Biochimica clinica. Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie per la salute

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1 Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie per la salute Biochimica clinica Argomenti della lezione: Il Glucosio Il laboratorio nel metabolismo del glucosio

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3 IL METABOLISMO GLUCIDICO Il glucosio e gli acidi grassi sono le principali fon> di energia Glucosio libero (plasma e liquidi extracellulari): 20 gr. Glicogeno epa>co: gr Glicogeno muscolare: 200 gr In condizioni fisiologiche la concentrazione glicemica a digiuno (<100 mg/dl o 5.6 mmol/l) è mantenuta dalla coesistenza simultanea e bilanciata dell u"lizzo e della produzione del glucosio il 60-80% del glucosio si rinnova nelle 24 ore

4 La glicemia a digiuno La concentrazione del glucosio nel sangue è una variabile omeostatica: l organismo tende a mantenere le oscillazioni della glicemia entro valori ben controllati Scopi: ~ garantire un apporto di glucosio costante al SNC, anche in condizioni di digiuno ~ Immagazzinare glucosio nel periodo postprandiale sotto forma di glicogeno

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8 L omeostasi glicemica dipende da: adeguata introduzione di glucosio con la dieta u>lizzazione periferica di glucosio riserva epa>ca di glucosio (glicogeno) favori ormonali

9 Il pancreas endocrino produce gli ormoni insulina e glucagone che hanno un ruolo fondamentale nel regolare l omeostasi delle sostanze nutritive sia nel periodo di alimentazione che di digiuno

10 L insulina è secreta principalmente in risposta ad un aumento del livello ematico di glucosio Il glucagone è secreto in risposta ad un calo del livello ematico di glucosio

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12 INSULINA Proteina composta da 2 catene polipep>diche (A e B) connesse da 2 pon> disolfuro, 51 aminoacidi, PM=5800 Deriva dalla proinsulina per distacco di un pep>de di connessione (C-pep>de) Il principale elemento regolatore della secrezione insulinica è il glucosio S>molano la secrezione insulinica anche mol> aminoacidi, ormoni gastrointes>nali (secre>na, gastrina, VIP, GIP, colecistochinina), glucagone, sistema parasimpa>co

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14 AZIONE DELL INSULINA Le azioni dell insulina sono globalmente anaboliche Essa infa[: a[va la rimozione del glucosio dal circolo (promuove l entrata del glucosio nelle cellule del muscolo, del miocardio, del tessuto adiposo) a[va la sintesi di glicogeno a[va la conversione del glucosio in lipidi a[va la conversione degli ac. grassi in lipidi a[va la captazione di aa da parte del fegato e del muscolo scheletrico e la successiva sintesi proteica L azione dell insulina non interessa il cervello, le emazie, il cristallino ed il glomerulo renale.

15 Iperglicemizzan> Ipoglicemizzan>

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17 IPOGLICEMIA E CONTROREGOLAZIONE Controregolazione: l'insieme di tuve le risposte, nervose ed ormonali, tese a riportare la glicemia entro valori normali. Si innesca quando la glicemia scende sovo i 60 mg/dl. Meccanismi della controregolazione: Ormonali (glucagone, adrenalina, ormone della crescita, cor>solo) Neuronali (noradrenalina secreta dai neuroni postgangliari) Autoregolatori ( produzione epa>ca di glucosio) Metabolici (u>lizzazione di substra> alterna>vi al glucosio)

18 Ricapitolando

19 Parametri per la valutazione dell omeostasi glicemica Glicemia Emoglobina glicata Glicosuria Chetonuria/emia

20 Glicemia Valuta la quan>tà di glucosio presente nel sangue al momento del prelievo. Può essere u>lizzata: per la valutazione retrospe[va dell equilibrio metabolico in termini predi[vi per l adeguamento terapeu>co Può essere valutata: come misurazione basale (al ma[no prima della colazione) nel corso della giornata (profilo glicemico)

21 Metodiche di dosaggio Enzimatiche Self-monitoring: metodiche colorimetriche ed amperometriche

22 Il campione biologico per la valutazione della glicemia il prelievo deve essere eseguito dopo 6-8 h di digiuno Campione biologico: plasma, siero, sangue intero. TuVavia, è preferibile che la glicemia sia misurata su plasma. nel sangue venoso la glicemia è più bassa del 5-10% rispevo al sangue arterioso. Per effevuare la glicemia occorre separare presto il plasma o il siero, perché gli eritroci> consumano glucosio, quindi diminuiscono la glicemia (circa 6 mg/dl/h) Ideale: u>lizzare fluoruro come an>coagulante (poiché inibisce la glicolisi, e quindi limita il consumo di glucosio da parte degli eritroci>). se il plasma non può essere separato dalle cellule entro 60 min, la proveva deve contenere un inibitore della glicolisi (NaF, iodoacetato sodico)

