RELAZIONE RIGUARDANTE L INDICAZIONE DETTAGLIATA DEL PROGETTO DI RICERCA. Allegato 1. Dipartimento di Fisica Università degli Studi di Trieste

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1 RELAZIONE RIGUARDANTE L INDICAZIONE DETTAGLIATA DEL PROGETTO DI RICERCA Allegato 1 ICGEB AREA di Ricerca Loc. Padriciano 99, TS bruschi@icgeb.org Dipartimento di Fisica Università degli Studi di Trieste Via Valerio 2, Trieste giannini@ts.infn.it CRAB-10 (Cellll Response to o Actiivated Boron-10) Rissposstta cceel llularree all atttti ivazzi ionee dii borro--10 ccon neeuttrroni i tteerrmal lizzzzatti i:: eeffffeetttti i geeneetti icco--mol leeccol olarri i,, impli liccazzi ionii dii rradi iotteerrapi ia onccol logicca osspeedal d lieerra,, prroduzzi ionee ee dossi imeettrri ia dii neeutrroni t i 1

2 Sommario L uso di acceleratori ospedalieri per produrre cospicui flussi di neutroni utilizzabili nella promettente radioterapia con cattura di neutroni su Boro (BNCT, Boron Neutron Capture Therapy) può rendere tale metodologia di più rapida ed efficiente applicazione, aprendo la strada alla possibilità di cura per alcune patologie tumorali altrimenti intrattabili. E proposto un piano di ricerca ad ampio respiro che estende le relative attività già in corso a Trieste nel campo della fisica subnucleare e le integra con le indagini genetico-molecolari della risposta cellulare all irradiazione neutronica ed in particolare dell effetto delle radiazioni emesse dal boro-10 attivato sul DNA di cellule eucariotiche. L approccio, unico ed altamente multidisciplinare, proposto da un vasto team con competenze specifiche nei diversi campi, crea un occasione unica per ottenere con metodi integrati di genetica, biologia molecolare, e fisica nucleare, una serie di realizzazioni nel campo dell elettronica, dosimetria per radioprotezione e medicina nucleare che fornir risultati di ricerca fondamentale ed anche ricadute d elevato interesse applicativo e produttivo per alcune realtà industriali e imprenditoriali nella Regione Friuli Venezia Giulia. Il simbolismo del progetto, CRAB(il Granchio)/Cancer(il Cancro) che prende il Boro 10 per esserne distrutto, rappresenta la finalità e la strategia adottata nella terapia oncologica proposta. INDICE INTRODUZIONE 3 1. PIANO STRATEGICO DEL PROGETTO 4 2. PIANO DETTAGLIATO DELLA PRIMA FASE DEL PROGETTO RISPOSTA CELLULARE ALL ATTIVAZIONE DEL 10 B PRODUZIONE E DOSIMETRIA DI NEUTRONI DOSIMETRIA E MISURE PRESSO IL SINCROTRONE MISURE PRESSO L OSPEDALE MAGGIORE DI TRIESTE 15 3 RISULTATI PREVISTI E RICADUTE RISULTATI SCIENTIFICI RICADUTE TECNOLOGICHE INIZIATIVE DI TRASFERIMENTO E DIFFUSIONE DELLA RICERCA E FINALITA BIBIOGRAFIA 18 2

3 INTRODUZIONE Nonostante gli indubbi progressi della radioterapia, ci sono dei tumori gravati da pessima prognosi in cui oltretutto non è possibile pensare ad una dose escalation di radioterapia perché si comprometterebbe la funzionalità degli organi critici circostanti. I primi studi sull impiego della BNCT (Boron Neutron Capture Therapy) risalgono agli anni 60 ma i risultati non furono incoraggianti, sopratutto perché non si disponeva di composti contenenti boro che si accumulassero preferenzialmente nelle cellule dei tessuti neoplastici. Da qualche anno si è sviluppata, in questo settore, una linea di ricerca sull utilizzo di una molecola (la fenilalanina o 10 BPA, vedi figura sopra a sinistra) che si accumula in maggior quantità nei tessuti neoplastici, permettendo ad un fascio di neutroni lenti (termici) di liberare una notevole quantità di energia interagendo con il boro, sotto forma di particelle α e di nuclei di litio-7 (figura sopra, al centro). Il piccolo raggio d azione dell energia liberata (circa il diametro di una cellula) permette così di rispettare i tessuti sani (figura sopra, a destra; figura a fianco). Il primo tipo di tumore trattato con questa metodologia è stato il glioblastoma multiforme, mentre vi sono segnalazioni riguardanti il trattamento di tumori dei seni paranasali, di melanomi cutanei delle estremità e di metastasi epatiche da adenocarcinoma del retto. Negli ultimi dieci anni sono stati trattati circa 40 pazienti affetti da glioblastoma che erano già stati operati (debulking): la sopravvivenza media è comparabile a quella che si trova in letteratura (14 mesi ) ma è stata ottenuta con una singola seduta di trattamento invece che una serie di sedute. Va segnalato che non si sono osservati effetti collaterali dopo il trattamento stesso. A Pavia nel 2001 un caso di metastasi epatiche diffuse è stato curato e completamente guarito col metodo dell espianto d organo e irradiazione con neutroni termici e BNCT presso il reattore nucleare di ricerca nell ambito del progetto INFN-TAORMINA (Trattamento Avanzato d Organi Mediante Irraggiamento Neutronico e Autotrapianto). I risultati finora ottenuti nel mondo sono incoraggianti ma mostrano anche la necessità di miglioramenti e l esistenza di ampi margini di progresso che sono alla base della nostra proposta. 10 B- 3

