Attività 5. Coordinatori Scientifici: Prof. Enzo Ottaviani Prof. Fabriziomaria Gobba

Transcript

1 Attività 5 MECCANISMI D AZIONE DELLE ESPOSIZIONI AMBIENTALI ED OCCUPAZIONALI A CAMPO MAGNETICO ELF: VALUTAZIONE DELLE HSP IN LEUCOCITI DI SANGUE PERIFERICO DI SOGGETTI ESPOSTI. Coordinatori Scientifici: Prof. Enzo Ottaviani Prof. Fabriziomaria Gobba PROGETTO VALUTAZIONE DELLA ESPOSIZIONE AMBIENTALE ED OCCUPAZIONALE A CAMPI MAGNETICI A FREQUENZA ESTREMAMENTE BASSA (ELF) NELLA POPOLAZIONE E DI EFFETTI BIOLOGICI PRECOCI ATTIVITÀ 5: MECCANISMI D AZIONE DELLE ESPOSIZIONI AMBIENTALI ED OCCUPAZIONALI A CAMPO MAGNETICO ELF: Pagina 1 di 14

2 VALUTAZIONE DELLE HSP IN LEUCOCITI DI SANGUE PERIFERICO DI SOGGETTI ESPOSTI. RELAZIONE DELL ATTIVITÀ DELL UNITÀ COORDINATA DAI PROF. ENZO OTTAVIANI) PROF. FABRIZIOMARIA GOBBA OBIETTIVI E METODI Scopo della nostra unità era di studiare l espressione di heat shock protein (HSP) nei leucociti di sangue periferico raccolti da soggetti esposti a vari livelli di ELF. L indagine è stata condotta analizzando l espressione dei geni target sia a livello di RNA che di proteine, mentre non è stato possibile effettuare reazioni immunocitochimiche in quanto frequentemente i campioni erano costituiti da una quantità di linfociti insufficienti a garantire la buona riuscita degli approcci di biologia molecolare e morfologici. Pertanto, in considerazione del tipo di output fornito dagli approcci di biologia molecolare, questi sono stati privilegiati rispetto alla conferma morfologica della presenza di HSP. Nel rispetto dei numeri previsti dal progetto, al nostro laboratorio sono giunti 58 (cinquantotto) campioni, per il tramite del laboratorio di farmacologia diretto dalla Prof.ssa Susanna Genedani. Si precisa che tutte le indagini effettuate sono state condotte in cieco, ossia non era noto ad alcun componente del laboratorio la corrispondenza fra numero/codice di arrivo del campione e suo significato nell ambito del progetto. Solo a risultati ottenuti, è stata effettuata una comparazione tra grado di espressione di HSP e grado di esposizione. Al momento dell arrivo, ad ogni campione è stato assegnato un codice numerico interno, quindi si è proceduti alla centrifugazione della sospensione linfocitaria al fine di separare le cellule dalla soluzione salina in cui giungevano. Il pellet di linfociti è stato risospeso in una soluzione commerciale (TRIREAGENT, Sigma, St Louis, MO, USA) finalizzata all estrazione selettiva ed in sequenza di RNA totale, DNA genomico e proteine del campione, secondo una metodica che deriva dalla tecnica di Chomczynski e Sacchi (1987). Brevemente, la soluzione utilizzata è una miscela di guanidina tiocianato e fenolo Pagina 2 di 14

