METABOLISMO E FARMACOGENETICA

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1 PRICIPI DI FARMACCIETICA FARMACDIAMICA E FARMACGEETICA: METABLISM E FARMACGEETICA M. Zucchetti & R. Frapolli

2 Assorbimento Distribuzione METABLISM l insieme delle reazioni di biotrasformazione che portano alla modifica della struttura chimica di un composto Eliminazione

3 L importanza del metabolismo dei farmaci Il rene svolge un ruolo importante nell eliminazione di farmaci con adeguate caratteristiche di polarità a ph fisiologico e con un volume molecolare ridotto. La maggior parte dei farmaci non possiede queste proprietà chimico-fisiche ma tende ad essere lipofila e non ionizzata a ph fisiologico. Il metabolismo rappresenta un processo alternativo alla filtrazione renale per porre fine o modificare l attività biologica di un farmaco.

4 L importanza del metabolismo dei farmaci Il sistema responsabile del metabolismo dei farmaci è lo stesso deputato a proteggere l organismo dagli effetti tossici di sostanze estranee (xenobiotici); L obiettivo di questo sistema è quello di modificare le proprietà fisiche di uno xenobiotico da quelle che favoriscono l assorbimento (lipofilia), a quelle che favoriscono l escrezione nelle urine o nelle feci (idrofilia).

5 Dove avviene il metabolismo dei farmaci? Il fegato è la sede principale del metabolismo sebbene altri tessuti quali il tratto gastrointestinale, i polmoni, la cute e i reni possiedano notevole capacità metabolizzante. P.. Lume intestinale Parete intestinale Vena porta Arteria epatica I.V. Ricircolo Bile CIRCLAZIE SISTEMICA FEGAT FECI METABLISM I farmaci somministrati p.o. possono subire biotrasformazioni già a livello intestinale o epatico prima di raggiungere la circolazione sistemica: EFFETT di PRIM PASSAGGI

6 Classificazione delle reazioni metaboliche Le reazioni di biotrasformazione catalizzate da enzimi vengono generalmente divise in 2 gruppi: Reazioni di fase I: espongono o introducono un gruppo funzionale (-H, -H2, -SH o CH). Generalmente portano ad un leggero incremento dell idrofilia della molecola. Reazioni di fase II: sono reazioni di coniugazione nelle quali un cofattore reagisce con un gruppo funzionale già presente nella molecola oppure introdotto o esposto durante la fase I. La maggior parte delle reazioni di fase II porta ad un forte aumento dell idrofilia della molecola facilitandone l escrezione.

7 Esempi di reazioni di fase I Classi di reazioni ssidazioni Aromatiche o Alifatiche -dealchilazioni S-dealchilazioni -dealchilazioni -ossidazione Deaminazioni Desulforazione Riduzioni Azoriduzioni itroriduzioni Idrolisi Esteri Amidi Modifica strutturale RCH 2 CH 3 RCH 2 CH 2 H RHCH 3 RH 2 +CH 2 RSCH 3 RSH+CH 2 RCH 3 RH+CH 2 RH 2 RHH RCHCH 3 RCHCH 3 H 2 R 1 C S RC R 2 R 2 R R 1 RH 2 +R 1 H 2 R 2 R RH RH 2 R 1 CR 2 R 1 CH+R 2 H R 1 CHR 2 R 1 CH+R 2 H 2 Propranololo, fenobarbital etinilestradiolo Morfina, caffeina,teofillina 6-metiltiopurina Codeina Anilina, paracetamolo, nicotina Anfetamine, diazepam Tiopental Prontosil Esempi Cloramfenicolo, clorazepam Procaina, aspirina Procainamide, lidocaina

8 Citocromo P450 E il più importante sistema enzimatico coinvolto nelle ossidazioni di fase I; Classe di enzimi noti come ossidasi a funzione mista localizzati nelle membarane lipofile di reticolo endoplasmico liscio; Emoproteine di circa 50 KDa, che catalizzano la monoossidazione di un ampia varietà di composti non correlati strutturalmente; ltre 55 isoforme identificate;

9 Classificazione degli enzimi P450 Viene effettuata in base alla sequenza aminoacidica: Famiglie (1,2,3, ): quando le sequenze sono identiche per almeno il 40% Sottofamiglie (2A,2B,2C, ): quando le sequenze sono identiche per il 40-55% Quando l identità di sequenza supera il 55% gli enzimi vengono classificati come membri della stessa sottofamiglia (2A1, 2A2, ) egli esseri umani CYP3A4 è l isoforma più abbondante e insieme a CYP2D6 e CYP2C è responsabile della maggior parte del metabolismo di farmaci.