4 L uso di acceleratori ospedalieri per produrre cospicui flussi di neutroni, infatti, rende superata la necessità di disporre di un reattore nucleare, sostituendolo con apparecchiature normalmente disponibili in ambiente ospedaliero; mentre lo studio approfondito dell effetto e dei meccanismi di assunzione della boro-fenilalanina a livello cellulare permetterà di ottimizzare le dosi e i protocolli di somministrazione dei carrier del 10 B. Dopo la fase preliminare sarà possibile, grazie alle tecnologie ed ai risultati ottenuti, l eventuale sviluppo di carrier specifici mirati mediante tecniche avanzate di biologia molecolare e ingegneria genetica. Il progetto si basa su studi precedenti, portati avanti da alcuni dei proponenti, che mostrano la possibilità di produrre neutroni termici utilizzando gli stessi acceleratori normalmente utilizzati nei dipartimenti ospedalieri di radioterapia oncologica. Il prototipo realizzato a Trieste è un convertitore fotoneutronico per il quale è stato depositato un brevetto dall Università di Trieste (vedi le due foto sotto). Il fotoconvertitore è in grado di moderare i neutroni (ottenuti dalla conversione dei fotoni), fino ad un energia (termica/epitermica) ottimale per la cattura da parte dei nuclei del 10 B. Ciò avviene facendo passare i neutroni attraverso diversi strati di materiale di varie composizioni e densità (acqua pesante, grafite, teflon) in modo da filtrare i neutroni veloci permettendo il passaggio a quelli via via più lenti. La disponibilità di neutroni termalizzati consente una maggiore probabilità della loro cattura da parte dell isotopo stabile 10 B e della sua conseguente scissione nelle due particelle ad alta energia. Disporre di tale attrezzatura aumenterà di molto la facilità di gestione della tecnica e riteniamo che ne faciliterà la diffusione presso altri ospedali, all interno ed al di fuori della Regione FVG, La collaborazione tra fisici, medici, biologi molecolari e genetisti permetterà uno studio approfondito di tutti gli aspetti multidisciplinari della metodologia. 1. PIANO STRATEGICO DEL PROGETTO Il conseguimento di obiettivi così ambiziosi impone necessariamente di formulare un piano di lavoro a lunga scadenza la cui definizione dettagliata non può prescindere da un accurata pianificazione delle fasi iniziali i cui risultati, siamo certi, apriranno nuovi campi di sviluppo e investigazione particolarmente interessanti. A questo scopo, tracciamo qui un piano di ricerca di cui dettagliamo il primo anno ed indichiamo le fonti di finanziamento già assicurate. Presentiamo poi, in prospettiva, gli obiettivi che intendiamo perseguire in futuro tramite la richiesta di finanziamenti all Unione Europea, in collaborazione con il Sincrotrone Elettra e l Azienda Ospedaliera di Trieste, al fine di raggiungere lo scopo finale d applicabilità terapeutica della tecnologia in oggetto. 4

5 1.1. Attività già finanziata L ottimizzazione della produzione dei neutroni mediante acceleratore LINAC ospedaliero è oggetto di un progetto (PHONES PHOto Neutron Source) finanziato dall INFN (Istituto Nazionale di Fisica Nucleare) per Euro di cui Euro specificamente destinati alla realizzazione di un prototipo di fotoconvertitore. Considerato che i proponenti del progetto PHONES che afferiscono alla Sezione di Trieste dell INFN sono gli stessi della presente proposta e che s intende utilizzare, nell ambito del progetto proposto, il prototipo finanziato attraverso PHONES, i Euro costituiscono, a tutti gli effetti, un co-finanziamento di CRAB Attività per cui sono richiesti i finanziamenti Sulla base dei risultati preliminari ottenuti in campo fisico, questo progetto prevede la caratterizzazione dei danni genetico-molecolari apportati dai frammenti nucleari del 10 B conseguenti alla cattura neutronica, in un sistema cellulare eucariotico modello, altamente caratterizzato e sperimentalmente manipolabile, come il lievito Saccharomyces cerevisiae. Su esso saranno verificati la frequenza di mortalità cellulare ed il tipo di danno genetico prodotto dalla radiazione, sia a livello cromosomico che di sequenza del DNA. Saranno inoltre studiati i geni, simili a quelli umani, la cui mutazione rende le cellule, e quindi l organismo, particolarmente sensibili al trattamento radioterapico, nonché l efficienza d induzione del meccanismo di apoptosi che si cerca di provocare specificamente all interno delle cellule tumorali. Si effettuerà anche uno studio preliminare della possibile produzione di nuovi sistemi di portatori specifici di 10 B sulle celle tumorali bersaglio che si vogliono eliminare. Questi sistemi comprendono anticorpi monoclonali contro antigeni tumorali specifici e peptidi sintetici fusi al segnale di localizzazione nucleare di proteine eucariotiche (SP-NLS). Tali sistemi permetterebbero una migliore specificità della BNCT rispetto all uso della BPA libera e la loro realizzazione sarà oggetto delle attività future di ricerca descritte di seguito Attività per cui saranno richiesti finanziamenti europei Di conseguenza al presente progetto regionale e grazie ai suoi risultati, riteniamo che possa delinearsi un attività futura di respiro internazionale che porterà alla formazione di una network europea, della quale conosciamo già i partners potenziali in Croazia, Slovenia, Austria, Svezia e Francia, per lo studio e l implementazione di nuovi e più sofisticati sistemi di carriers del 10 B direttamente sulla superficie o addirittura dentro il nucleo delle cellule tumorali bersaglio, di cui segue una breve sintesi Sviluppo di anticorpi monoclonali come vettori tessuto-specifici di boro-10 attivato. In seguito al clonaggio ed all espressione degli antigeni tumorali corrispondenti ai recettori dei fattori di crescita umani ErbB-3 o EGFR, i quali sono stati scelti come oggetto della presente proposta, queste proteine umane purificate saranno impiegate per l immunizzazione dei topi, seguita da isolamento di linfoblasti B dalla milza del topo 5

