Patologie dei gamberi d acqua dolce e loro monitoraggio

Transcript

1 Patologie dei gamberi d acqua dolce e loro monitoraggio Corsi di formazione per personale ETP Pretto Tobia, Manfrin Amedeo IZS delle Venezie Adria (RO)

2 PATOLOGIE DEI GAMBERI D ACQUA DOLCE NEL CONTESTO DEL PROGETTO LIFE+ RARITY Peste del gambero sostenuta da Aphanomyces astaci White Spot Disease o Malattia dei Punti Bianchi sostenuta da White Spot Syndrome Virus (WSSV)

3 PESTE DEL GAMBERO Agente eziologico: Aphanomyces astaci Phylum Chromista Classe Oomiceti Ordine Saprolegniales Famiglia Saprolegniaceae Genere Aphanomyces

4 EPIDEMIOLOGIA E PATOGENESI Sensibilità di specie Astacidi, specie europee (Austropotamobius pallipes, A. torrentium, Astacus astacus e A. leptodactylus) molto sensibili. Cambaridi, specie americane (Procambarus clarkii, Pacifastacus leniusculus, Orconectes spp.) più resistenti. Parastacidi, specie australiane (Euastacus sp., Cherax sp., Geocherax sp., Astacopsis sp.) molto sensibili a prove di infezione in laboratorio (Unestam,1975).

5 Aphanomyces astaci è un patogeno primario che attacca le aree meno calcificate della cuticola e le membrane delle articolazioni dei crostacei. Le zoospore, che determinano la diffusione dell infezione attraverso l acqua, sono lo stadio infettante della malattia.

6 La zona di giunzione tra due segmenti addominali o le articolazioni sono il sito più opportuno per l incistamento Foto D. Alderman Foto D. Alderman

7 Si genera un tubo germinativo di penetrazione e le ife con attività proteasica e chitinasica cominciano a svilupparsi, progredendo parallelamente alle fibrille chitinose all interno della cuticola, invadendo l ipoderma e talvolta la muscolatura sottostante. Raramente si ha diffusione in modo massivo in tessuti ed organi più profondi.

8 La riproduzione è asessuata ed avviene per formazione di zoosporangi che a maturità liberano zoospore. Le zoospore, libere in acqua, generalmente sono attive per un periodo variabile da pochi minuti a tre giorni, ma secondo la temperatura ambientale i tempi possono essere molto più lunghi Quando la zoospora per chemiotassi raggiunge l esoscheletro di un gambero vi aderisce con i flagelli e si incista nella cuticola, dando luogo a nuova germinazione. Il tentativo d incistamento può avvenire più volte, fino a tre, se il substrato non risulta idoneo alla germinazione

9 DIFFUSIONE E TRASMISSIONE DELLA MALATTIA La peste si trasmette per via orizzontale Da gambero infetto ad esemplari sani Da gamberi alloctoni portatori ad esemplari autoctoni sani Tramite acqua contaminata Le zoospore rimangono vitali nel muco della pelle e del tratto intestinale dei pesci.

10 Mammiferi, come la lontra, il visone o topi muschiati e uccelli acquatici sono stati accusati di diffondere la peste dei gamberi in Europa. Poiché studi scientifici hanno dimostrato che le zoospore non sopravvivono alle temperature del tratto gastrointestinale di mammiferi o uccelli (Oidtmann et al., 2002), la trasmissione può avvenire tramite la sola veicolazione, sulla superficie corporea, di acqua contaminata. La trasmissione verticale è stata segnalata in Finlandia in uova di gamberi della California incubate artificialmente (Makkonen et al,. 2010).

11 I cadaveri dei crostacei mantenuti all aria, a temperatura ambiente (circa 21 C), risultano ancora infettanti dopo 48 ore, in acqua dopo 3-5 giorni.

12 A. astaci può essere veicolato da equipaggiamento contaminato (barche, attrezzatura da pesca, stivali, vestiario, ecc.). In condizioni ideali, anche piccole quantità di acqua sono in grado di trasferire sufficienti zoospore per infettare un nuovo corpo idrico.