23 Metodi enzima>ci di dosaggio del glucosio Esochinasi: metodo di riferimento Glu + ATP > Glu-6P + ADP Glu-6P + NADP > 6P-gluconato + NADPH Glucosio deidrogenasi: (può subire l interferenza dello xilosio) Glu + NAD > gluconolavone + NADH (meglio con aggiunta di mutorotasi) In queste due reazioni, si valuta la variazione delle concentrazioni di NADH o NADPH spevrofotometricamente. Glucosio ossidasi: (risente di interferenza da parte di sostanze riducen>, es. gluta>one) Glu+ O2 > Acido gluconico + H 2 O 2 H 2 O 2 + cromogeno ridovo > cromogeno ossidato + H 2 O In quest ul>ma reazione si valuta la variazione di concentrazione del cromogeno spevrofotometricamente.

24 Omeostasi del glucosio Glicemia a digiuno: tra 70 e 100 mg/dl (su sangue venoso) Glicemia post-prandiale: fino a 180 mg/dl, con ritorno al valore basale entro 2-4 ore (a 2 ore deve essere < 140 mg/dl) CV intra-individuale per la glicemia: 5-15% Sintomi da iperglicemia compaiono per valori >230 mg/dl. Valore cri>co (al di sopra del quale vi può essere rischio per le funzioni vitali): 480 mg/dl (il laboratorio deve tempes>vamente darne comunicazione) Sintomi da ipoglicemia compaiono per valori <50 mg/dl Valore cri>co < 46 mg/dl

25 Significato clinico Le fluvuazioni intra-individuali nelle 24 ore sono quelle più alte rispevo a tu[ gli altri parametri del sangue (a causa di a[vità muscolare, introduzione di cibo) Standardizzare l ora del prelievo ed il >po di campione biologico (digiuno da 8 h, plasma separato entro 1 h, eparina + NaF) Il valore soglia per il sospevo di diabete corrisponde oggi a valori di glicemia >126mg/dL (criteri ADA*2006) *ADA: american diabetes associa>on

26 L'esempio Il Diabete Mellito Incidenza = 5-10 % negli adul> > 40 anni Disordine del metabolismo glucidico caraverizzato da un assoluta e/o rela>va assenza di insulina e insulino-resistenza a cui segue iperglicemia Sindrome caraverizzata da aumento dei livelli ema>ci di glucosio (iperglicemia): a digiuno 126 mg/dl 2h dopo carico orale di glucosio 200 mg/dl (microangiopatia, neuropatia e macroangiopatia) Comporta il rischio di complicanze acute (coma iperglicemico) e croniche

27 Nel 1985 i malati di diabete nel mondo erano 30 milioni Nel 2000 circa 177 milioni Nel 2030 saranno circa 370 milioni È annoverato tra le principali cause di morte dovute alle complicanze

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29 Il Diabete Mellito: categorie ADA Diabete di Bpo 1 = distruzione delle beta cellule, con perdita della secrezione di insulina Immuno-mediato (auto-an>corpi), giovanile e dell adulto idiopa>co Diabete di Bpo 2 Prevalente insulino-resistenza e rela>vo deficit di insulina Prevalente deficit di insulina e rela>va insulino-resistenza Diabete di altro >po = farmaci, sostanze chimiche, dife[ gene>ci Diabete mellito gestazionale IGT = impaired glucose tolerance IFG = impaired fas>ng glucose, ossia l'alterazione dei livelli di glicemia a digiuno (a digiuno compresa tra 100 e 125mg/dl) NB = I pazien> IGT e/o IFG devono essere ricontrolla> ogni anno