6 immunizzato e loro fusione con cellule non-secretorie di mieloma al fine di generare una libreria di cellule di ibridoma secernenti anticorpi (Little et al. 2000). Cloni di questi ibridomi saranno selezionati in seguito a uno screening e ad una conferma in vitro della specificità anticorpale. Inoltre, il cdna codificante per anticorpi monoclonali anti-erbb-3 oppure anti- EGFR, sarà subclonato nel vettore d espressione di mammiferi pcdna3.1/zeo, e verrà espresso nelle note linee cellulari CHO. Gli anticorpi monoclonali prodotti da suddette linee verranno marcati con boro per semplice aggiunta al terreno di crescita della boro-fenilalanina come aminoacido addizionale necessario per la sintesi proteica, entro i valori di concentrazione che consentono la normale proliferazione cellulare e che hanno una scarsa influenza sulla specificità anticorpale. Gli anticorpi monoclonali così ottenuti verranno dapprima impiegati unitamente al trattamento neutronico termico in esperimenti in vitro su appropriate linee di cellule tumorali e poi testati in vivo su topi esprimenti lo stesso tipo di tumore. 2.PIANO DETTAGLIATO DELLA PRIMA FASE DEL PROGETTO Di seguito dettagliamo il piano della prima fase del progetto per cui si richiede il finanziamento nei suoi aspetti di biologia molecolare, fisica e dosimetria. 2.1 RISPOSTA CELLULARE ALL ATTIVAZIONE DEL 10 B Genetica e biologia molecolare degli effetti del boro-10 attivato Come sistema cellulare eucariotico modello verranno impiegati gli stessi ceppi del lievito Saccharomyces cerevisiae ufficialmente utilizzati per il progetto di radiobiologia della NASA e validati durante due missioni del programma Space Shuttle dal Laboratorio di Microbiologia dell ICGEB, capofila della presente proposta (Bruschi e Esposito, 1995; Fig. 1). Di tale specie di microrganismo esiste un vasto database delle sue sequenze genomiche, (Tettelin et al., 1997) nonché una libreria di ceppi knock-out in ciascuno di tutti i suoi 6,400 geni, per cui risulta estremamente facilitata la manipolazione del suo background genetico e la ricerca di prodotti genici responsabili della riparazione dei danni al DNA prodotti dalle radiazioni (Gjuracic et al., 2004). A B 4µ 6µ Figura 1. A, ceppi del lievito Saccharomyces cerevisiae; B dimensioni di una cellula di lievito (4X6 µm). 6

7 Tali ceppi verranno ingegnerizzati geneticamente e selezionati per portare geni allelici del pathway metabolico dell adenina (ade1, ade2) che consentano l espressione fenotipica, sotto forma di colore, dell effetto degli eventi di ricombinazione genetica provocati dalle radiazioni ionizzanti sprigionatesi dal nucleo degli atomi di boro-10, cioè particelle α ed atomi di litio-7. Inoltre, i ceppi di lievito da impiegare per lo studio degli effetti genetici della BNCT, saranno trasformati geneticamente con il sistema plasmidico denominato HNS (Homologous, Nonhomologous, Single-strand annealing), utilizzabile come un cromosoma artificiale (Bruschi e Gjuracic 2001) che consente di verificare, su sequenze di DNA ben definito e facilmente recuperabile dopo il test, gli effetti delle radiazioni sia a livello molecolare che di sequenza del DNA. Il sistema HNS, rappresentato nella Figura 2, servirà in questo modo da bersaglio genetico cellulare vulnerabile alle radiazioni senza compromettere la vitalità della cellula ospite, in modo da poter recuperare il materiale genetico per analizzarne i danni molecolari dopo il trattamento. In una cellula del ceppo FAY1, dal background genetico indicato in alto, il plasmide HNS complementa la mutazione ade8, dando origine a cellule mutate ade1, ade2 di colore rosso, a causa dell accumulo di precursori metabolici colorati (regola di Roman). In seguito ad irraggiamento, la risoluzione per ricombinazione del plasmide HNS in due molecole plasmidiche distinte, di cui una priva di origine di replicazione, porta alla perdita del gene selvatico ADE8 che permette la pigmentazione rossa e quindi alla comparsa di colonie bianche o a settori (rosa), come illustrato nell immagine della piastra sulla destra. Questi fenotipi saranno poi verificati tramite un profilo di PCR ottenibile con i primers a e b, caratteristico della molecola ricombinante. Figura 2. Sistema diagnostico-molecolare HNS 7