3 che determina l immediata lisi del campione impedendo così l attività eventuale di enzimi litici, principalmente RNasi. La tecnica utilizzata prevede quindi l aggiunta di un solvente organico (cloroformio) al fine di consentire la separazione per centrifugazione delle componenti già citate, RNA, DNA e proteine. Al termine della procedura è indispensabile valutare la qualità del materiale estratto mediante spettrofotometria. Per quanto attiene all RNA, l assorbanza a 260 nm (A260) fornisce una stima della quantità di materiale estratto, mentre il rapporto A260/A280 deve essere >1,7 per poter definire il materiale correttamente purificato. Tutte le procedure di estrazione sono state effettuate mediante tecniche adeguate a preservare l integrità del campione ed ad impedirne la contaminazione da parte dell operatore e/o di altri campioni. Tutte le plastiche utilizzate erano sterili e RNase-free, mentre tutti i reagenti erano molecular biology grade. Sia l RNA che le proteine estratte sono state conservate a -80 C sino al momento dell utilizzo. Successivamente all estrazione ed alla valutazione quantitativa e qualitativa dell RNA, si è proceduto alla retrotrascrizione (RT) dello stesso al fine di ottenere il cdna, che viene poi utilizzato nelle successive reazioni di amplificazione mediante PCR. Tutti i campioni giunti al laboratorio sono stati sottoposti a RT. Dato che il principale gene target della nostra indagine è una forma inducibile di HSP70, occorre paragonarne il livello di trascrizione con quello di un gene detto housekeeping la cui espressione non sia influenzabile dal trattamento. Il gene housekeeping da noi scelto è quello per la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), enzima della via glicolitica e classicamente indicato come housekeeping gene nell ambito della biologia molecolare con modelli di mammifero. Il primo step del protocollo prevede la normalizzazione dei campioni rispetto all espressione di GADPH; ciò significa individuare per ciascun campione la quantità da utilizzare in PCR affinché la quantità di GADPH amplificata sia identica a quella di tutti gli altri campioni. Tutte le reazioni devono essere effettuate entro la fase esponenziale della reazione di PCR, pertanto questa rappresenta la fase più lunga e complessa della procedura di screening. Tale fase è stata portata a termine per tutti i 58 campioni pervenuti. Al termine di questa fase, tuttavia, 20 campioni sono stati scartati in quanto la loro espressione media di GAPDH era piuttosto bassa. La ragione di ciò è da ricercarsi nella quantità relativamente scarsa di RNA stampo che è stato possibile ottenere dai campioni scartati oppure nella presenza di contaminanti, residuo della purificazione, che Pagina 3 di 14

4 riducono l efficienza della reazione di PCR. In sostanza, il materiale raccolto era in quantità insufficiente a garantire il dovuto numero di ripetizioni su cui si basa l affidabilità del dato, per cui si è preferito ridurre il numero dei campioni a vantaggio dell accuratezza del risultato. Su questi campioni, è stata comunque effettuata la reazione di immunoblot. Dopo aver normalizzato i campioni in relazione all espressione di GAPDH, la seconda fase prevede l analisi del livello di espressione di HSP nei vari campioni. Il progetto prevedeva lo studio di HSP70, 90 e 27, ma, in ragione dei risultati ottenuti e della quantità di materiale a disposizione, l indagine mediante RT-PCR è stata circoscritta alle più significative HSP70 (Goodman e Blank, 1998, 2002). Le immagini delle elettroforesi delle amplificazioni effettuate sono state ottenute in forma digitale mediante GelDoc (BIO-RAD,CA, USA), ossia uno strumento di fotodocumentazione digitale. Le immagini ottenute sono state poi vagliate mediante un analisi semiquantitativa mediante il software contenuto nell apparecchio. Tale software permette di valutare con precisione l entità di una positività basandosi sull intensità di segnale di standard introdotti dall operatore. Utilizzando questa strumentazione, pertanto, siamo stati in grado di stilare una classifica di espressione di HSP70 a partire dal campione che presentava la maggiore intensità di segnale, a parità di segnale per il GAPDH. Più precisamente, una volta ottenuto il volume necessario per amplificare i campioni in modo da avere un esito uniforme nella PCR per GAPDH, lo stesso è stato utilizzato per le reazioni di PCR per HSP70. In questo modo ho ottenuto di confrontare l espressione di HSP70 a parità di espressione di GAPDH. Al fine di ulteriore conferma dei dati ottenuti e per avere dati numerici che mi permettessero di stilare una classifica precisa, è stato anche calcolato il rapporto tra espressione di GAPDH ed HSP70 e, accertato che coincidesse con quanto raccolto dalla sola valutazione delle reazioni di RT- PCR per le HSP70, la classifica definitiva è stata compilata. Dato che non necessariamente all aumento della quantità di trascritto di un gene corrisponde un aumento della proteina effettivamente prodotta, contemporaneamente all indagine condotta mediante RT-PCR è stata effettuata un indagine mediante immunoblot. Ciò è stato reso possibile dal fatto che il TRIREAGENT, (Sigma) consente la contemporanea estrazione di acidi nucleici e proteine in fasi successive, e pertanto di uno stesso campione è possibile valutare sia l espressione di un gene sia la sua effettiva traduzione. L estratto proteico dei linfociti è stato sottoposto a dosaggio mediante metodo di Bradford, quindi l accuratezza del dosaggio è stata testata mediante un saggio elettroforetico in condizioni denaturanti (SDS-PAGE) seguito dalla colorazione con blu di Pagina 4 di 14

