AHANOMYCES ASTACI UP-TO-DATE TOBIA PRETTO IZSVE -CENTRO SPECIALISTICO ITTICO ADRIA -RO PESTE DEL GAMBERO CRAYFISH PLAGUE

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1 AHANOMYCES ASTACI UP-TO-DATE TOBIA PRETTO IZSVE -CENTRO SPECIALISTICO ITTICO ADRIA -RO PESTE DEL GAMBERO CRAYFISH PLAGUE PARASSITA OBBLIGATO DEI GAMBERI D ACQUA DOLCE CICLO VITALE STRETTAMENTE ACQUATICO

2 CICLO VITALE RIPRODUZIONE ASESSUATA MEDIANTE FORMAZIONE DI ZOOSPORE MOBILI ADESIONE DELLA ZOOSPORA ALLA CUTICOLA DELL OSPITE ED INCISTAMENTO PENETRAZIONE DI UN TUBO GERMINATIVO ATTRAVERSO LA CUTICOLA CON RAMIFICAZIONE DELLE IFE LIMITATAMENTE ALLA CUTICOLA (CARRIER) O IN PROFONDITÀ NEI CONNETTIVI PRIMA DELLA MORTE DELL OSPITE, CRESCITA DELLE IFE ESTERNAMENTE ALLA CUTICOLA, CON SVILUPPO DI SPORE PRIMARIE CHE SI RACCOLGONO ALL APICE DI UN IFA FORMANDO ZOOSPORANGI CARATTERISTICI. QUESTI RILASCIANO ZOOSPORE SECONDARIE BIFLAGELLATE E MOBILI LE ZOOSPORE POSSONO RESTARE VITALI PER 2-3 GIORNI, SUCCESSIVAMENTE INCISTANO E GERMINANO IN PRESENA DELL OSPITE OPPURE RITORNANO ALLO STADIO MOBILE (2 CICLI DI INCISTAMENTO - RIATTIVAZIONE AL MASSIMO) APHANOMYCES ASTACI LINEAGES STRAIN A (As): ISOLATED FROM ASTACUS ASTACUS AND A. LEPTODACTYLUS FROM EUROPEAN OUTBREAKS STRAIN B (Ps I): ISOLATED FROM A. ASTACUS IN SWEDEN AND PACIFASTACUS LENIUSCULUS FROM LAKE TAHOE, USA STRAIN C (Ps II): FROM PACIFASTACUS LENIUSCULUS FROM LAKE PITT, BRITISH COLUMBIA STRAIN D (Pc): ISOLATED FROM PROCAMBARUS CLARKII IN EUROPE STRAIN E: ISOLATED FROM ORCONECTES LIMOSUS IN CZECH REPUBLIC Identified by Random Amplified Polymorphic DNA PCR (RAPD) from pure colture DNA extracts

3 EUROPEAN SPECIES (ASTACIDAE): HIGHLY SUSCEPTIBLE TO STRAINS B,C,D,E MODERATELY TO STRAIN A SPECIE SENSIBILI GENUS ASTACUS (A. ASTACUS, A. LEPTODACTYLUS) GENUS AUSTROPOTAMOBIUS (A. PALLIPES, A.TORRENTIUM) AUSTRALIAN SPECIES (PARASTACIDAE): MODERATELY - HIGHLY SUSCEPTIBLE TO STRAINS D AND PUTATIVE B GENUS CHERAX (C. DESTRUCTOR, C. QUADRICARINATUS, C. QUINQUICARINATUS) GENUS EUASTACUS GENUS ASTACOPSIS NORTH AMERICAN SPECIES (CAMBARIDAE, ASTACIDAE) RESISTANT AND BIOLOGICAL CARRIERS OF STRAINS B, C, D, E GENUS PACIFASTACUS (P. LENIUSCULUS) GENUS PROCAMBARUS (P. CLARKII, P. FALLAX VIRGINALIS) GENUS ORCONECTES (O. LIMOSUS, O. VIRILIS) ALTRE SPECIE SENSIBILI PROCAMBARUS ALLENI P. LLAMASI P. VAZQUEZAE P. ENOPLOSTERNUM CAMBARELLUS PATZCUARENSIS! PUTATIVE CARRIERS OF A. ASTACI (Kozubikova et al., CRAYCRO 2013) CHINESE MITTEN CRAB (ERIOCHEIR SINENSIS) NEOCARIDINA HETEROPODA MACROBRACHIUM DAYANUM?

4 DIAGNOSI SEGNI CLINICI WET MOUNTS ISTOLOGIA ISOLAMENTO IN RGY AGAR METODICHE BIO-MOLECOLARI SEGNI CLINICI o ALTERAZIONI COMPORTAMENTALI: o ATASSIA, PERDITA DELL EQUILIBRIO E COORDINAZIONE, PARALISI o ATTIVITÀ DIURNA o RIDUZIONE DEL RIFLESSO DI FUGA o LESIONI MACROSCOPICHE: o MACCHIE MELANIZZATE SULLA CUTICOLA ADDOMINALE O SULLE SUPERFICI ARTICOLARI DEI PEREIOPODI o SBIANCAMENTO O OPACITÀ PUNTIFORME DELLA MUSCOLATURA ADDOMINALE E DEL DERMA o PERDITA DELLE APPENDICI, TIPICAMENTE CHELIPEDI O PEREIOPODI