8 2.1.2 Applicazione del sistema HNS Figura 3. CHEF gel elettroforesi dei cromosomi di una cellula di lievito, colorati con bromuro d etidio. Tali cellule di lievito, facilmente riproducibili in grande numero in un normale laboratorio di microbiologia, dopo essere cresciute in presenza ed in assenza di 10 B- phenilalanina, verranno opportunamente piastrate su terreno di crescita in capsule Petri da 10 cm di diametro, da includere in un contenitore di teflon unitamente ai dosimetri di neutroni a bolle, costituendo così dei bio-sensori con cui testare l effetto biologico dei neutroni, in modo simile a quello dei comuni dosimetri TLD. Le cellule, al termine del periodo di esposizione, saranno lasciate crescere in terreno ricco per consentirne l espressione del colore e delle dimensioni derivanti da eventuali danni genetici del DNA provocati dalle radiazioni, secondo il comportamento del sistema plasmidico HNS descritto in precedenza. Successivamente, le cellule trattate saranno soggette ad un'indagine di tipo genomicostrutturale riguardante sia l analisi generale del cariotipo per mezzo della tecnica CHEF (Contour-clamped Hexagonal Electrophoretic Field) che visualizza per cromatografia su gel i cromosomi del lievito (Fig. 3) (Tosato et al., in press), che la mappatura fine di eventuali mutazioni e polimorfismi per mezzo di tecniche di RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) e SNIP (Single Nucleotide Polymorphism) (Waghmare e Bruschi, in press) Lettura e rilevamento Al termine del periodo di crescita verranno stimati i seguenti parametri, ciascuno dei quali, singolarmente e complessivamente, indica un evento genetico caratteristico di dose di radiazione ionizzante: - numero delle colonie - numero delle colonie colorate - numero delle colonie di piccole dimensioni. Sulla base del colore delle colonie e del profilo di PCR, sarà possibile discriminare fra i seguenti eventi di riparazione ricombinazionale del DNA: - Crossing-over - conversione genica - single-strand annealing - non-homologous end joining 8

9 Sulla base di questi parametri sarà possibile risalire direttamente al valore globale di RBE (Relative Biological Effectiveness) corrispondente mettendolo in relazione con la misura diretta del flusso di neutroni somministrato effettuata dal sistema di monitoraggio illustrato più avanti Sviluppo di anticorpi monoclonali come vettori tessuto-specifici di boro-10 attivato Gli anticorpi monoclonali (mabs) sono proteine uniche nel riconoscere un particolare bersaglio molecolare e sono generalmente prodotte clonando il gene codificante un determinato anticorpo e creando una linea cellulare che esprime specificamente quel gene. Per le loro caratteristiche, mabs di topo non modificati, prodotti da linee cellulari di ibridomi murini, hanno costituito la prima ondata di reagenti immunoterapeutici approvati dalla FDA statunitense, sebbene le loro applicazioni siano rimaste limitate poiché somministrazioni ripetute provocavano una risposta immunitaria anti-immunoglobuline di topo (Carter 2001). L applicazione di tecnologie innovative basate sul DNA ricombinante, comprendenti la riduzione delle dimensioni dei mabs, la loro chimerizzazione ed umanizzazione ne ha ridotto l immunogenicità ed innalzato l efficacia terapeutica, portando così alla recente seconda ondata di approvazioni di nuove molecole con proprietà immunoterapeutiche da parte dell ente americano (Hudson and Soutiau 2003). Un ulteriore riduzione dell immunogenicità dei mabs è stata ottenuta per mezzo dello sviluppo di biotecnologie alternative che hanno permesso la selezione di anticorpi monoclonali totalmente umani da repertori naturali o artificiali. Queste tecnologie comprendono l uso di topi SCID-HU e transgenici (Brüggemann and Taussig 1997, Carballido et al. 2000). Quest ultimo approccio è molto attraente perchè il locus genico di un immunoglobulina umana, una volta introdotto nel genoma del topo, può essere riarrangiato, mutato e sostituito nel tessuto linfoide dell animale, in modo tale che, dopo l immunizzazione, questo produce lo specifico mab desiderato. Inoltre, i linfoblasti B di topi transgenici immunizzati che esprimono un anticorpo monoclonale specifico possono essere fusi con cellule di mieloma al fine di creare una linea cellulare di ibridomi che secerne quell anticorpo. Le applicazioni terapeutiche dei mabs sono virtualmente senza limiti: dalla terapia di malattie infettive ed autoimmuni al trattamento del rigetto dei trapianti, al cancro (Farah et al. 1998, Akdis and Blaser 2000, Hudson and Souriau 2001, Gura 2002). Nel campo del trattamento dei tumori i mabs rappresentano l approccio specifico più promettente, annoverando più di 250 sistemi terapeutici presenti oggi nella fase di ricerca, sviluppo e test clinici. Esistono otto terapie monoclonali del cancro approvate fino ad oggi (Tabella 1) e, in accordo al loro modo d azione, esse possono essere suddivise in due gruppi maggiori: mabs del sistema di segnalazione e mirati al bersaglio. I primi interferiscono con differenti meccanismi di segnalazione per raggiungere l effetto citotossico degli effettori del sistema immunitario. Rituximab (anti-cd20), Trastuzumab (anti-her2), Alemutzumab (anti- CD25), Etuximab (anti-egfr) e Bevacizumab (anti-vgf) appartengono a questo gruppo di mabs, causando apoptosi delle cellule tumorali per mezzo del blocco dell interazione 9