10 Ciclo catalitico del citocromo P450 Le ossidazioni microsomiali dei farmaci richiedono oltre al citocromo P450, l enzima citocromo P450 reduttasi, il ADPH e ossigeno. (RH) ½ ADPH ½ ADP + Fe III Fe III (RH) Fe II (RH) RH +H 2 Cit. P450 reduttasi 2 Fe II H (RH) Cit. P450 reduttasi Fe II ( 2 )(RH) ½ ADP + +H 2 ½ ADPH +H +

11 Reazioni di fase II Includono le reazioni di glucuronazione, solfatazione, coniugazione con glutatione, acetilazione, metilazione e coniugazione can aminoacidi. Ad eccezione della acetilazione e della metilazione determinano un aumento dell idrofilicità del substrato. La maggior parte degli enzimi di fase II sono localizzati nel citosol. UGTs sono microsomiali. GLUCURAZIE: Sono catalizzate da UDP glucuronosiltransferasi (UGT). Richiedono come cofattore l acido uridin di-fosfo glucuronico (UDPGA). Il sito di glucuronazione è in CH genere un atomo elettronricco (,..), quindi i H H H possibili substrati sono H P P alcoli alifatici, fenoli, acidi H H H carbossilici, amine alifatiche e aromatiche. H H

12 SLFATAZIE: Catalizzata da sulfotransferasi, utilizza come cofattore la 3 fosfoadenosina-5 fosfosolfato (PAPS). H 2 H S P H H Substrati di questa reazione sono fenoli e alcoli alifatici, ma anche amine aromatiche P 3 -- METILAZIE Catalizzate da metiltransferasi. Cofattore è la S-adenosil metionina (SAM). Il gruppo metilico viene trasferito su eteroatomi (,, S). HC H 2 C H 3 S + H H H 2 Riduce l idrofilia e maschera gruppi funzionali che potrebbero venire coniugati da altri enzimi di fase II

13 ACETILAZIE: Catalizzata da -acetiltransferasi. Cofattore per questa reazione è H 2 l Acetil coenzima A. Come per la metilazione, anche l acetilazione H 3 C rende i metaboliti meno H C CH C CH 2 P P idrosolubili del composto CH H 2 CH 3 H H genitore. Sono substrati di CH 2 questa reazione le amine H C aromatiche e idrazine. H CH 2 CH 2 S C CH 3 P 3 -- CIUGAZIE C AMI ACIDI: Coniugazione di xenobiotici contenenti gr.carbossilici con il gruppo aminico di AA quali glicina, glutammina o taurina. Il substrato viene attivato mediante coniugazione con il Coenzima A. L enzima coinvolto è l aminoacido acil transferasi La coniugazione con AA può facilitare l eliminazione favorendo l interazione con il sistema dei trasportatori di anioni organici a livello dei tubuli renali.

14 CIUGAZIE C GLUTATIE: E un importante reazione di detossificazione. Il glutatione è un tripeptide composto da glicina, cisteina e acido glutammico. Sono soggetti a coniugazione con glutatione un ampia varietà di substrati elettrofili, che danno origine alla formazione di tioeteri. La reazione è catalizzata dalla Glutatione S-transferasi. CH HC CH 2 CH 2 C H H 2 Ac. glutammico C CH CH 2 SH H CH 2 CH Glicina I coniugati con glutatione formati nel fegato possono essere eliminati come tali nella bile o convertiti in ac. Mercapturici ed escreti nelle urine Cisteina

15 Possibili effetti del metabolismo: Inattivazione: le modifiche introdotte alterano la struttura o la carica della molecola rendendola incapace di esercitare l azione farmacologica/tossica. Es Thiopental: H C C C 2 H 5 CH C 2 H 5 CH C 2 CH 3 H C CH CH 2 CH 2 CH CH 3 S C H C CH 3 S C H C CH 3 H Metabolita inattivo

16 Possibili effetti del metabolismo: Formazione metaboliti attivi: le modifiche introdotte mantengono l attività biologica del farmaco.talvolta il metabolita può risultare più attivo della molecola originale e/o rimanere nell organismo più a lungo con il rischio di effetti tossici. Es Codeina: CH 3 CH 3 H 3 C H H H Morfina: migliore affinità per il recettore degli oppioidi

