12. Valore massimo Valore medio Percentuale di area allometrica Tabella 2 Test t di Student SH/AH SH/ATH SH/CIS AH/ATH AH/CIS ATH/CIS Parametri dimensionali 1. Diametro massimo p<0.001 p<0.001 p<0.001 p<0.001 p<0.001 ns 2. Perimetro p<0.001 p<0.001 p<0.001 p<0.001 p<0.001 ns 3. Area p<0.001 p<0.001 p<0.001 p<0.001 p<0.001 ns Confronto tra curva originale e curva di funzione 4. Percentuale dei punti ripetuti p<0.001 ns ns ns p<0.001 ns 5. Radice quadrata dell errore quadratico medio p<0.001 ns ns p<0.001 p<0.001 ns 6. Media dei rapporti in x/y p>0.1 ns ns p<0.001 p>0.05 ns 7. Indice delle ripetizioni in x/y ns p<0.001 ns p>0.01 ns ns Analisi armonica di Fourier 8. Somma delle armoniche p<0.001 p>0.1 p<0.001 p<0.001 p<0.001 ns 9. Valore medio delle armoniche p<0.001 p>0.1 ns p<0.001 p<0.001 ns 10. Valore assoluto dell armonica di ampiezza maggiore p>0.1 p<0.001 p<0.001 p<0.001 p<0.001 ns 11. Valore percentuale dell armonica di ampiezza maggiore ns p<0.001 p<0.001 p<0.001 p<0.001 p<0.001 Analisi di simmetria (SAE) 12. Valore massimo ns ns ns ns ns ns 13. Valore medio ns p>0.01 p>0.05 ns ns ns 14. Percentuale di area allometrica ns ns ns ns ns ns SH, iperplasia semplice; AH, iperplasia anomala; ATH, iperplasia atipica; CIS, carcinoma in situ; ns, non significativo

7 296 G. Serio et al.: Lesioni epiteliali iperplastiche del larige. Studio morfometrico L obiettivo della classificazione di Ljubljana [1, 2] è quello di evitare precoci interventi chirurgici demolitivi o di sottoporre ad inutili follow-up pazienti con lesioni prive di rischio evolutivo. Secondo tale classificazione infatti, i pazienti con iperplasia semplice e anomala non sarebbero da sottoporre a follow-up dopo un accurata escissione bioptica delle lesioni. Diversamente, in tutti i casi in cui sono presenti atipie, si renderebbe necessario il follow-up con ripetizione della biopsia. Per cui, gold standard di questa classificazione è il riconoscimento delle iperplasie con rischio epiteliale di progressione in cancro invasivo (le vere precancerosi, ovvero le iperplasie atipiche) e la loro differenziazione dal carcinoma in situ. Dall esperienza degli Autori, studi quantitativi morfometrici indicano che l area nucleare e il perimetro sono parametri determinanti (valori maggiori nel CIS) nell indicare che si tratterebbe di classi differenti di lesioni. Il tutto verrebbe poi ulteriormente avvalorato dalla valutazione semiquantitativa dell indice mitotico, dell intero polimorfismo cellulare e di tutti quegli altri parametri considerati determinanti nella classificazione proposta [26, 28]. Abbiamo ritenuto di dover limitare la nostra indagine morfometrica ai soli nuclei dello strato basale, in quanto questi ultimi sono dimensionalmente confrontabili nelle varie classi di lesioni perché più omogenei non avendo subito la differenziazione squamosa con conseguente picnosi nucleare. D altra parte i nuclei basali sono quelli che biologicamente risultano più esposti agli stimoli proliferativi, soprattutto nelle fasi iniziali del processo di cancerogenesi, sicché le modificazioni dimensionali e di forma possono essere indicative dei cambiamenti biologici che li coinvolgono. Questa limitazione, però, rende poco confrontabili i nostri risultati con quelli riportati in letteratura, che considerano le variazioni di queste caratteristiche nei nuclei di tutti i livelli dell epitelio [26, 28, 31]. Dalla nostra esperienza si evince che l analisi quantitativa delle dimensioni e del polimorfismo nucleare delle cellule appartenenti allo strato basale consentono di operare una distinzione netta tra iperplasie a basso rischio (semplici e anomale) con quelle ad alto rischio (atipiche) e con il CIS. Al contrario, i nuclei basali appartenenti alle classi di lesioni caratterizzate da iperplasia con rischio e da modificazioni morfologiche tipiche già di carcinoma in situ non presentano differenze statisticamente significative né di dimensione né di forma. Differenze importanti si osservano, invece, nei nuclei delle lesioni definite come iperplasia anomala. In pratica, il polimorfismo nucleare sembrerebbe caratterizzare in maniera decisiva l iperplasia anomala. In altre parole, le minori dimensioni dei nuclei si accorderebbero con una maggiore spinta proliferativa cellulare (affollamento cellulare dello strato basale e parabasale) accompagnata da un aumento delle irregolarità e della asimmetria nucleare. Pertanto, se si considera solo il parametro polimorfismo nei nuclei basali, l iperplasia anomala sembrerebbe rappresentare la lesione epiteliale più sensibile allo stimolo di tipo proliferativo. Al contrario, le caratteristiche nucleari della iperplasia semplice sembrerebbero