10 recettore-ligando per fattori normalmente responsabili della crescita del tumore. Gli anticorpi monoclonali mirati al bersaglio opsonizzano le cellule maligne e permettono ad effettori del sistema immunitario o a quelli attaccati artificialmente agli anticorpi stessi, di distruggere le cellule del tessuto tumorale. Esempi di questi sono il gentuzumab (anti- CD33) che porta la tossina cellulare calicheamicina, e l ibritumomab e lo tositumomab (anti CD-20), entrambi portanti dei radio-nuclidi per uccidere la cellula tumorale bersaglio. Nel presente progetto proponiamo l uso di mabs mirati come trasportatori di 10 B per la Boron Neutron Capure Theraphy (BNCT) di diversi carcinomi umani. Ciò rappresenta un approccio innovativo per l applicazione della BNCT, permettendo il trasporto al sito d azione, ovvero il tessuto tumorale. I due recettori dei fattori di crescita umani ErbB-3 ed EGFR verranno scelti come bersagli specifici per la creazione e produzione di mabs portanti boro-10 (BCmAbs), a causa della loro frequente superespressione in diversi carcinomi (84% nel fegato, 57-63% nel pancreas, 22-96% nella prostata, 22-90% nel seno, 81% nel collo e nella testa, Normanno et al. 2003, Natha et al. 2003). Cellule della linea CHO (chinese hamster ovary)verranno impiegate per la produzione di entrambe le proteine umane ErbB 3 e EGFR dopo il corretto clonaggio del cdna in un vettore di espressione per cellule di mammifero (pcdna3.1/zeo; Invitrogen; Geise et al. 1996).Procedure biochimiche standard verranno utilizzate per l isolamento e la purificazione delle proteine. No Antibody Type Specificity Indication Company FDA approval 1 2 Rituxan (rituximab) Herceptin (trastuzumab) Chimaeric IgG1 Humanized IgG1 CD20 Her-2/neu Non-Hodgkin's lymphoma Metastatic breast cancer Genentech November 1997 Genentech September Mylotarg (gemtuzumab) Humanized IgG4 with calicheamicin CD33 Acute Myeloid Leukemia AHP May Campath (alemtuzumab) Zevalin (Ibritumomab tiuxetan) Bexxar (tositumomab) Erbitux (cetuximab) Avastin (bevacizumab) Humanized IgG1 Chimaeric IgG1 with Y 90 Murine IgG2a (with or w.o. I 131 ) CD52 CD20 CD20 Chronic lymphocytic Leukemia Non-Hodgkin's lymphoma Non-Hodgkin's lymphoma Chimaeric IgG1 EGFR Colorectal caner Millennium Pharm. July 2001 IDEC Pharmaceuticals & Schering AG March 2002 GlaxoSmithKline June 2003 ImClone & Bristol Myers Squibb February 2004 Humanized IgG1 VEGF Colorectal caner Genentech February 2004 Tabella 1. Terapie monoclonali per il trattamento del cancro approvate dall agenzia USA FDA (2003) Sviluppo di peptidi sintetici contenenti il fattore di localizzazione nucleare (SP-NLS) Peptidi sintetici contenenti BPA nella loro sequenza amino acidica fusa con il fattore di localizzazione nucleare delle proteine per cellule eucariotiche NLS (Nuclear 10

11 Localisation Factor) verranno utilizzati per portare il 10 B direttamente dentro il nucleo cellulare. Queste molecole di varie dimensioni verranno prodotte come librerie peptidiche per mezzo di chimica combinatoriale e soggette a selezione in cellule di lievito trattate con neutroni termici. Tale selezione avverrà su di una popolazione di cellule trasformate con DNA codificante per SP-NLS diversi, cresciuta in condizioni chemostatiche ed il cui contenuto di DNA verrà titolato su microarrays (DNA microchips) per determinare quale clone è stato maggiormente colpito dalle radiazioni. Da esso si risalirà al peptide più efficiente nell introdurre il 10 B all interno del nucleo cellulare. Questa sofisticata metodologia seguirà l attualissimo concetto chimico-farmacologico della CBDD (Cell Based Drug Discovery) con il quale oggi le industrie farmaceutiche vanno alla ricerca su larga scala di nuove molecole terapeutiche. 2.2 PRODUZIONE E DOSIMETRIA DI NEUTRONI Produzione e dosimetria di neutroni da LINAC per Radioterapia Fotoneutronica Ospedaliera La generazione dei neutroni presso il LINAC-Varian-2100C del reparto di Radioterapia dell ospedale Maggiore di Trieste, avverrà secondo modalità già sperimentate nell ambito del programma PHONES di cui alleghiamo la proposta approvata dall INFN per consultazione. Sfruttando la produzione di neutroni da fotoni (γ,n) mediante risonanza gigante, si potrà disporre di flussi di neutroni termici di quasi 10 8 ncm -2 s -1. Con esposizioni di poche decine di minuti si possono ottenere fluenze di neutroni utili di circa ncm -2. La misura della fluenza di neutroni, il flusso integrato nel tempo di esposizione, è stata finora effettuata con dei dosimetri commerciali a bolle di gas suprariscaldato in gel trasparente, che per effetto del passaggio dei neutroni forma bolle visibili. I dosimetri sono posizionati in un fantoccio laplaciano che permette di ottenere valori di fluenza e le asimmetrie lungo le tre direzioni spaziali. 11

12 La lettura dei dosimetri è però un procedimento lento, tedioso e che peraltro impedisce di ripetere le misure più volte di seguito, dovendo attendere alcune ore la completa ripressurizzazione delle bolle. In vista di molteplici esposizioni dei lieviti intendiamo realizzare un dosimetro per neutroni che fornisca la visualizzazione dei flussi e delle fluenze neutroniche in tempo reale direttamente sul monitor del LINAC Il rivelatore di neutroni Lo strumento che s intende realizzare è un estrapolazione di un dispositivo recentemente presentato, alla conferenza di Boston dell Ottobre 2004, World Congress on BNCT, durante la quale sono emersi gli sviluppi più avanzati nel settore della ricerca sulla radioterapia neutronica. Si tratta di un rivelatore (SOF) basato su scintillatori plastici (S), fibre ottiche (OF) e fomoltiplicatori in grado, a coppie, di misurare anche i fotoni e che mostra di poter determinare in modo lineare i flussi di neutroni termici in un intervallo molto esteso di oltre tre decadi di flusso, come mostrato in figura. Di queste componenti e tipo di rivelatori il nostro gruppo ha grande esperienza avendo sviluppato dispositivi per le misure di particelle, radiazione cosmica e per esperimenti nello spazio completi di elettronica di acquisizione [2]. Pertanto contiamo di estendere il numero di canali contemporaneamente acquisibili di un fattore 32 utilizzando i fotomoltiplicatori Hamamatsu a 64 canali collegati alla scheda elettronica che abbiamo già realizzato e che permette il collegamento diretto ad un computer. 12