17 Possibili effetti del metabolismo: Attivazione di pro-drugs: il composto somministrato non è farmacologicamente attivo ma necessita di essere trasformato per svolgere la propria azione farmacologica. Es Ciclofosfamide: CH 2 Cl Cl P H Cl FASE I P450 Cl P H H Cl Cl Cl ALDEIDE DEIDRGEASI P P H 2 HC HC ACRLEIA TSSICA β ELIMIAZIE Cl P H 2 - Cl H 2 HC Cl FSFRAMIDE MET. ATTIV

18 RICIRCL ETEREPATIC: Farmaci e metaboliti che vengono escreti con la bile possono essere riassorbiti dall intestino. Glucuronidi e solfati che evengono escreti con la bile possono venire idrolizzati da glucuronidasi e arilsulfatasi, enzimi prodotti dalla microflora intestinale ed essere riassorbiti. Il ricircolo enteroepatico può rallentare l eliminazione dello xenobiotico prolungandone gli effetti sull organismo.

19 Fattori che influenzano il metabolismo dei farmaci: a) Età: nel neonato gli enzimi di fase I e fase II divengono maturi tra la seconda e la terza settimana post-parto, negli anziani (>80 anni) si osserva una riduzione della massa epatica (20-50%) e una diminuizione dell attività P450. L impatto sulla clinica resta da definire. b) Stati patologici: epatiti, cirrosi ed epatocarcinoma possono comportare riduzione della capacita metabolica epatica. c) Alimenti, prodotti naturali e inquinanti ambientali: il succo di pompelmo è un inibitore del CYP 3A4 intestinale (un singolo bicchiere può inibire l enzima per a h). Ciò provoca un aumento della biodisponibilità dei composti soggetti a metabolismo enterico. Contrariamente l Erba di S. Giovanni (iperico) induce la trascrizione del CYP 3A4 e dell UGT. Idrocarburi policiclici aromatici e il fumo di sigaretta sono potenti induttori del CYP1A. d) Interazioni tra farmaci: possono portare a induzione o inibizione dell attività enzimatica.

20 Induzione enzimatica Si verifica quando somministrazioni ripetute di alcuni farmaci portano ad aumentare l espressione o a diminuire la degradazione degli enzimi con conseguente accelerazione del metabolismo; ella maggior parte dei casi comporta una diminuizione dell attività farmacologica della sostanza induttrice stessa (autoinduzione) o di farmaci co-somministrati; el caso di farmaci attivati dal metabolismo può causare aumento dell attività o della tossicità; Causa diminuizione della biodisponibilità di farmaci soggetti a effetto di primo passaggio; Sostanze diverse possono indurre isoforme diverse del cit. P450: CYP 1A1 idrocarburi policiclici aromatici CYP 3A4 macrolidi, anticonvulsivanti, glucocorticoidi CYP 2E1 uso cronico di etanolo

21 Inibizione enzimatica Causa una ridotta biotrasformazione del famaco parentale con incremento dei livelli plasmatici e quindi prolungamento dell effetto farmacologico e/o tossicità (farmaci a basso indice terapeutico). Diversi meccanismi: 1) Competizione tra due o più substrati per lo stesso sito attivo dell enzima; 2) Inibizione irreversibile per formazione di legami covalenti con l enzima o distruzione del gruppo prostetico; 3) Deplezione dei cofattori degli enzimi di fase II. Sono cambiamenti rapidi, spesso prevedibili sulla base di una certa selettività dell inibitore per una isoforma enzimatica: CYP3A4 Ritonavir, eritromicina, claritromicina; CYP2D6 Quinidina, inibitori del reuptake della serotonina; CYP2C19 meprazolo.

22 Fattori che influenzano il metabolismo dei farmaci e) Variabilità genetica tra individui: polimorfismi negli enzimi coinvolti nel metabolismo di farmaci sono alla base di variazioni del metabolismo e della farmacocinetica di diversi agenti terapeutici. Lo studio di come le variazioni genetiche influenzano la risposta ad un farmaco è la FARMACGEETICA. Il termine farmacogenetica è stato coniato nel 1959 con l osservazione di differenze etniche nella frequenza di reazioni avverse ad alcuni farmaci suggerendo la possibilità che la variabile risposta ai farmaci potesse avere basi ereditarie. Es Isoniazide 2 popolazioni Acetilatori lenti (70 % delle popolazioni medio orientali e 50% dei caucasici) e acetilatori rapidi. Gli acetilatori lenti hanno una > predisposizione alla neuropatia indotta da isoniazide.

