La crescita microbica

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1 La crescita microbica 1 Le esigenze nutrizionali dei microrganismi (fonti nutritive) Le fonti di carbonio: usate dalla cellula per costruire le proprie molecole organiche Inorganiche AUTOTROFI (CO 2 ; HCO 3- ; CO 3 ) Organiche ETEROTROFI (le più comuni fonti sono carboidrati come il glucosio) Per es. E. coli o Oenococcus oeni Le fonti di azoto: usate per costruire aminoacidi (proteine) e basi azotate (nucleotidi e acidi nucleici) Inorganiche Organiche (N 2 ; NH 4+ ; NO 3- ; NO ) (le più comuni sono aminoacidi, peptidi, proteine) Rispetto all AZOTO si distinguono: batteri AZOTOFISSATORI: da N 2 a NH 4+ (Azotobacter e Rhizobium) batteri NITROSANTI: NH 4+ NO (Nitrosomonas, Nitrospira e Nitrosococcus) batteri NITRIFICANTI: NO NO 3- (Nitrobacter spp., Nitrospina e Nitrococcus) Le fonti di fosforo: usate per costruire i nucleotidi (ATP, ADP, AMP, acidi nucleici) Le fonti principali sono di tipo inorganico: PO 3-4 ; HPO 4 ; H 2 PO - 4 Le fonti di zolfo: usate per costruire i composti solforati (cisteina, metionina) Le fonti principali sono di tipo organico Le vitamine, i fattori di crescita e i sali minerali: variano molto a seconda della specie batterica; non possono essere sintetizzati dalla cellula e devono essere assunti come tali. Comprendono, ad esempio, alcune BASI AZOTATE, COMPLESSI VITAMINICI, SOSTANZE AROMATICHE ETEROCICLICHE 2

2 Le esigenze energetiche dei microrganismi Energia solare FOTOTROFI CHEMIOLITOTROFI (traggono energia da un composto inorganico) Energia chimica CHEMIOTROFI I microrganismi sono dunque classificati in 4 differenti TIPI FISIOLOGICI, in base alle fonti di carbonio ed energia: Tipo fisiologico Fonte di C Fonte di energia Fotoautotrofo C inorganico (CO 2 ; HCO 3- ; CO 3 ) Luce solare Fotoeterotrofo C organico Luce solare Chemioautotrofo C inorganico (CO 2 ; HCO 3- ; CO 3 ) Reazione chimica Chemioeterotrofo C organico Reazione chimica CHEMIORGANOTROFI (traggono energia da un composto organico) Sono gli organismi nutrizionalmente più esigenti; necessitano di sostanze complesse come quelle oganiche e di energia proveniente da reazioni di ossidoriduzione (per gli ORGANOtrofi degradazione di materiali organici) I microrganismi di cui maggiormente ci occuperemo (poiché rivestono il ruolo più importante in ambito alimentare ed enologico) sono CHEMIO- ORGANOETEROTROFI (Saccharomyces cerevisiae, i batteri lattici, E. coli e tutti le altre Enterobacteriaceae, Bacillus sp., etc.) 3 CLT Il metabolismo energetico di alcuni batteri Per definire il metabolismo energetico di una cellula è necessario individuare un donatore di elettroni e un accettore ultimo di elettroni chemiolitotrofo Batterio Thiobacillus denitrificans Gram Donatore di e- (molecola ridotta che viene ossidata) Accettore di e- (molecola ossidata che viene ridotta) In questo contesto, ha lo stesso significato di «fonte di energia» Prodotti finali - H 2 NO 3 - N 2 CLT Bacillus sp.* + S NO 3 - N 2 + SO 4 COT CLT COT CLT COT Pseudomonas sp. - sostanza organica NO 3-, NO 2 - N 2 + (CO 2 ) Desulfovibrio sp. - H 2 SO 4, S 2 O 3, S H 2 S chemiorganotrofo Clostridium sp. + sostanza organica SO 4 H 2 S + acetato Metano batteri (metanogeni) Archea H 2 sostanza organica CO 2 CO 2 CH 4 CH 4 + CO 2 * I Bacillus sono generalmente anaerobi facoltativi (cioè respirano, ma in assenza di ossigeno operano una respirazione anaerobica); in questa tabella è mostrato un esempio di respirazione anaerobica operata da alcuni membri del genere Bacillus. 4

3 Vari gruppi fisiologici di chemiolitoautotrofi Gruppo fisiologico Fonte di energia Prodotti finali ossidati Organismo Idrogenobatteri H 2 H 2 O Alcaligenes, Pseudomonas Metanogeni H 2 H 2 O Methanobacterium Carbossidobatteri CO CO 2 Rhodospirillum, Azotobacter Batteri nitrosanti NH 3 NO 2 Nitrosomonas Batteri nitrificanti NO 2 NO 3 Nitrobacter Batteri solfossidanti H 2 S or S SO 4 Thiobacillus, Sulfolobus Ferrobatteri Fe ++ Fe +++ Gallionella, Thiobacillus 5 1 Le esigenze chimiche e fisiche ambientali Il ph del mezzo di coltura: è un fattore chimico fondamentale; ha un range e un optimum variabili a seconda del microrganismo Microrganismo Range di ph ph ottimale Escherichia coli 4,0 9,0 7,2 Acetobacter aceti 4,0 8,0 5,8 Thiobacillus thiooxidans 1,0 6,0 3,0 Lactobacillus acidophilus 4,0 7,0 5,8 6,6 In base alla capacità di crescere a uno specifico ph si distinguono: Acidofili Neutrofili Alcalofili 6