30 Glicemia a digiuno In condizioni fisiologiche <100 mg/dl (5,6 mmol/l) Diabete > 126 mg/dl IFG e IGT mg/dl

31 Criteri per la diagnosi di Diabete ADA 2006 Sintomi lega> al diabete (poliuria, polidispia ed inspiegabile perdita di peso) e rilievo casuale di glicemia plasma>ca >200 mg/ dl (Casuale significa in qualsiasi momento indipendentemente dalla distanza dall ul>mo pasto) Oppure" " Glicemia plasma>ca a digiuno (FPG) >126 mg/dl (a digiuno significa distanza >8 ore dall ul>ma inges>one di cibo o bevande caloriche) Un valore di iperglicemia che non soddisfa i criteri diagnos>ci per il diabete deve essere rivalutato con un carico orale di glucosio (OGTT)

32 La diagnosi del DIABETE MELLITO Sintomi clinici ed una glicemia random 200 mg/dl Glicemia a digiuno (da almeno 8 ore) 126 mg/dl In assenza di sintomi è opportuno che il valore della glicemia a digiuno venga confermato in più misurazioni. Glicemia a due ore dal carico orale di glucosio 200 mg/dl Intolleranza al glucosio (IGT): glicemia 140 mg/dl ma <200 mg/dl a 2 ore dal carico orale di glucosio. Alterata glicemia a digiuno (IGF): glicemia a digiuno tra 110mg/dl e 125 mg/dl

33 TEST DI CARICO ORALE DI GLUCOSIO (OGTT) esecuzione Nei tre giorni preceden> dieta contenente almeno 150 g di carboidra> e a[vità fisica normale. Digiuno da circa 12 ore. Durante l esecuzione del test il soggevo deve rimanere seduto e non deve fumare. Prima dell inizio del test viene effevuato un prelievo di sangue venoso per determinare la glicemia a digiuno. Il soggevo assume poi 75 g di glucosio anidro sciol> in 250 ml di acqua nell arco di 5 minu> Nei bambini la quan>tà di glucosio somministrato è pari a 1.75 g di glucosio per Kg di peso corporeo fino ad un massimo di 75 g. Dopo due ore viene effevuato un ulteriore prelievo di sangue venoso per la determinazione della glicemia. Il tempo viene valutato dal momento in cui il soggevo inizia a bere.

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35 OGTT: test di tolleranza al glucosio per via orale Somministrare 75 g di glucosio anidro in ml di acqua in 5 minu> Criteri ADA 2006:» Glicemia a digiuno: meno di 100 mg/dl» Glicemia a due ore dal pasto: meno di 140 mg/dl» IFG tra 100 e 125 mg/dl» SospeVo di Diabete > 126 mg/dl

36 TEST DI CARICO ORALE DI GLUCOSIO (OGTT) interpretazione Glicemia 200 mg/dl a 2 ore dal carico orale di glucosio: diagnosi di diabete mellito Glicemia 140 mg/dl ma <200 mg/dl a 2 ore dal carico orale di glucosio: diagnosi di intolleranza al glucosio (impaired glucose tolerance o IGT)

37 TEST DI CARICO ORALE DI GLUCOSIO (OGTT) curva

38 ASPETTI SFAVOREVOLI DEL TEST DA CARICO DI GLUCOSIO Richiede 3 giorni di preparazione Richiede la sospensione di alcune terapie in corso Richiede il digiuno da almeno 10 ore Richiede l assunzione di una forte quan>tà di glucosio Richiede 5-6 prelievi di sangue Riproduce una situazione non fisiologica

39 Glucosio 75g per os Prova da carico orale di glucosio mg/100 ml μu/ml GLICEMIA tempo INSULINEMIA tempo

40 Glucosio 75g per os Prova da carico orale di glucosio mg/100 ml μu/ml GLICEMIA CONTROLLO DIABETICO tempo INSULINEMIA CONTROLLO DIABETICO tempo

41 MONITORAGGIO METABOLICO DEL DIABETE Profilo glicemico giornaliero: E indispensabile per monitorare l andamento delle glicemie Glicosuria: Indica la presenza di glucosio nelle urine quando la glicemia supera la soglia renale (> 180mg/dl) Chetonuria: Indica una insufficienza insulnica, una situazione di digiuno protravo o una dieta troppo povera di carboidra>. Emoglobina glicosilata: Esprime la qualità del controllo metabolico degli ul>mi 3 mesi. Riserva β-cellulare: AVraverso il C-pep>de si valuta la produzione endogena di insulina