5 Coomassie allo 0,1%. Lo scopo di questa fase preparativa è di assicurarsi della qualità e della quantità del materiale proteico estratto. Mentre per le reazioni di RT-PCR come housekeeping gene è stato individuato il GAPDH, per le reazioni di immunoblot il peptide housekeeping scelto è stato la -tubulina, in quanto gli anticorpi disponibili in commercio verso questa molecola garantiscono un ottima resa e scarsissimo binding aspecifico. Analogamente a quanto descritto per il GAPDH, i campioni di proteine raccolti sono stati dapprima normalizzati verso la loro -tubulina, quindi sono stati effettuati immunoblot verso le HSP di interesse. La procedura per l immunoblot è semplice ed abbondantemente descritta (Malagoli et al., 2004). Dopo una operazione elettroforetica del materiale proteico ottenuto dai linfociti, le proteine sono trasferite su una membrana in poli-vinil-di-fluoride (PVDF) mediante l applicazione di un campo elettrico. Dopo il trasferimento, i siti di legame aspecifici della membrana, potenziale fonte di falso positivo e di background, vengono saturati con una specifica soluzione di blocco, indi si effettua la marcatura dell antigene di interesse con l anticorpo primario. Seguono alcune fasi di lavaggio, terminate le quali si aggiunge un anticorpo secondario che si lega gli immunocomplessi formatisi nella fase precedente. L anticorpo secondario è coniugato ad un enzima per cui, aggiungendo un substrato cromogenico alla membrana dopo l applicazione dell anticorpo secondario, la presenza dell immunocomplesso antigene-anticorpo primario-anticorpo secondario sarà resa evidente dalla formazione di un prodotto colorato o, a seconda dei casi, fluorescente. Nel nostro caso, l anticorpo secondario è stato coniugato con fosfatasi alcalina ed il substrato cromogenico utlizzato era il blu di nitrotetrazolio/5-bromo-4-cloro-indolil fosfato (NBT/BCIP). Come per le reazioni di RT-PCR, l immagine digitale delle membrane è stata acquisita mediante GelDoc (BIO-RAD) e quindi analizzata in modo semiquantitativo. Più precisamente, ottenuti i volumi di campione da caricare su gel al fine di ottenere un omogeneo segnale verso la tubulina, gli stessi sono stati utilizzati per elettroforesi seguite da immunoblot verso le HSP 70, 90 e 27. A questo punto, il paragone dell intensità del segnale per le HSP mi consente di stabilire a quale campione corrisponda il maggior livello di proteine effettivamente prodotte. Pagina 5 di 14

6 RISULTATI E DISCUSSIONE L analisi dei risultati ottenuti mediante RT-PCR consente di escludere una qualunque relazione evidente fra intensità dell esposizione e livello dell espressione di HSP70 (Fig. 1). Infatti, esposizioni di intensità massime non corrispondono a livelli particolarmente elevati di HSP70, così come esposizioni relativamente modeste possono comunque corrispondere a livelli elevati di HSP70. Questo dato può apparire inatteso in quanto esperimenti condotti presso il nostro laboratorio sul mollusco bivalve Myitlus galloprovincialis indicano come campi magnetici a frequenza estremamente bassa (ELF- MF) possano influenzare significativamente l espressione di molecole della famiglia HSP, in particolar modo delle HSP70 (Malagoli et al., 2004). Inoltre, l effetto di campi ELF su cellule di mammifero è già stato riportato (Goodman e Blank, 1998, 2002). Nel caso della presente indagine, invece, i linfociti presentano un ampia variabilità individuale in termini di espressione di HSP70, ma non si osserva corrispondenza fra entità dell esposizione e livello di espressione di HSP70. Quanto osservato mediante esperimenti di RT-PCR per le HSP70 è sostanzialmente confermato dai dati ottenuti mediante immunoblot, per cui non si osservano correlazioni significative tra livelli di esposizione ai campi ELF ed espressione di HSP70. È comunque opportuno sottolineare che dall immunoblot risulta che l eterogeneità in termini di livelli di espressione appare essere fortemente mitigata in sede di traduzione. Infatti l espressione di HSP70 risulta essere sostanzialmente omogenea, ed analizzando l immunoreattività contro le HSP70, si osserva come la maggior parte dei campioni presenti un espressione bassa o scarsamente rilevabile (Fig. 2). Questa osservazione è sicuramente in parte da imputare alla minor sensibilità della metodica rispetto alla RT-PCR, ma d altro canto può anche essere in parte dovuta ad una delle due seguenti cause: la prima è che il controllo dell espressione di HSP70 a livello di traduzione determini il blocco della traduzione dell mrna sintetizzato in eccesso in quanto HSP ulteriori non sono necessarie; la seconda è che la lisi del materiale a noi pervenuto sia avvenuta dopo un eventuale aumento di trascrizione ma prima della traduzione. Quest ultima ipotesi, tuttavia, indicherebbe la presenza di uno stress acuto e molto recente, il che non trova riscontro nella mancata correlazione tra intensità della positività ad RT-PCR ed esposizione ai campi ELF. Dati i problemi inerenti alla quantità di materiale disponibile ed in considerazione della mancata correlazione tra livelli di RNA per HSP70 e presenza effettiva di proteine, Pagina 6 di 14