13 Quando si manifesta la malattia in una nuova area, la popolazione astacicola presenta elevatissima e rapida mortalità. La morte di tutti i gamberi si verifica entro 6-10 giorni. La malattia, nei corsi d acqua, si diffonde rapidamente lungo la direzione del flusso mentre è più lenta la propagazione controcorrente. Raramente individui sensibili vengono rinvenuti vivi dopo un episodio di peste, se ciò si verifica si deve probabilmente ad una mancata esposizione al patogeno (animali presenti in corsi d acqua tributari). Dopo molti decenni di infezione, non ci sono osservazioni di sviluppo di resistenza ed immunità alla malattia in specie europee di gambero. Foto Ashley Cooper

14 SEGNI CLINICI Il comportamento degli animali colpiti, andatura o attività insolita, fornisce un indizio per una diagnosi di peste ma i segni clinici non sono sufficienti. I primi segni di malattia sono di tipo comportamentale, in presenza di un elevato numero di soggetti morti. (Alderman & Polglase, 1986). Si osserva inizialmente un aumento dell attività motoria, seguito da apatia.

15 L animale affetto da peste si mostra, in pieno giorno, con gli arti in estensione, esce dall acqua e tenta di arrampicarsi sull argine, si muove in modo incoordinato, è instabile con perdita dell equilibrio, non tenta di fuggire alla cattura e si manifesta inerte se trattenuto

16 Al culmine dell infezione i soggetti si rovesciano sul dorso, muovono convulsamente le appendici e non riescono a raddrizzarsi. Talvolta la morte si manifesta per paralisi, in questa posizione. Frequentemente si può manifestare il distacco degli arti o porzioni di essi. La morte dell ospite è la conseguenza di una neurotossina.

17 Aree ulcerate brunastre sono più frequenti in gamberi alloctoni resistenti e portatori o in gamberi indigeni con infezione subacuta. A temperature inferiori a 10 C, i gamberi infetti richiedono tempi più lunghi per morire, e i segni clinici sono più evidenti, come la perdita di un arto e la presenza di ulcere melanotiche (Alderman et al., 1987).

18 Lesioni istologiche All osservazione istologica l esoscheletro, l ipoderma, più raramente il muscolo scheletrico sottostante e le branchie si presentano invasi da ife asettate e ramificate

19 Nelle specie di gamberi Nord Americani l infezione è localizzata alla cuticola, che presenta reazioni melanotiche

20 DIFFUSIONE DELLA PESTE IN ITALIA E IN EUROPA La malattia è stata descritta per la prima volta in Italia nel 1859 (Cornalia 1860). Non fu mai isolato l agente eziologico. Ben presto la peste, ritenuta al tempo essere provocata da parassiti o batteri, si propagò in tutta l Europa centrale e successivamente a tutto il continente.

21 In Italia, dopo le segnalazioni della metà del 1800, episodi di afanomicosi sono riportati: 1999, A. repetans in Procambarus clarkii, valle di Marmorta (BO) (Galuppi et al., 2002; Royo et al., 2004) A. astaci in P. clarkii, Lombardia e Toscana (Gherardi comunicazione personale) A. astaci in Austropotamobius pallipes, in Molise (IS) (Cammà et al., 2010) 2010 A. astaci in A. pallipes, Valdobbiadene (TV) 2011 A. astaci in A. pallipes, Trentino, fiume Chiese, Ponte S. Lucia

22 Nuovi focolai in Italia 2011 A. astaci in A. pallipes, Lombardia, Montevecchia (LC) 2011 A. astaci in A. pallipes, Abruzzo, Crognaleto (TE) 2011 A. astaci in Cherax destructor, in Veneto, Mogliano Veneto (TV)

23 DIAGNOSI in CAMPO SEGNI CLINICI E COMPORTAMENTALI: elevata mortalità esclusiva di gamberi in presenza di normale fauna ittica letargia, paralisi o incoordinazione degli arti esemplari rovesciati sul dorso se catturati perdita del riflesso della coda e scarsa tonicità muscolare presenza di aree brunastre, giallastre o grigiastre sulla cuticola addominale o alla base degli arti animali che abbandonano i rifugi o escono dall acqua durante il giorno