42 Profilo glicemico E cos>tuito da misurazioni eseguite in vari momen> della giornata sia a digiuno che dopo i pas>. Può essere pra>cato: in regime ospedaliero (validità limitata a casi par>colari) in regime di automonitoraggio domiciliare (elemento di riferimento più importante per la valutazione dell equilibrio glicemico) L autovalutazione della glicemia è raccomandata in tutti i pazienti con diabete di tipo 1 trattati con insulina, la sua efficacia nei pazienti con diabete di tipo 2 non è stata stabilita

43 A cosa serve l'autocontrollo della glicemia? Guidare i medici nella pianificazione a lungo termine del travamento Guidare i pazien> nell aggiustamento quo>diano della terapia insulinica Segnalare situazioni di possibile emergenza Rafforzare l educazione del paziente

44 Il termine autocontrollo viene riferito al monitoraggio della glicemi 44

45 Come e' organizzato l'autocontrollo della glicemia? Misuratore portatile Pungidito

46 Emoglobina glicosilata L emoglobina glicosilata HbA 1c è un addotto stabile del glucosio ai gruppi N-terminale delle catene beta dell HbA L emoglobina glicosilata è un test utile al monitoraggio del soggetto diabetico durante la terapia e alla valutazione del metabolismo glicidico nei due mesi precedenti il prelievo. La concentrazione dell emoglobina glicata rappresenta una integrazione dei valori della glicemia nelle precedenti 6-8 settimane

47 Deriva da una reazione pra>camente irreversibile nella quale il glucosio viene legato all emoglobina La percentuale e la velocità di emoglobina che viene glicosilata dipende dalla concentrazione di glucosio a cui il globulo rosso viene esposto e dall età del globulo rosso L emoglobina glicosilata rimane in tale forma per tuva la vita del globulo rosso La glicosilazione è piuvosto lenta e la concentrazione di emoglobina glicosilata non varia con le oscillazioni giornaliere della glicemia, ma è uno specchio fedele della glicemia media dei 60 giorni preceden> la determinazione. Pertanto questo esame deve essere eseguito ogni 2-3 mesi Il dosaggio dell HbA1c non esclude l automonitoraggio della glicemia che solo può darci informazioni sulla variabilità giornaliera dei valori glicemici ed in par>colare sull iperglicemia postprandiale.

48 Valutazione dell'emoglobina glicosilata Metodo di riferimento IFCC: spettrometria di massa o elettroforesi capillare Intervallo di riferimento HbA 1c = 4,3 5,9 % dell emoglobina totale < 6,3% = ottimo controllo glicemico > 9% = pessimo controllo glicemico Metodiche routinarie = cromatografia di affinità, HPLC, immunochimica Interferenze = emoglobinopatie e ridotta sopravvivenza della vita media dei G.R., emoglobine carbamilate

49 Raccomandazioni ADA per l Emoglobina glicata HbA1c dovrebbe essere misurata almeno due volte all anno in tu[ i pazien> e ogni tre mesi nei pazien> la cui terapia è stata modificata o che presentano un diabete non controllato

50 Test per il controllo glicemico a breve termine Albumina glicosilata Fibrinogeno glicosilato FruVosamine (prodovo chetoiminico della glicazione proteica)

51 GLUCOSIO URINARIO Glucosio urinario: filtrato a livello glomerulare riassorbito a livello tubulare Glucosio nelle urine quando glicemia > 180 mg/dl È possibile osservare glicosuria in presenza di valori glicemici normali (es.: diabete renale, infarto del miocardio, gravidanza).

52 Glicosuria V.N. = 3-15 mg/dl Max Normalmente negativo Glicemia > 180 mg/dl >sorpassa il filtro renale Se la glicemia > mg/dl Glucosio nelle urine perché viene superata la soglia renale di riassorbimento tubulare GLICOSURIA Misurata con metodi enzimatici o reduttometrici

53 Valutazione della Glicosuria Carta imbevuta di glucosio-ossidasi Glicosuria nelle 24h - Raccolta frazionata delle urine delle 24 ore 1. Mattina: colazione pre-pranzo 2. Intervallo pranzo pre-cena 3. Intervalllo dopo-cena mattina 4. Si misura la concentrazione di glucosio nella diverse fasi della giornata in relazione ai pasti e alla terapia

54 CHETOACIDOSI DIABETICA La chetoacidosi diabe>ca è uno stato carenza assoluta o rela>va di insulina aggravata dalla conseguente iperglicemia, disidratazione ed acidosi. Si considera presente quando la glicemia è superiore a 300 mg/dl, sono presen> chetonemia e chetonuria, è presente acidosi (ph < 7,30) i bicarbona> plasma>ci sono inferiori a 15 meq/l.