13 Nella scheda le funzioni di amplificazione, formazione, selezione e digitalizzazione dei segnali sono svolte da componenti elettroniche ad alta integrazione di scala, visibili molto ingrandite nella figura seguente realizzate dalla ditta norvegese IDEAS su nostra richiesta. Il rivelatore di neutroni real-time che intendiamo realizzare, consiste in una serie di 16x4 scintillatori plastici, fibre ottiche di circa 10 m di lunghezza in guaine da 8, elettronica di amplificazione, formazione e acquisizione remota con computer di analisi presentazione. In ogni gruppo i quattro canali sono ottimizzati per la rivelazione di neutroni veloci, per i neutroni termici, i fotoni e il fondo, il gruppo per i neutroni termici è ottenuto con uno scintillatore speciale caricato di Boro (nel Boro naturale l isotopo 10 è presente al 20%) mediante sostanze caricate in boro. Rispetto alla versione pubblicata si estende la potenzialità di un fattore 32 nel numero di canali, ovvero 16x2 considerando la misura contemporanea di neutroni veloci e fondo Misure in laboratorio I test funzionali del sistema verranno eseguiti presso il laboratorio elettronica e rivelatori dell INFN di Trieste, mentre le calibrazioni con sorgenti campione di neutroni verranno 13

14 effettuate presso la facility di calibrazione della Sincrotrone Trieste. Il dettaglio di queste misure viene illustrato in modo più approfondito nei paragrafi successivi. 2.3 DOSIMETRIA E MISURE PRESSO IL SINCROTRONE Sorgenti di radiazioni ionizzanti impulsate sono prodotte da macchine acceleratrici quali gli acceleratori lineari, i betatroni, i ciclotroni, ecc. Generalmente, durante le condizioni normali di funzionamento di queste macchine, le particelle non sono erogate in modo continuo ma in pacchetti (o bunch ) le cui durate variano dai 10-6 s ai 10-9s; con le macchine di nuova generazione quali i laser ad elettroni liberi (Free Electron Laser o FEL) si raggiungono i s o meno. I dosimetri attivi per la misura della componente neutronica utilizzati nei campi di radiazione continua non sempre possono essere utilizzati per la radiazione impulsata, in particolar modo se, all interno di ciascun pacchetto, la carica concentrata è elevata e/o si vuole misurare l intensità dei campi di irradiazione intorno ai punti di interazione del fascio primario. Pertanto in questi casi ci si deve affidare a dosimetri passivi, la cui lettura, come si è detto, viene effettuata off-line. La costruzione del nuovo dosimetro a neutroni, come proposto nel presente progetto, grazie alle caratteristiche fisiche del rivelatore e all elettronica con la quale sarà equipaggiato, permetterà di valutare la componente neutronica anche in campi impulsati di neutroni di alta intensità costituendo un utile strumento sia per la dosimetria medica dei pazienti trattati in acceleratori medicali che per la misura dei campi di irradiazione in macchine acceleratrici come il LINAC di elettroni del laboratorio Elettra Misure presso la Sincrotrone Trieste Le misure sperimentali condotte presso la Sincrotrone Trieste riguarderanno, in primo luogo, la calibrazione dei dosimetri e successivamente la misura della produzione di fotoneutroni con il fascio di elettroni prodotto dal LINAC di Elettra. Le operazioni di calibrazione permetteranno di correlare la risposta dei dosimetri ad una determinata dose di neutroni. Ciò potrà essere realizzato con sorgenti di neutroni di attività nota e certificata. Il laboratorio Elettra dispone a questo scopo, di una facility per la calibrazione e la verifica del buon funzionamento della strumentazione di dosimetria, costituita da un certo numero di sorgenti radioattive sigillate di neutroni e gamma di attività nota, da un sistema automatico di e allineamento e movimentazione. Ogni sorgente è custodita in un deposito posto sotto il livello del pavimento e, una volta posizionato il dosimetro da calibrare, viene 14