4 2 La temperatura di crescita: ogni microrganismo può crescere solo in uno specifico range di temperature; in base ad esso si distinguono: psicrofili (20 C) mesofili (10-40 C) termofili (40-80 C) ipertermofili (65- >90 C) In base alla capacità di sopravvivere ad uno specifico range di temperature, si distinguono: batteri psicrotrofi (capacità di resitere a basse temperature) e termodurici o termoresistenti (capacità di resitere ad alte temperature ed in particolare alla pastorizzazione {63 C per 30 min}) Cosa succede alle alte temperature: si riduce la stabilità dei ribosomi si denaturano le proteine Cosa succede alle basse temperature: attività enzimatica ridotta si riduce l attività dell acqua (Aw) le membrane cellulari sono meno fluide 7 Temperatura di crescita per alcuni Archea ipertermofili Genere Minimum ( C) Optimum ( C) Maximum ( C) Sulfolobus Desulfurococcus Methanothermus Pyrodictium Methanopyrus

5 3 La tensione di ossigeno. In base al ruolo che l O 2 ha nella fisiologia di un microrganismo, si distinguono: a) aerobi, b) anaerobi, c) anaerobi facoltativi, d) aerotolleranti e) microaerofili Helicobacter pylori E. coli Streptococcus thermophilus Bifidobacterium animalis Gluconobacter oxydans 9 L O 2 è indispensabile agli aerobi quale ultimo accettore di elettroni nella respirazione tuttavia negli ambienti aerobi sono presenti le SPECIE TOSSICHE DELL O 2 Anione superossido Perossido d idrogeno (acqua ossigenata) Radicale idrossile si forma per effetto delle radiazioni ionizzanti e la cellula non ha difese specifiche per esso Gli enzimi che permettono di difendersi dalle specie tossiche dell O 2 O - 2 superossidodismutasi SUPEROSSIDO DISMUTASI O + O + 2H + H 2 O 2 + O 2 catalasi CATALASI H 2 O 2 + H 2 O 2 2H 2 O + O 2 PEROSSIDASI H 2 O 2 + NADH + H + 2H 2 O + NAD + 10

6 Presenza di superossido-dismutasi,catalasi e perossidasi in diversi gruppi di procarioti Aerobi obbligati e Anaerobi facoltativi Superossidodismutasi Catalasi Perossidasi Aerotolleranti Anaerobi obbligati La pressione osmotica La presenza di sali o zuccheri in acqua determina l aumento della pressione osmotica con conseguente perdita di acqua da parte della cellula batterica (disidratazione o avvizzimento cellulare) I batteri capaci di resistere ad alte concentrazioni di sale sono definiti ALOTOLLERANTI, ALOFILI o ALOFILI ESTREMI: I batteri capaci di resistere ad alte concentrazioni di zuccheri sono invece definiti OSMOFILI 12

7 OSMOSI Diffusione di acqua attraverso una membrana a permeabilità selettiva o una qualsiasi altra cellula priva di parete 13 Alla pressione osmotica è strettamente connessa la disponibilità dell acqua (attività dell acqua, a w ) L attività dell acqua (Aw) rappresenta il rapporto tra la pressione di vapore del substrato considerato (per es. un alimento) e la pressione di vapore dell acqua pura nelle stesse condizioni: a w = P alimento /P acqua (è una misura dell'acqua disponibile per la crescita di un microrganismo) Il valore dell Aw va da 0 a 1 (1 = acqua pura) L Aw è utilizzata per prevedere la crescita dei microrganismi negli alimenti Microrganismo Caulobacter (G -) 1.00 Spirillum (G -) 1.00 Pseudomonas (G -) 0.91 Salmonella/E. coli (G -) 0.91 Lactobacillus (G +) 0.90 Bacillus (G +) 0.90 Staphylococcus (G +) 0.85 Halococcus (Archea) 0.75 Minima a w necessaria per la crescita Il valore di a w si può abbassare privando il substrato (ad es. un alimento) di acqua o aggiungendo sostanze come il sale o lo zucchero 14