24 DIAGNOSI di LABORATORIO Tessuti target per identificazione o isolamento di A. astaci: Nelle specie sensibili (Astacus astacus, Austropotamobius pallipes, A. torrentium) prelievo da cuticola addominale. Nelle specie resistenti Nord Americane prelievo di cuticola addominale, telson e aree melanizzate di arti e cuticola. Immagine

25 DIAGNOSI di LABORATORIO ESAME A FRESCO: porzione di cuticola osservata a piccolo ingrandimento identificazione di ife asettate ed eventuali sporangi la presenza di infiltrato emocitario e melanizzazione associata alle ife tende ad escludere che si tratti di micosi secondarie ESAME COLTURALE IN TERRENO AGARIZZATO (ALDERMAN,1986): RGY agar (River water Glucose Yeast extract Agar) richiede esemplari vivi o morti entro le ore (refrigerati) efficace solo in specie sensibili, richiede tempi lunghi (15 gg) isolamento ed identificazione morfologica di ife e sporangi necessario per analisi molecolare RAPD-PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA)

26 ESAME ISTOLOGICO: eseguito su esemplari vivi o fissati in campo (fissativo di Davidson o formalina) evidenzia la presenza di ife fungine (colorazione di Grocott) non discrimina tra A. astaci e infezioni micotiche secondarie ANALISI MOLECOLARE (PCR): eseguibile su vivo, morto, congelato o fissato in etanolo efficace anche nelle specie resistenti (Procambarus clarkii) metodica più sensibile e specifica

27 METODICHE MOLECOLARI L analisi PCR, riportata nel Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2009 OIE (Oidtmann et al.,2006), amplifica una sequenza di 569 bp nella regione ITS (Internal Transcribed Spacer) del genoma di A. astaci. Primer 42 Forward 5 -GCTTGTGCTGAGGATGTTCF-3 Primer 640 Reverse 5'-CTATCCGACTCCGCATTCTG-3 Garantisce una sensibilità pari al 100% in campioni vivi o morti entro le 24 ore; può essere effettuato anche su campioni congelati o fissati in etanolo. SEQUENZIAMENTO: I prodotti di amplificazione vengono sequenziati e confrontati con le sequenze riportate in letteratura tramite BLAST (GenBank). Omologia di sequenza conferma la presenza di A. astaci nel campione analizzato.

28 PREVENZIONE Quando A. astaci viene a contatto con una popolazione di gamberi sensibili la sua diffusione non è controllabile perciò prevenirne l introduzione risulta essenziale. Misure preventive secondo: AUSTRALIAN AQUATIC VETERINARY EMERGENCY PLAN Disease Strategy Crayfish plague, 2005 OIE: Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2009

29 o evitare la movimentazione di gamberi vivi o morti, potenzialmente infetti, di acqua o attrezzatura contaminata, verso aree indenni ospitanti popolazioni suscettibili. o evitare la movimentazione ed il rilascio di specie ittiche provenienti da aree soggette ad episodi di afanomicosi. o evitare la cattura accidentale di gamberi alieni, possibili carrier di A. astaci, durante le movimentazioni di fauna ittica tra bacini diversi. o evitare il rilascio in natura di gamberi alieni Nord-Americani (acquariofili!) o applicare una corretta disinfezione di attrezzatura (guadini, nasse), stivali, natanti e veicoli tra campionamenti effettuati in bacini diversi.

30 METODI di DECONTAMINAZIONE ESSICCAMENTO: il micelio e le spore risultano inattivate dopo disidratazione per ore TRATTAMENTO TERMICO: risulta efficace il riscaldamento a 60 C per pochi minuti, e il raffreddamento a -20 C per 72 ore (Oidtmann et al 2002). DISINFEZIONE CHIMICA: ipoclorito di sodio: 100 ppm per 30 utile per strumentario e acqua contaminata iodofori: 500 ppm fino a 5, dopo pulizia dai residui organici acido peracetico: 100 ppm per 5 (soluzione al 5% in H 2 O 2 ) SMALTIMENTO DEI GAMBERI DALLA SEDE DEL FOCOLAIO Raccolta delle carcasse e termodistruzione tramite ditta specializzata secondo disposizioni del Regolamento UE 1069/2009 e s.m.i..