7 abbiamo focalizzato la nostra attenzione direttamente sul livello delle proteine espresse, HSP90 ed HSP27. Le prime proteine analizzate sono state le HSP90 in quanto da noi già studiate in M. galloprovincialis (Malagoli et al., 2004). Come per le HSP70, non è stata osservata una diretta correlazione tra intensità di esposizione e quantità di proteine espresse dai linfociti. Per quanto attiene le HSP27, il segnale per queste proteine è in generale troppo basso perché sia fattibile una reale classifica di espressione come è stato invece fatto per le HSP70 ed HSP90. Resta tuttavia da rilevare il fatto che l espressione è ugualmente al limite del rilevabile tanto tra gli individui maggiormente esposti quanto tra quelli soggetti ad esposizione minima. Come sopra accennato, i dati sono in apparente contraddizione con quanto osservato nel mollusco bivalve Mytilus galloprovincialis, in cui esposizioni ripetute ai campi ELF determinava una chiara induzione di HSP70 ed HSP90 (Malagoli et al., 2004). D altro canto, è opportuno sottolineare che i livelli di intensità dei campi applicati nei nostri protocolli sperimentali erano dell ordine delle centinaia di microtesla ( frazioni. A conferma dell intensità dell esposizione quale variabile fondamentale per determinare una risposta in termini di aumentata espressione di HSP, recenti esperimenti da noi condotti hanno dimostrato che esemplari di M. galloprovincialis esposti per 30 incremento nell espressione di HSP70 (Malagoli et al., 2006). Il dato è importante in quanto è da sottolineare che mentre l intensità media dei campi cui i mitili sono stati vo in quanto, associato con le nostre precedenti osservazioni condotte sugli immunociti di mitilo, indica nei tempi e nell intensità media di esposizione le due variabili fondamentali in grado di generare una risposta nel nostro modello (Ottaviani et al., 2002; Malagoli et al., 2003, 2004, 2006; Gobba et al., 2004). Su questa base, è pertanto lecito concludere che le intensità dei campi cui i lavoratori sono stati esposti sono insufficienti a determinare uno stress tale da incrementare significativamente la produzione di HSP. Infine, è opportuno considerare che le HSP possono essere influenzate da numerose altre variabili, e quindi si potrebbe obiettare che le abitudini dei singoli individui possano aver mascherato un eventuale lieve effetto dei campi ELF (Morimoto et al., 1997). Tuttavia, la sensibilità della tecnica di RT-PCR, associata al dato degli immunoblot, portano ad escludere una significativa influenza, Pagina 7 di 14

8 ancorché lieve, dei campi magnetici cui i lavoratori sono stati esposti sull espressione delle HSP70, 90 e 27. Pagina 8 di 14