8 La riproduzione della cellula batterica I batteri si riproducono per SCISSIONE BINARIA (processo cellulare di MITOSI). In questo processo si verifica: - la duplicazione del cromosoma batterico - l allungamento della cellula - la formazione di un setto trasverso in posizione centrale - la suddivisione di una copia del cromosoma e del citoplasma nelle due cellule figlie Formazione del setto divisorio La SCISSIONE BINARIA è un processo di riproduzione asessuata. I batteri non si riproducono sessualmente (sebbene sia possibile un processo di scambio di informazioni genetiche tra due cellule batteriche noto come CONIUGAZIONE BATTERICA, che rappresenta una forma di sessualità, come vedremo in una prossima lezione) In seguito a scissione binaria si verifica un aumento del numero degli individui con costituzione di una COLTURA BATTERICA o POPOLAZIONE 15 Studiare la CRESCITA BATTERICA significa analizzare come il numero degli individui in una popolazione varia rispetto al tempo 16

9 La curva di crescita batterica In coltura in batch(cioè in un sistema chiuso) esaurimento nutrienti accumulo prodotti di rifiuto numero di batteri vivi Tempo (ore) 1 Fase di LATENZA (lag): fase di adattamento dei microrganismi al mezzo di coltura (sintesi di proteine, ATP, enzimi); la velocità di crescita è considerata pari a zero 2 Fase ESPONENZIALE (log): fase in cui i batteri si riproducono alla velocità massima. Il numero di batteri raddoppia ad intervalli regolari di tempo (= velocità costante) 3 Fase STAZIONARIA: la mancanza di nutrienti e l accumulo di metaboliti tossici rallentano la crescita fino ad azzerarla (v = 0). Numero di microrganismi costante 4 Fase di MORTE: il numero di cellule vitali decresce in modo esponenziale (il numero di microrganismi dimezza ad intervalli costanti di tempo) 17 Fattori che influenzano la presenza e la durata della fase di latenza Fase di latenza: non sempre è presente e la sua presenza è influenzata da: 1. stato fisiologico delle cellule 2. tipo di terreno colturale 3. modalità di inoculo Inoculi abbondanti riducono la fase di latenza e inoculi diluiti la allungano Talvolta si possono osservare fasi di latenza multiple, alternate a fasi di crescita, se il mezzo contiene fonti di carbonio diversificate. Tale fenomeno, detto DIAUXIA, è dovuto al fatto che, esaurita una delle fonti, la cellula deve risistemare il proprio corredo di enzimi per metabolizzare il nuovo substrato (questi enzimi sono dunque definiti ENZIMI INDUCIBILI) numero di batteri tempo (ore) consumo del secondo zucchero (per esempio LATTOSIO o XILOSIO) seconda fase di latenza esaurimento del primo zucchero (tipicamente GLUCOSIO) 18

10 Fattori che influenzano la fase esponenziale Diversi fattori possono influenzare la velocità di crescita di una coltura batterica e il suo TEMPO DI GENERAZIONE (tempo che intercorre tra due generazioni successive) 1. FATTORI GENETICI BATTERIO T ottimale TEMPO MEDIO DI GENERAZIONE (h) 2. FATTORI AMBIENTALI - sostanze nutritive - temperatura - ph - forza ionica (pressione osmotica) 19 Aspetti quantitativi della crescita in fase esponenziale La crescita batterica segue una progressione geometrica in base 2: n N t = N 0 2 n log N t = log N 0 + n log 2 - N 0 = numero di batteri inoculati - N t = numero di batteri al tempo t - n = numero di generazioni n = (log N t log N 0 ) / log 2 n = 3,3 log (N t / N 0 ) Tempo medio di generazione (o di duplicazione) T gen = t / n = t / [3,3 log (N t / N 0 )] - t = intervallo di tempo Costante media del tasso di crescita k = n / t = 1 / T gen 20

11 Fase stazionaria Il ciclo cellulare di Saccharomyces cerevisiae 0 G1 S S M G1 ac G1 = fase pre-sintetica S = fase di sintesi del DNA M = fase mitotica Si forma il fuso mitotico M G1 L inizio della replicazione è ritardato nella cellula figlia poiché è necessario un tempo per l accrescimento della cellula (ac); per questo, a S. cerevisiae non possono essere applicate le formule prima descritte per i batteri xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx 21 I cromosomi in diversi organismi I procarioti possiedono nella maggior parte dei casi (ma non in tutti) un unico cromosoma circolare, mentre gli eucarioti presentano un numero molto vario di cromosomi lineari Organismo Numero di cromosomi Numero di coppie di cromosomi Tipo Mycoplasma genitalium 1 1 circolare 0,58 Escherichia coli 1 1 circolare 4,6 Agrobacterium tumefaciens 4 1 Sinorhizobium meliloti (batterio azotofissatore Gram negativo) 3 circolari 1 lineare Dimensione (Mbp = milioni di paia di basi) 5, circolare 6,7 Saccharomyces cerevisiae 16 1 o 2 lineare 12,1 Schizosaccharomyces pombe 3 1 o 2 lineare 12,5 Caenorhabditis elegans 6 2 lineare 97 Drosophila melanogaster 4 2 lineare 180 Fugu rubripes (pesce palla) 22 2 lineare 365 Mus musculus (topo) 19+X+Y 2 lineare 2500 Homo sapiens 22+(X o Y) 2 lineare