Modulo Principali patologie di origine genetica

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1 Corso di Laurea in TECNICHE DI ALLEVAMENTO ANIMALE ED EDUCAZIONE CINOFILA TAEEC Corso Integrato Patologia generale veterinaria e patologie genetiche Modulo Principali patologie di origine genetica Titolare: Prof. G. Lubas 1 Modulo Principali patologie di origine genetica Prof. George Lubas Dip. Scienze Veterinarie george.lubas@unipi.it Iscrizioni corso

2 Test di laboratorio x diagnosi e identificazione soggetti malati e portatori Esami basati sui prodotti genici Esami basati sulla mutazione del DNA Esami basati sul legame di DNA (linkage DNA su pedigree e con linkage disequilibrium) 3 Esami basati sui prodotti genici - 1 Misurano la quantità e/o le funzioni dei prodotti genici di natura proteica (es. deficienza PFK Springer Spaniel inglese) Disordine autosomico recessivo - saggio enzimatico mostra: Soggetti omozigoti hanno attività tra 8-24% valori di controllo Soggetti eterozigoti hanno livelli tra il 40-60% valori di controllo Il test di laboratorio fornisce risultati definitivi per la diagnosi di animali affetti omozigoti 4 2

3 Esami basati sui prodotti genici 2 Vantaggio - non essere legati a mutazioni specifiche, utili nella diagnosi nelle razze con differenti mutazioni nello stesso gene, incluse razze che non sono state precedentemente indagate Svantaggi - meno utili nell identificare i portatori, i valori dell esame tendono a sovrapporsi per un certo grado con i risultati dei soggetti normali, rendendo difficile un chiara assegnazione dello stato di portatore in certi animali anche dopo ripetuti dosaggi Limitazione sui test di laboratorio basati sui prodotti genici è che la proteina rilevata può non essere espressa nei tessuti facilmente campionati negli animali vivi Per es. nella distrofia retinica autosomica recessiva del cane Briard, nota anche come cecità notturna stabile, la proteina anomala identificata come RPE65 è espressa specificatamente nell epitelio pigmentato retinico, un tessuto non facilmente accessibile per una campionatura negli animali in vita. 5 Esami basati sui prodotti genici - 3 Identificazione degli eterozigoti Talvolta è possibile identificare un eterozigote di carattere recessivo per mezzo di test di laboratorio in caso ad es. di deficienze di particolari enzimi o fattori che entrano nel processo coagulativo (fattore VII). Infatti questi hanno un livello di attività enzimatica che si colloca ad un tasso intermedio tra l'omozigote normale e l'omozigote recessivo con doppia dose del gene anormale. La percentuale di attendibilità è buona seppure possano esistere soggetti portatori dell'anomalia con valori che sono ad appannaggio degli omozigoti normali. 6 3

4 Esami basati sui prodotti genici 4 Identificazione degli eterozigoti 2 Nella figura è riportata l'attività del fattore VII in cani Beagle espressa logaritmicamente, con le distribuzioni dei campioni di sangue degli eterozigoti conosciuti invertite rispetto all'asse dell'ascisse, per meglio dimostrare quanto poco esse si sovrappongono alle distribuzioni dei cani riconosciuti come non portatori del gene responsabile di questa deficienza. Con una soglia discriminante di 1,92 il test ha identificato il genotipo di 64 cani su 69 studiati. 7 Esami basati sulla mutazione del DNA -1 Esami di scelta per la diagnosi e l identificazione dei portatori nelle razze in cui la mutazione sia stata caratterizzata a livello di sequenza di DNA (ad es. il test PCR nello Scottish terrier per la mutazione nella malattia di von Willebrand di tipo 3). Svantaggio: lo sviluppo dei test richiede ricerca, tempo e costi elevati e il test approntato in una razza non è trasferibile per altre razze Eccezioni quando la stessa malattia avviene in due razze con antenati comuni. Per es. : mutazione nel gene galattocerebrosidasi che determina il disordine neurologico denominato leucodistrofia globoide = Cairn terrier e West Highland White terrier mutazione per deficienza di PFK = Springer Spaniel inglese e 8 Cocker Spaniel americano 4