55 Corpi chetonici Sono l acetoacetato, il beta-idrossibu>rrato e l acetone. La sintesi dei corpi chetonici avviene solo nei mitocondri del fegato ogni volta che l ace>l-coa è in eccesso rispevo all ossalacetato, in seguito a:» Dieta sbilanciata molto ricca in grassi e con una bassa percentuale di carboidra>.» Durante la gluconeogenesi, in seguito a digiuno o dopo un intenso sforzo fisico. Acetil-CoA riduzione enzimatica β-idrossibutirrico Ac. Acetoacetico condensazione decarbossilazione Acetone

56 Chetonuria Presenza di corpi chetonici nelle urine reazione colorimetrica al nitro-prussiato (Ketostix) presenza di acetone, ac. Acetoacetico ma non β-idrossibutirrico Valori normali: mg/24h Valori patologici nella: chetoacidosi diabetica digiuno prolungato restrizione di carboidrati

57 Dosaggio dei corpi chetonici Dosaggio urinario dei corpi chetonici Generalmente l acido aceto-ace>co è dosato nelle urine mediante strisce rea[ve a base di nitroprussiato a ph 9 (metodo di Legal). Aggiungendo glicina si dosa anche l acetone. In caso di posi>vità le strisce si colorano in viola con un'intensità che varia a seconda della concentrazione dei corpi chetonici. Limi>: dosaggio semiquan>ta>vo, che non comprende anche il 3-β-idrossibu>rrato, falsi posi>vi in presenza di farmaci contenen> gruppi sulfidrilici; falsi nega>vi se le strisce sono esposte all aria o l urina è molto acida

58 Metodi per il dosaggio sierico dei corpi chetonici Metodo enzima>co per il dosaggio dell idrossibu>rrato: Idrossibu>rrato + NAD > aceto-acetato + NADH Metodo lineare tra 0 e 6 mm 2. Metodo semiquan>ta>vo su siero diluito 1:2 Valori di riferimento In condizioni normali < 0,5 mm Iperchetonemia > 1 mm Chetoacidosi > 3 mm Iperchetonemia para-fisiologica: Neonati Gravidanza Bambini con febbre e vomito"

59 Il GLUCOSIO in gravidanza Il metabolismo dei carboidra> è alterato nelle prime se[mane di gravidanza per I'iperplasia delle cellule b del pancreas, accresciuta secrezione di insulina ed aumentata sensibilità all insulina La glicemia a digiuno diminuisce come conseguenza del 10-20% Gli ormoni cor>solo, progesterone, HPL, poten> diabetogeni, raggiungono i livelli più eleva> verso la fine della prima metà della gravidanza Il glucosio plasma>co a digiuno resta normale per l alta concentrazione di insulina tuvavia la tolleranza del glucosio è a rischio

60 Screening per il diabete Storia familiare di diabete Obesità (BMI>30) Ipertensione Iperlipidemia Storia precedente di diabete gestazionale Precedente IGT e/o IFG Razza (asia>ca, afrocaraibica) Età (>45 anni)

61 GDM (diabete mellito gestazionale) FaVori di rischio anamnes>ci maggiori: Pregresso GDM Familiarità di 1 grado BMI > 28 Pregressa macrosomia fetale (> 4 kg) Mortalità perinatale da causa incerta FaVori di rischio anamnes>ci minori: Sovrappeso Ipertensione arteriosa 2 o più abor> spontanei Poliidramnios Gestosi Elevata parità Par> pretermine

62 Criteri diagnosbci del GDM (diabete mellito gestazionale) Glicemia casuale >200 mg/dl o glicemia a digiuno >126 mg/dl In presenza di favori di rischio eseguire alla 24ma se[mana di gravidanza il test diagnos>co (OGTT, con 100 g di glucosio anidro e valutazione della glicemia a 2h VR <155 mg/dl, a 3 h- VR <140 mg/dl) Negli altri casi, eseguire alla 24ma se[mana il test di screening (minicarico di glucosio: 50g di glucosio e valutazione della gli. ad 1h VR < 140 mg/dl) Ricontrollare e riclassificare la paziente GDM a 6 se[mane dal parto = le IGT e/o IFG devono essere ricontrollate ogni anno, quelle normali dopo 3 anni