5 VIDEO

6 WET MOUNT opiccole PORZIONI DI CUTICOLA PRELEVATE DALLA SUPERFICIE ADDOMINALE E DELLE ARTICOLAZIONI DEI PEREIOPODI oevidenza DI IFE ASETTATE E RAMIFICATE (diametro 7-10 micron) CON APICI ROTONDEGGIANTI, NELLO SPESSORE DELLA CUTICOLA O ESTERNAMENTE AD ESSA opossibile PRESENZA DI DEPOSITI DI MELANINA LUNGO IL TRAGITTO DELLE IFE E DI EMOCITI ASSOCIATI

7 ISTOLOGIA odavidson S FRESHWATER FIXATIVE oinfiltrazione DEL CEFALOTORACE E DELL ADDOME oincisione DELLA CUTICOLA E DISTACCO DELL ADDOME o24 h IN DAVIDSON S, POI TRASFERIMENTO IN EtOH 70 oematossilina & EOSINA-FLOXINA, PAS, GROCOTT ISTOLOGIA IFE ASETTATE E RAMIFICATE NELLO SPESSORE DELLA CUTICOLA E DEL DERMA

8 ISOLAMENTO IN RGY AGAR o RIVER WATER GLUCOSE YEAST EXTRACT AGAR (ACIDO OSSOLINICO + PENICILLINA G) o PICCOLE PORZIONI DI CUTICOLA ADDOMINALE/ARTICOLAZIONE DEI PEREIOPODI CON PRESENZA VISIBILE DI IFE E ZOOSPORANGI CARATTERISTICI (FROM WET MOUNTS) o DIP IN EtOH 70-90, DIP IN H 2 O STERILE o COLTIVAZIONE A C IN RAGIONE DEL PROBABILE LINEAGE o ESITO INCERTO, FREQUENTE CONTAMINAZIONE BATTERICA O DA ALTRI OOMICETI opossibile SOLO DURANTE UN FOCOLAIO, NON APPLICABILE IN ESEMPLARI CARRIER

9 ANALISI BIO-MOLECOLARI o DECISO INCREMENTO DELLA SENSIBILITÀ - SPECIFICITÀ DIAGNOSTICA o AUMENTATA CONSERVABILITÀ DEL CAMPIONE (EtOH >70, CONGELATO) o APPLICABILITÀ SU MATRICI NON OTTIMALI o IDENTIFICAZIONE DI INFEZIONI CRONICHE-LATENTI (CARRIER) DA SINGOLO ESEMPLARE A POPOLAZIONE BIO-MOLECULAR ANALYSIS FIRST STAGE: SAMPLING THIRD STAGE: SCREENING WITH REAL-TIME PCR FOURTH STAGE: PCR END- POINT SECOND STAGE: DNA EXTRACTION FIFTH STAGE: SEQUENCING FOR FINAL CONFIRMATION

10 REAL-TIME PCR (SCREENING) PCR END-POINT (CONFIRMATION) CP 1 CP 2 Neg Pos Marker 100 bp Primer forward: AphAstITS-39F: Primer reverse: AphAstITS-97R: 5 AAGGCTTGTGCTGGGATGTT3 5 CTTCTTGCGAAACCTTCTGCTA3 Probe: AphAstITS-60T 5-6-FAM-TTCGGGACGACCCMG-BNF-Q-3 Primer BO42F : 5 GCTTGTGCTGAGGATGTTCT 3 BO640R : 5 CTATCCGACTCCGCATTCTG 3 Reference: Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE World Organization for Animal Health; ed. 2012, chapter 2.2.1; pp: RAPD ANALYSIS o RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA o1 PRIMER: BO1 opossibile SOLO PER CONFRONTO DIRETTO DI TUTTE LE LINEE A,B,C,D ometodo STORICAMENTE APPLICATO PER DIFFERENZIARE E CLASSIFICARE GLI ISOLATI DI A. ASTACI A B C D A A A - - A A MICROSATELLITI, GENE DELLA CHITINASI

11 PROGETTO LIFE+RARITY VALUTAZIONE DELLO STATO SANITARIO DELLE POPOLAZIONI DI AUSTROPOTAMOBIUS PALLIPES E PROCAMBARUS CLARKII IN FRIULI VENEZIA GIULIA A. ASTACI PATOGENO TARGET RARITY ( ) P. CLARKII PRELEVATI DA 5 DIFFERENTI STAZIONI (20-60 ESEMPLARI CIASCUNA) 3 STAZIONI POSITIVE PREVALENZA DI INFEZIONE VARIABILE (3%-69%) A. PALLIPES PRELEVATI DA 15 LOCALITÀ, CON LESIONI MELANIZZATE O MORIBONDI 6 STAZIONI POSITIVE

12 STATO ATTUALE FOCOLAI DI PESTE DEL GAMBERO, ASSOCIATI AD ELEVATE E RAPIDE MORTALITÀ, IN A. PALLIPES (real-time PCR: Ct <25-30) PRESENZA LIMITROFA DI SPECIE ALIENE CARRIER (CAMBARIDAE) A. ASTACI LINEAGE D (Pc) LIMITATA MORTALITÀ O PRESENZA SPORADICA DI A. PALLIPES SINTOMATICI O CON LESIONI MELANIZZATE (real-time PCR: Ct >35-38) A. ASTACI LINEAGE A BASSA PATOGENICITÀ STATO DI CARRIER IN A. PALLIPES NUOVO APPROCCIO METODOLOGIA NON DISTRUTTIVA SEMPLIFICA LA PROCEDURA DI PRELIEVO MIGLIORA LA SENSIBILITÀ DIAGNOSTICA DAL PRELIEVO DI CUTICOLA AL TAMPONE CUTICOLARE

13 GRAZIE PER L ATTENZIONE