15 estratta utilizzando un sistema di controllo remoto e riposta nel deposito alla fine della misura. Le misure prevedono l irradiazione dei dosimetri in un determinato intervallo temporale durante il quale viene determinato il valore del rateo di dose integrata. La variazione del flusso di neutroni viene ottenuta variando la distanza tra la sorgente ed il rivelatore. Le esposizioni dei dosimetri alle sorgenti radioattive permetteranno anche di: 1) confrontare la risposta dei dosimetri prodotti con quella di altri rivelatori passivi (dosimetri a termoluminescenza, rivelatori a bolle, film, ecc.) a diverse intensità di esposizione, 2) calibrare i nuovi dosimetri rispetto ad altri strumenti portatili commerciali già provvisti di un certificato di calibrazione ottenuto presso altri Centri, 3) valutare la sensibilità dei nuovi dosimetri ai raggi gamma, 4) costruire un benchmark per il programma di simulazione con il metodo di Montecarlo. Una volta calibrati con le sorgenti radioattive, i dosimetri possono essere esposti ai campi di irradiazione prodotti dalle macchine acceleratrici. Il LINAC di Elettra produce un fascio di elettroni di energia pari a circa 1 GeV, ben più elevata di quella tipica dei linac medicali (18-20 MeV) ma, utilizzando solamente un numero limitato di sezioni acceleranti, può lavorare anche ad energia inferiore. Le misure all interno del tunnel del linac permetteranno di: a) ottimizzare le geometrie e le composizioni dei bersagli per la conversione elettroni/neutroni, b) costruire un benchmark per i programmi di simulazione con il metodo di Montecarlo. c) effettuare la dosimetria della componente neutronica prodotta. 2.4 MISURE PRESSO L OSPEDALE MAGGIORE DI TRIESTE I gruppi di radioterapia oncologica, fisica sanitaria e dosimetria dell Ospedale Maggiore di Trieste costituiscono parte integrante ed essenziale della collaborazione multi-disciplinare che propone il presente progetto con l assenso della direzione sanitaria. L acceleratore LINAC VARIAN 2100C del reparto di radioterapia oncologica, al termine delle normali terapie fotoniche giornaliere, verrà utilizzato per esporre, con l ausilio apparecchiature di fotoconversione e moderazione neutronica sviluppate dal gruppo, i dosimetri sia di tipo passivo che attivo e le cellule di lievito nelle diverse condizioni previste per valutare gli effetti genetici. Si prevede di poter confrontare gli effetti dovuti separatamente ai neutroni termici, a frazioni di residui neutroni veloci e ai fotoni, in presenza e assenza di borofenilalanina, con e senza l arricchimento in 10 B, con dosi integrate o frazionate. Tutto ciò contribuirà a creare una vasta base di dati originali che di per se stessa costituirà un contributo importante agli ulteriori sviluppi della metodologia. 15

16 3. RISULTATI PREVISTI E RICADUTE I risultati previsti saranno riconducibili ad aspetti di tipo scientifico e tecnologico. Questi ultimi potranno avere effetti sinergici con realtà industriali e tecnologiche sia in regione che fuori contribuendo così a valorizzare investimenti e risorse. 3.1 RISULTATI SCIENTIFICI I risultati scientifici conseguibili dai vari gruppi sono molteplici e così sintetizzabili: a) conoscenza degli effetti genetici delle irradiazioni con neutroni termici e cattura in 10 B-phenilalanina b) studio di altri possibili carrier di 10 B come anticorpi monoclonali e peptidi sintetici, c) ottimizzazione delle dosi terapeutiche su base biologica oltre che fisica, d) definizione delle procedure di successivi test e protocolli terapeutici, e) calibrazioni presso il sincrotrone di dosimetri e rivelatori 3.2 RICADUTE TECNOLOGICHE Considerevoli saranno le possibili ricadute tecnologiche, tra cui sottolineiamo: a) realizzazione di nuovi rivelatori compatti per neutroni real-time, con possibilità di brevetto, dato l elevato interesse commerciale per una tale applicazione, b) produzione di neutroni presso il sincrotrone Elettra, per applicazioni di attivazione neutronica con ricadute su misure di parametri d inquinamento ambientale e/o ricerca di materiali in tracce, neutronografia etc., c) sviluppi di metodi di produzione di neutroni presso gli acceleratori ospedalieri, molto più diffusi sul territorio che non reattori nucleari o acceleratori di grandi dimensioni, d) sviluppo di monitor di neutroni in tempo reale per l uso in reparti di radioterapia, anche come progetto commerciale indipendente che potrebbe partire rapidamente sfruttando i nostri risultati, e) sviluppo di tecniche di ingegneria genetica ottimizzate per radio-biodosimetria, di grande attualità e d interesse internazionale, f) studio di fattibilità di produzione di anticorpi monoclonali mirati alla BNCT. g) produzione di nuovi peptidi sintetici sostituiti con BPA, aventi attività farmacologica. 16

17 3.3 INIZIATIVE DI TRASFERIMENTO E DIFFUSIONE DELLA RICERCA E FINALITA Una delle principali caratteristiche del progetto CRAB-10 è la costituzione di una rete di effettiva e sinergica collaborazione tra enti pubblici di ricerca, istituzioni di ricerca dotate di strutture applicative e realtà mediche, produttive e imprenditoriali della regione ben identificabili nei gruppi di: Carlo Vito Bruschi, direttore del Gruppo di Microbiologia Molecolare, Valentina Tosato, ricercatrice dell ICGEB (Centro d Ingegneria Genetica e Biotecnologia), Gianrossano Giannini, responsabile nazionale progetto PHONES, Fernando Liello, presidente commissione calcolo INFN, Franco Calligaris, responsabile sicurezze e radiazioni, Renata Longo, coordinatrice attività tecnologiche, et al.,del Dipartimento di Fisica dell Università di Trieste e dell INFN-Sezione di Trieste, Aulo Beorchia, primario di Radioterapia Oncologica, Cristiana Vidali, aiuto primario e cons. amm. Società Italiana di Radiologia, Fabio De Guarrini, direttore di Fisica Sanitaria, Rossella Vidimari et al. dell Ospedale Maggiore di Trieste, Giuliana Tromba responsabile sicurezze e Alessandro Vascotto, responsabile radioprotezione, et al. di ELETTRA della Sincotrone Trieste, Mauro Trovò, primario di radioterapia oncologica et al. del Centro di Riferimento Oncologico di Aviano (PN), con cui siamo in contatto e si sta definendo la collaborazione, Rado Starec, direttore generale della MIPOT s.p.a. di Cormons(GO) per la ingegnerizzazione, produzione e commercializzazione circuiti elettronici e dosimetri, hanno già prodotto schede prototipo con circuiti integrati VLSI e componenti ad altissima densità di canali Fulvio e Mauro Merlach della GENERAL SERVICE di Trieste per realizzazione di stampi d acciaio per pressofusione (ne hanno costruiti per noi già tre) di scintillatori plastici, e realizzazione di scintillatori a base polistirenica con additivi chimici variabili e in vario formato. Desideriamo sottolineare che ai nostri gruppi afferiscono oltre quattro esperti qualificati di primo grado (anche in presenza di neutroni) di radiazioni e radiodosimetria per la sorveglianza fisica oltre che medica della radioprotezione. Una delle finalità chiaramente identificabili di tutto il progetto è la costituzione di un gruppo di riferimento, scientifico e realizzativo, nella Regione FVG prima ed in Europa poi, che diventi la base su cui ancorare sviluppi rapidi e sicuri per l ottenimento dei prevedibili benefici terapeutici per casi altrimenti disperati di patologie tumorali diffuse. 17