23 Farmacogenetica e farmaci antitumorali Gli studi di farmacogenetica sono particolarmente rilevanti in oncologia perché: Farmaci antitumorali hanno spesso un basso I.T.; Molti di essi necessitano di biotrasforamazione per essere attivati; Le forme attive sono generalmente tossiche e necessitano di reazioni di detossificazione; Presentano frequentemente una notevole variabilità interindividuale. L aggiustamento della dose sulla base della sola superficie corporea non è sufficiente. ecessità di identificare fattori genetici che contribuiscono alle variazioni di risposta tra pazienti

24 Tipi di polimorfismi che influenzano la risposta ai farmaci a) Polimorfismi in geni del tumore e/o dell ospite possono regolare l ingresso, la permanenza e l eliminazione del farmaco dal tumore. b) Polimorfismi del genoma tumorale possono influenzare la risposta del tumore al farmaco. c) Polimorfismi dell ospite possono determinare un diverso rischio di tossicità.

25 6 MERCAPTPURIA (MP) è un prodrug: viene convertito in tioguanina nucleotide (TGs) che incorporato nel DA è responsabile dell effetto antileucemico e tossico. L enzima tiopurina metiltransferasi(tpmt) metila MP prevenendone l attivazione. 0.3% della popolazione presenta mutazioni omozigoti e non esprime TPMT funzionali richiedono riduzione delle dosi fino a 1/10 della dose normale IL 10 % circa della popolazione è eterozigote necessita solo modesti aggiustamenti del dosaggio Il rimanente 90% è wild-tipe ed ha attività TPMT normale

26 5 FLURURACILE (5FU) Attivato a 5FdUMP, inibisce la timidilato sintasi (TS). La diidropirimidina deidrogenasi (DPD) è l enzima responsabile dell inattivazione di 5FU nel fegato. el 3% della popolazione (0.1% omozigote) una mutazione all esone 14 (G A) porta alla sintesi di DPD non funzionale. Polimorfismi a carico della TS:Presenza di 3 tandem repeats di 28 paia di basi nella regione enhancer del gene è associata con una > attività della TS e quindi < probabilità di risposta al 5FU rispetto a pazienti con 2 tandem repeats

27 IRITECA viene attivato a S38 dall enzima carbossiesterasi (CE). el fegato S38 viene glucuronato dall enzima UGT1A1 ed escreto con la bile.tale isoforma è ridotta nei pazienti con sindrome di Gilbert (iperbilirubinemia lieve non coniugata) el promotore del gene UGT1A1 la presenza di 7TA repeats (variante UGT1A1*28) porta ad una ridotta attività dell enzima UGT1A1 rispetto ai promotori con 6 TA repeats. Accumulo di S38 e tossicità

28 Esempi di tecniche per lo studio del metabolismo a) Tecniche in vitro o ex-vivo: Frazioni subcellulari Microsomi Frazione S9 Mitocondri Cellule intatte Epatociti Fegato perfuso b) Tecniche in vivo: Incanulazione del coledoco per raccolta bile (ratto) Gabbie metaboliche per raccolta differenziata di feci e urine Analisi dei campioni mediante tecniche di HPLC e HPLC/MS

29 Esempi di tecniche per lo studio del metabolismo: frazioni subcellulari FRAZIE S9 mogenato cellulare centrifugato a 9000g x min per rimuovere nuclei, mitocondri. Contiene tutti i principali enzimi di fase I e II. E ideale per screening iniziali per poi selezionare il sistema più adeguato per approfondire lo studio. MICRSMI Si ottengono dalla frazione S9 centrifugando a g x 1h. Sono il modello più utilizzato per la facilità di preparazione e di conservazione. Contengono i principali enzimi coinvolti nel metabolismo dei farmaci (non quelli citosolici). L utilizzo di frazioni subcellulari necessita l aggiunta di cofattori nel medium di incubazione (ADPH, UDPGA ). Hanno lo svantaggio di perdere la localizzazione e la sequenzialità delle reazioni dovute ai diversi compartimenti cellulari.

30 Esempi di tecniche per lo studio del metabolismo: cellule intatte EPATCITI Si ottengono disgregando il tessuto epatico mediante perfusione con collagenasi. Conservano le funzionalità della cellula intera con tutti gli enzimi di fase I e II, ma sono più complessi da preparare e da conservare vitali. FEGAT PERFUS Consente di definire il contributo di tutto l organo al metabolismo sistemico del farmaco facendolo pervenire al tessuto attraverso la via fisiologica (vena porta). La funzionalità epatica durante la perfusione viene controllata mediante la produzione di bile (1-1.4 µl/min/g con infusione di taurocolato). E un modello più complesso rispetto ai precedenti e sebbene fornisca un maggior numero di informazioni viene frequentemente sostituito da tecniche in vitro di più facile applicazione.