5 Esami basati sulla mutazione del DNA 2 Per sviluppare un test per una razza canina, deve essere sequenziato il gene in un cane della razza affetto e comparato con la normale sequenza del soggetto sano, rilevare la mutazione causale e quindi sviluppare un test DNA per differenziare il DNA normale ed il mutante. La mutazione è differente per ciascuna razza Vedi lavoro di Mellersh C., Mamm Genome Esami basati sul legame di DNA (linkage DNA) Sono testati una serie di marcatori genetici che spaziano nel genoma per cercare la correlazione con le malattie Se almeno un marcatore è abbastanza vicino al locus del gene della malattia questo raramente è separato nella ricombinazione genetica durante la trasmissione dei segmenti cromosomici da una generazione all altra e quindi può essere usato per tracciare l allele mutante nel pedigree. Il marcatore può essere usato anche se l identità molecolare del gene che esplora non sia nota (assenza di specie-specificità) Vantaggi - aiuto nel riconoscimento dei portatori Esempio impiego - predire il genotipo del difetto autosomico recessivo denominato Tossicosi da rame, una malattia ereditaria del fegato indotta da accumulo di rame nel Bedlington terrier. 10 5

6 Esami basati sul legame di DNA (linkage DNA) - Svantaggi Non sono così definitivi come i test basati sulla mutazione poiché hanno un certo errore dovuto alla possibile ricombinazione tra il marcatore ed il gene della malattia (più lontano è il marcatore dal locus della malattia, più grande è la probabilità che la ricombinazione o la segregazione determinino una impropria classificazione degli animali tramite il test). Possono essere costosi e più dispendiosi in termini di tempo rispetto ai test basati sulla mutazione, dal momento che richiedono la tipizzazione dei marcatori nei genitori e nella prole delle famiglie Possono essere utili solo se il marcatore legato in questione sia polimorfico e che quindi possa essere tracciato ed evidenziato nella famiglia sotto indagine 11 Esami basati sul legame di DNA 3 Il primo passo nel valutare se un gene candidato è il gene causale è di stabilire la variazione genetica in un segmento di DNA vicino al gene candidato. Questi segmenti di DNA geneticamente variabili sono denominati microsatelliti. Il DNA comprende una lunga sequenza di 4 basi nucleotidiche, adenina, guanina, citosina e timina (A,G,C,T). Circa 1% del genoma codifica il DNA cioè codifica per un prodotto genico, mentre rimanente 99% non è codificante (ancora un mistero). 12 6

7 Esami basati sul legame di DNA 4 Il DNA non codificante forse fornisce delle distanze o spazi tra i geni codificanti. Nelle regioni non codificanti il DNA può ripetersi per 20 o più volte. Le ripetizioni composte sono di due basi nucleotidiche (dinucleotide), di tre (trinucleotide), quattro (tetranucleotide). Queste ripetizioni del DNA sono chiamate nell insieme come microsatelliti. Il termine satellite di DNA era precedentemente usato per denominare segmenti più lunghi di DNA ripetitivo. 13 Esami basati sul legame di DNA 5 I microsatelliti sono utili perché mostrano un elevata quantità di variazione genetica nella popolazione. Questa variazione, avviene poiché le coppie di cromosomi si appaiano alla meiosi e la segregazione può avvenire in un area del segmento ripetitivo. Se la ricombinazione avviene mentre il segmento ripetitivo non é appaiato si formano due aree ripetitive addizionale di differente ampiezza. I microsatelliti attraverso questo processo e con l evoluzione tendono ad accumulare nella popolazione varianti di dimensioni diverse. (vedi figura) 14 7

8 Visione di un microsatellite non appaiato alla meiosi che genera un segmento CA 11 ed un segmento CA 9 da due segmenti originali CA Esami basati sul legame di DNA 6 Il genoma dei mammiferi incluso quello del cane ha decine di migliaia di microsatelliti che possono essere usati come fonte pronta o disponibile di variazioni genetiche. La dimensione dei marcatori genetici microsatelliti può essere rilevata per mezzo di elettroforesi su gel più grande è il DNA più lentamente migra nel gel. Ciascun marcatore o allele è ereditato come ogni altro pezzo di DNA. 16 8

9 Esami basati sul legame di DNA 7 E possibile l uso di marcatori microsatelliti, cioé si seleziona un marcatore specifico in prossimità e legato al gene candidato. Un marcatore microsatellite fornisce la variazione genetica necessaria per determinare se il gene candidato è altrettanto contemporaneamente ereditato come il gene della malattia. Questo esperimento è necessario per sapere se il gene candidato sia in verità il gene della malattia. In alternativa i microsatelliti possono essere usati per un indagine molto più ampia del genoma. 17 Esami basati sul legame di DNA 8 (A) La popolazione canina sotto studio ha tre varianti di dimensione 24, 22, e 20 ed una particolare ripetizione CA. (B) I risultati di un elettroforesi su gel per testare e rilevare le varianti di dimensioni. Ciascuna colonna rappresenta un campione di DNA posizionato all origine. Le ripetizioni di CA di diverse dimensioni migrano a differenti distanze. 18 9