18 3.4 BIBLIOGRAFIA Akdis, C. A. and Blaser, K Mechanisms of allergen-specific immunotherapy. Allergy 55: Brüggemann, M. and Taussig, M. J Production of human antibody repertoires in transgenic mice. Curr opin Biotechnol 8: Bruschi, C.V. and Gjuracic, K Yeast Artificial Chromosomes. Encyclopedia of Life Sciences, Nature Publishing Group, London, 12:1-6 Bruschi, C.V. and Esposito, M.S Cell division, mitotic recombination and onset of meiosis by diploid yeast cells during space flight. In: Biorack on Spacelab IML-1. C. Mattox (Ed.) ESA-SP, 1162:83-93 Carballido J. M., Namikawa R., Carballido-Perrig N., Antonenko S., Roncarolo M. G. and de Vries J. E Generation of primary antigen-specific human T- and B-cell responses in immunocompetent SCID-hu mice. Nature Medicine 6: Carter, P Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies. Nat Rev Cancer 1: Carteron, N. L Cytokines in reumatoid arthritis: trials and tribulations. Mol Med Today 6: Farah, R. A., Clinchy, B., Herrera, L. and Vitetta, E. S The development of monoclonal antibodies for the therapy of cancer. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 8: Gjuracic, K., Pivetta, E. and Bruschi, C.V. (2004). Targeted DNA integration within different functional gene domains of yeast reveals ORF sequences as recombinational cold-spots. Mol. Gen. Genomics, 271: Gura T Magic bullets hit the target. Nature 417: Hudson, P.J. and Souriau, C Recombinant antibodies for cancer diagnosis and therapy. Expert Opin Biol Ther 1: Hudson, P. J. and Souriau C Engineered antibodies. Nature Medicine 9: Little, M., Kipriyanov, S. M., Le Gall, F. and Moldenhauer, G Of mice and men: hybridoma and recombinant antibodies. Immun Today 21: Tettelin, H. Bruschi, C.V. et al The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome VII. Nature, 387:

19 Mendez, M. J., Green, L. L., Corvalan, J. R. F., Jia, X. C., Maynard-Currie, C. E., Yang, X. D., Gallo, M. L. Louie, D. M., Lee, D. V., Erickson, K. L., Luna J., Roy, C. M.-N., Abderrahim, H., Kirschenbaum, F., Noguchi, M., Smith, D. H., Fukushima, A., Hales, J. F., Finer, M. H., Davis, C. G., Zsebo, K. M. and Jakobovits A Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. Nature Genetics 15: Nahta R., Hortobagyi G. N. and Esteva F.J Growth factors in breast cancer: potential for therapeutic intervention. The Oncologist 8: Normanno, N., Bianco C., De Luca A., Maiello M.R. and Salomon D.S Targetbased agents against ErbB receptors and their ligands: a novel approach to cancer treatment. Endocrine-Related Cancer 10: 1-21 Waghmare, S.K., Caputo, V., Radovic, S. and Bruschi, C.V. (2003). Specific targeted integration of kanamycin resistance-associated non-selectable DNA in the genome of the yeast Saccharomyces cerevisiae. BioTechniques, 34: Vlahovicek, K., Kaján, L., Szabó, G. Jr., Tosato, V., Bruschi, C.V. and Pongor, S. (2004) Web servers for the prediction of curvature as well as other characteristics from DNA sequence. In: Arseni Markoff, editor. Analytical Tools for Genes, Genomes and Sequence: The DNA Level. Eagleville, PA, DNA Press, in press. Waghmare, S.K. and Bruschi, C.V. (2005) Differential chromosome control of ploidy in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Yeast, in press. Tosato, V., Waghmare, S.K. and bruschi, C.V. (2005) Non-reciprocal chromosomal translocation induced by targeted DNA-bridge integration in yeast. Chromosoma, in press. Development of real-time thermal neutron monitor using boron-loaded plastic scintillator with optical fiber for boron neutron capture therapy. M. Ishikawa et. al. Applied Radiation and Isotopes 61 (2004) Development of a flexible MAPMT photon counting read-out system. M.Vidali, M. Bari, D. Fontanarosa, G. Giannini, A. Gregorio and A. Monfardini. Subm. to Nuclear Instruments and Methods NIMA(2004) Trieste, 20 Gennaio 2005 Timbro e firma del legale rappresentante 19