31 WSD o MALATTIA DEI PUNTI BIANCHI Sostenuta da: White Spot Syndrome Virus, dsdna, dotato di envelope Famiglia: Nimaviridae Genere: Whispovirus Diffusione: Asia (primo focolaio in Giappone, 1992), Americhe (Texas,1995), Medio Oriente Sporadicamente segnalato nel bacino del Mediterraneo ( ) Specie sensibili: tutti i crostacei decapodi, durante tutte le fasi di sviluppo. WSSV causa mortalità elevatissime nei gamberi della famiglia Penaeidae. Granchi, gamberi d acqua dolce, astici e aragoste sono suscettibili all infezione tuttavia sintomatologia e mortalità sono estremamente variabili. Elevate mortalità di Procambarus clarkii riportate in allevamenti della Louisiana nel 2007

32 TRASMISSIONE DELLA MALATTIA: Per via orizzontale: principalmente per ingestione di tessuti infetti (cannibalismo, predazione), per contatto diretto, tramite vettori quali rotiferi, vermi policheti, isopodi e crostacei non decapodi (Artemia salina), meno frequentemente tramite acqua contaminata. Per via verticale trans-ovum. METODI DI DECONTAMINAZIONE: Calore: 50 C per 20, 70 C per 5 ph: esposizione a ph 1 per 10, ph 3 per 1 ora o ph 12 per 25 a 25 C AGENTI CHIMICI Ipoclorito di sodio: 100 ppm per 10 minuti, 10 ppm per 30 minuti Iodofori: 100 ppm per 10 and 10 ppm per 30 Sali quaternari d ammonio:75 ppm per 10 minuti

33 SEGNI CLINICI D.V. Lightner, P. Saibaba Letargia, marcata riduzione nel consumo di alimento. Lesioni tipiche nei Peneidi : distacco della cuticola e presenza di macchie sottocuticolari biancastre nell esoscheletro, 0,5-2 mm di diametro, conseguenti a deposito di calcio da parte dell epidermide. Le macchie possono essere coalescenti, formando placche più estese. Nei gamberi d acqua dolce tali lesioni possono essere assenti. D.V. Lightner Occasionalmente si ha una colorazione rossastra dovuta ad espansione dei cromatofori della cuticola.

34 DIAGNOSI Esame istologico: I tessuti target di origine ectodermica (l epitelio cuticolare, l epitelio dello stomaco) e mesodermica (il tessuto connettivo, gli organi linfoidi, gli emociti, il tessuto ematopoietico) presentano nuclei ipertrofici, con più o meno marcata basofilia, ed inclusioni intranucleari debolmente eosinofile. Analisi molecolare: D.V. Lightner Nested-PCR secondo OIE (Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2009) e successivo SEQUENZIAMENTO, metodo di conferma.

35 CAMPIONAMENTO Prelievo di esemplari di Austropotamobius pallipes da destinare a riproduzione Prelievo di esemplari di Procambarus clarkii per contenimento delle popolazioni e monitoraggio sanitario. In entrambi i casi osservare le idonee misure di disinfezione delle attrezzature: Aspersione di nasse e guadini con iodofori (500 ppm) e pulizia e disinfezione degli stivali prima di lasciare il sito di pesca. Tra campionamenti eseguiti in siti diversi è necessario disinfettare le vasche o i contenitori con cui vengono trasportati i gamberi con iodofori o ipoclorito di sodio e adeguato risciacquo.

36 CAMPIONAMENTO In caso di sospetto focolaio di peste in una popolazione suscettibile il campione di gamberi sottoposto ad analisi dovrebbe essere costituito da: A. Gamberi moribondi sintomatici B. Gamberi vivi e apparentemente sani C. Gamberi morti in buono stato di conservazione Gli esemplari prelevati vivi dovrebbero essere inviati al laboratorio entro le 24 ore, in contenitori di polistirolo forati, mantenuti umidi (giornali o erba bagnata) e nel periodo estivo refrigerati (<16 C). Gli esemplari prelevati morti possono essere inviati congelati oppure fissati in etanolo 70 o superiore (non metilato) con rapporto campione: fissativo MINIMO 1:3.