suggerire una natura irritativa ma stabile delle lesione. La mancanza di significatività statistica dei parametri descrittivi della forma nell iperplasia atipica e nel carcinoma in situ potrebbe essere spiegata considerando che, in accordo con la logica del sistema SAM [33, 34, 41, 42], tutte le informazioni inerenti la forma nucleare vengono descritte dai singoli parametri in maniera estremamente dettagliata per cui, quando le differenze non sono eccessive, può essere difficile differenziarle. Riteniamo, pertanto, che la discriminazione tra una iperplasia con rischio epiteliale e un carcinoma in situ non si può basare solo sulla configurazione (ovvero atipie) dei nuclei dello strato basale, ma necessita della valutazione anche degli altri parametri morfologici (totale assenza di polarità maturativa, presenza di cellule atipiche sino agli strati più superficiali dell epitelio e aumentato indice mitotico) ed architetturali non compresi nell indagine da noi effettuata e che evidentemente hanno un peso determinante nella formulazione del grading così proposto dagli Autori. Tuttavia, il dato che i nuclei dello strato basale presentino le stesse caratteristiche citometriche nelle classi suddette rafforzerebbe l idea che entrambe siano correlate con cellule decisamente deviate verso un pericolo attuale di progressione neoplastica invasiva. In conclusione, i risultati morfometrici sottolineano la scarsa utilità del polimorfismo nella discriminazione delle lesioni di alto grado, ma offrono la possibilità di riconoscere lesioni stabili senza cioè capacità proliferante, lesioni proliferanti benigne e lesioni proliferanti con rischio di progressione maligna. Summary Epithelial hyperplastic laryngeal lesions (EHLL) are associated, with a varying degree of epithelial risk to develop invasive carcinoma. Several classifications have been proposed but none has received a total agreement. The 1999 Ljubljana classification distinguished four grades: simple, abnormal and atypical hyperplasia and in situ carcinoma (ISC). The first two grades are considered benign lesions; the ISC is the malignant lesion, while the atypical hyperplasia is considered a risky lesion. This is characterized by alterations of epithelial cells towards malignancy, but not to the extent to be found in carcinoma cells. Such characteristics refer to cytomorphological (e.g., nuclear hyperchromatism, nucleoli, increased nuclear/cytoplasmic ratio) and architectural (e.g., stratification, orientation, maturation) features. In the Ljubljana scheme, nuclear pleomorphism is one of the most important features. We wanted to improve the importance of nuclear pleomorphism in the basal cells layer in different classes of EHLL using morphometrical analysis. We studied 8 cases of simple hyperplasia,

8 G. Serio et al.: Lesioni epiteliali iperplastiche del larige. Studio morfometrico of abnormal hyperplasia, 10 of atypical hyperplasia and 8 of ISC using the software SAM (Shape Analytical Morphometry). The results were submitted to univariate statistical analysis. Nuclear dimensions (maximum diameter, perimeter and area) showed a progressive increase from simple to atypical hyperplasias to ISC, while abnormal hyperplasia showed the lowest values. On the contrary, analytical parameters related to nuclear contour irregularities and asymmetries showed their highest values in abnormal hyperplasia nuclei. There were no significant differences between atypical hyperplasia and ISC, while it was possible to differentiate abnormal hyperplasia from the others. In conclusion basal nuclei of atypical hyperplasia and ISC are similar so that other cytological and morphological architectural parameters are necessary to distinguish the two lesions. Abnormal hyperplasia seems to be the biological category of proliferative benign laryngeal epithelium; simple hyperplasia refers to stable irritative epithelium. Bibliografia 1. Kambi V, Gale N, Fischinger J (1994) Local immune response in hyperplastic lesions of the larynx. ORL 56: Zidar N, Gale N, Kambic V, Fischinger J (2001) Expression of tenascin and fibronectin in epithelial hyperplastic lesions and squamous carcinoma of the larynx. Anticancer Res 21: Gale N, Kambi V, Michaels L et al (2000). The Ljubljana classification: a practical strategy for the diagnosis of laryngeal precancerous lesions. Adv Anat Pathol 4: Auerbach O, Hammond EC, Garfinkel L (1970) Histologic changes in the larynx in relation to smoking habit. Cancer 25: Bosatra A (1975) Precancerous lesions of the larynx. Acta Otolaryngol 344: Glanz H, Kleinsasser O (1976) Chronische laryngitis und carcinom. 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