10 Esami basati sul legame di DNA 9 Negli studi di linkage sono usati i microsatelliti per valutare se un gene candidato è attualmente e correntemente legato al gene della malattia Per rilevare mutazioni causali a causa delle difficoltà nello studio delle sequenze l approccio tramite il linkage è molto più conveniente della sequenziazione del gene per intero Per eseguire uno studio di linkage sono campionati da una razza almeno pedigree ciascuno contenente un minimo di due cani affetti, e si stabilisce l associazione del microsatellite con il primo gene candidato E necessario avere una variazione genetica rilevabile associata con il gene candidato per testare se quella particolare variazione genetica è co-ereditata con il gene della malattia nel pedigree. (vedi figura) 19 Sia nell A che nel B i genitori della generazione I, sono eterozigoti per i due alleli (essi hanno entrambe l allele 1 che 2) A) Esempio di co-segregazione - Entrambi i figli affetti (generazione II) hanno lo stesso tipo 1,1 e nessuno soggetto della progenie sana ha questo tipo. Questi dati sono consistenti con la co-segregazione di un gene di malattia e di un gene candidato e suggeriscono che il gene della malattia è legato con il marcatore tipo 1 in entrambi i genitori. B) mancanza di co-segregazione - il linkage stretto è escluso poiché i figli affetti hanno differenti tipi di alleli chiamati genotipi ed i figli non affetti condividono il genotipo dei figli affetti

11 Esami basati sul legame di DNA 10 (linkage su pedigree) Una volta trovato il linkage tra microsatellite e gene della malattia può essere utilizzato per sviluppare un test di linkage su pedigree Poiché il marcatore su DNA di questo tipo è in qualche modo distante dal gene della malattia è possibile una piccola percentuale di errore a causa della ricombinazione genetica (la ricombinazione è un evento che separa i due alleli). Consulenza in termini di probabilità (p.e. probabilità 95% per cane esente) Svantaggi - Il pedigree usato per stabilire un linkage deve includere almeno un cane affetto, la prova su cani singoli è impossibile. Di conseguenza i cani in molti pedigree non possono essere valutati poiché il loro pedigree non include un animale affetto Questo approccio è molto più costoso perché devono essere saggiati molti cani 21 Test di linkage su pedigree microsatellite con alleli 1 e 2 precedentemente dimostrato essere legato al gene della malattia (A) L animale 4 determina il linkage per l intero pedigree. E affetto ed è di tipo 2.2 che indica che l allele della malattia è sul cromosoma con il marcatore 2 ed è stato ricevuto da entrambi i genitori. Conclusioni: soggetto 1 esente, 2, 3 e 5 portatori e 6 può avere la malattia (B) Presente lo stesso gene della malattia, razza e marcatori ma è differente la fase di linkage. L allele della malattia viaggia sul cromosoma col marcatore 1. L animale 7, è malato e di tipo 1.1. Inoltre l animale 9 è esente, mentre sarebbe stato classificato come affetto nel pedigree dell esempio A

12 Test di legame DNA Linkage disequilibrium Se il marker di linkage è sufficientemente vicino al gene della malattia può essere presente un linkage disequilibrium e può portare ad un test DNA di qualità superiore di quello creato usando un test di linkage solo sul pedigree. Il linkage disequilibrium avviene quando un particolare allele marcatore sia associato con l allele della malattia ad una frequenza sproporzionatamente più elevata, mentre un altro marcatore allele è altamente associato con il gene normale. Il linkage disequilibrium permette al test di linkage su pedigree di essere convertito ad un test di linkage per marcatore e permette di saggiare singoli cani piuttosto che il loro pedigree. Come avveniva per il test di linkage su pedigree le probabilità ottenute possono essere usate per la consulenza agli allevatori. 23 Test di legame DNA - Linkage disequilibrium I cani diagnosticati come malati hanno prevalentemente il genotipo con marcatore 2.2 anche se il marcatore allele 1 è più frequente nella popolazione. C è quindi un forte squilibrio. Il marcatore 2 è predominante sui cromosomi legati all allele della malattia, mentre l allele del marcatore 1 è predominante sui cromosomi legati con l allele normale. La colonna dei sani include sia portatori del gene della malattia che sono prevalentemente di genotipo 1.2 ed animali esenti che sono prevalentemente di genotipo 1.1. Con questi dati i veterinari possono fare consulenza per gli allevatori con una confidenza superiore al 95% stabilendo che gli animali 1.1 sono esenti, i soggetti 1.2 sono portatori, ed i soggetti 2.2 sono affetti o malati