37 GESTIONE DEI CENTRI DI RIPRODUZIONE Nella scelta di nuovi siti dovrebbe essere considerata la presenza, nelle vicinanze, di specie di gamberi aliene. Per le strutture che si approvvigionano direttamente da acque superficiali va esclusa la presenza di popolazioni aliene a monte del punto di prelievo, e impedita la loro risalita da valle. Prevenire l introduzione di gamberi potenzialmente infetti, acqua e attrezzatura contaminata.

38 Sottoporre a adeguato trattamento termico il pesce utilizzato come alimento per i gamberi se di origine incerta o proveniente da aree dove sono presenti gamberi alieni. Applicare le misure di biosicurezza: recinzione del sito, bagni podalici all ingresso della struttura, accurata disinfezione di tutte le attrezzature, introduzione di riproduttori provenienti da aree indenni, accertamenti diagnostici in caso di mortalità nel centro di riproduzione.

39 CENTRO DI RIPRODUZIONE: INDICAZIONI PER LA DISINFEZIONE Disinfezione dei mezzi di trasporto: All ingresso della struttura disporre vasca contenente ipoclorito di sodio o iodofori, oppure nebulizzare le ruote dell automezzo Disinfezione per personale e visitatori: Vaschette podaliche all ingresso dell impianto e tra i vari settori, con sostituzione settimanale delle soluzioni, in alternativa calzari monouso Disinfezione pavimentazione: Vapore > 100 C o ipoclorito 2 volte al mese, trattamento del circuito idraulico a fine ciclo Disinfezione delle vasche ad inizio ciclo: Iodofori 500 ppm, ipoclorito > 100 ppm o cloramina

40 Per la pulizia di routine delle vasche in impianto è opportuno dedicare a ciascuna guadini e spazzole propri. Se la stessa attrezzatura viene usata su più vasche immergerla in contenitori con soluzione disinfettante (iodofori) per alcuni secondi e risciacquarla con acqua pulita. Una volta utilizzata va riposta pulita in un luogo asciutto o immersa in soluzione disinfettante

41 CONTROLLO DELLE MOVIMENTAZIONI Prevenire la movimentazione di gamberi infetti e la diffusione del patogeno rappresenta uno dei punti cruciali in caso di focolaio di peste accertato o sospetto tale. Il corso d acqua coinvolto deve essere identificato ed applicate misure di controllo delle movimentazioni. Possono essere considerate tre zone: ZONA INFETTA che comprende il bacino idrico dall area soggetta a mortalità lungo il suo decorso verso valle ZONA DI PROTEZIONE ZONA DI SORVEGLIANZA L estensione di queste zone deve essere valutata caso per caso, in base alle caratteristiche idrogeografiche del sito interessato.

42 blocco della movimentazione di gamberi vivi da e verso la zona di protezione blocco della pesca sportiva nella zona di sorveglianza

43 SORVEGLIANZA Necessaria per individuare nuovi focolai, definire l estensione della zona infetta e monitorare i siti di ripopolamento Basata su tre metodi: semplice osservazione del comportamento e dei fenomeni di mortalità di gamberi nel territorio monitoraggio periodico dello stato sanitario di popolazioni di gamberi in differenti siti tramite analisi di laboratorio impiego di animali sentinella in bacini precedentemente infetti o sospetti.

44 RIPOPOLAMENTO A SEGUITO DI UN FOCOLAIO Il ripopolamento di un corso d acqua può avvenire solo dopo l eliminazione certa del patogeno: dopo tre mesi dall eliminazione di tutti i gamberi presenti nell area, sia di specie autoctone che aliene, verificata tramite catture dopo due anni di monitoraggio tramite gamberi sentinella, mantenuti in gabbie disposte lungo il corso d acqua, se non è garantita l estinzione della popolazione a seguito del focolaio di peste (Alderman, 2002) gli esemplari reinseriti devono essere disease free a volte il ripopolamento avviene naturalmente per migrazione di gamberi da aree indenni e isolate dello stesso bacino.

45 GRAZIE PER L ATTENZIONE