9 CONCLUSIONE Al termine delle indagini previste dal progetto, è possibile concludere che non sussiste alcuna evidente correlazione tra intensità dei campi magnetici cui i soggetti dello studio sono stati esposti e loro livelli di espressione di HSP70 e 90. Sulla base dei dati esistenti in letteratura in merito alla correlazione tra HSP e campi ELF sia nei mammiferi (Goodman e Blank, 1998, 2002) che in modelli di invertebrato (Malagoli et al., 2005, 2006), ciò è da attribuirsi all intensità/tempo cui i soggetti in esame sono stati esposti. Pertanto, i livelli di esposizione a campi ELF registrati nella presente indagine non sono tali da aumentare significativamente l espressione di proteine correlate allo stress nei linfociti circolanti di lavoratori esposti. Pagina 9 di 14

10 N campione Codice campione Anagrafica Sesso Esposione ( T) BAER 17/07/ , CAMA 12/04/ , ZAFI 01/09/ , FEMA 08/09/ , SAEN 22/03/ , PERO 10/01/ , DEVA 19/08/ , IMGI 16/06/ , BAVI 21/06/ , GAMO 29/12/ , SCAN 29/05/ , GRFR 24/01/ , PEMA 06/02/ , RULA 26/02/ , MAEL 01/12/ , FOGI 24/12/ , FIGI 24/01/ , CACO 29/03/ , ABDO 26/10/ , BEDI 01/12/ , MACA 01/04/ , ZAMA 06/03/ , DEFE 04/06/ , LAGI 22/02/ , FEPA 28/06/ , CAMA 12/04/ , FIFA 12/02/ , LOAN 21/04/ , ORDA 21/02/ , CELU 10/05/ , LIGI 17/08/ , ZALO 01/09/ , MATE 10/09/ , CALA 26/06/ , CAMA 12/04/ , BEDI 31/03/ , CODI 02/04/ , COMA 01/01/ ,13 Fig. 1. Confronto fra livello di espressione di HSP70 valutato mediante RT-PCR, e livello di esposizione dei lavoratori analizzati dall unità operativa 5. Il codice colore indica il livello di espressione arbitrariamente fissato per comodità di lettura in espressione molto sopra la media dell esperimento (rosso), espressione moderatamente sopra la media dell esperimento (giallo), espressione media (bianco), espressione poco sotto la media dell esperimento (verde), nessuna espressione rilevata (azzurro). I campioni non in elenco non presentavano RNA di quantità/qualità tali da consentirne un efficiente utilizzo nelle reazioni di RT-PCR. Pagina 10 di 14

11 7 28HAAD 08/12/ , DEVA 19/08/ , LOAN 21/04/ , ZAMA 06/03/ , DEFE 04/06/ , BEDI 01/12/ , BIMA 16/07/ , SCAN 29/05/ , CACO 29/03/ , ORDA 21/02/ , RUGI 12/05/ , BEDI 31/03/ , BECR 19/02/ , GAMO 29/12/ , PERO 10/01/ , CODI 02/04/ , IMGI 16/06/ , ABDO 26/10/ , GRFR 24/01/ , CALA 26/06/ , FIGI 24/01/ , CELU 10/05/ , FOGI 24/12/ , SEMA 06/02/ , TRLU 20/06/ ,34 Fig. 2. Confronto fra livello di espressione di HSP70 valutato mediante immunoblot, e livello di esposizione dei lavoratori analizzati dall unità operativa 5. Il codice colore indica il livello di espressione arbitrariamente fissato per comodità di lettura in espressione molto sopra la media dell esperimento (rosso), espressione moderatamente sopra la media dell esperimento (giallo), espressione media (bianco), espressione poco sotto la media dell esperimento (verde), nessuna espressione rilevata (azzurro). I campioni non in elenco non presentavano immunoreattività verso la tubulina e le HSP70 di quantità/qualità tali da consentirne un efficiente utilizzo nella quantificazione dei segnali di immunoblot. Pagina 11 di 14

12 55 56ARMA 22/04/ , ESMO 04/12/ , GAMO 29/12/ , DEFE 04/06/ , ASAN 31/08/ , MAVI 16/12/ ,06 8 7MOGI 12/07/ , RUGI 12/05/ , PIGI 07/03/ , FERO 07/07/ , BEAN 31/05/ , GALU 07/10/ , MAFA 15/04/ LALO 22/08/ , RURO 22/12/ , MAUM 18/02/ , SAEN 22/03/ , IAGI 07/09/ , GUMO 26/06/ , ZULO 25/04/ , PICA 27/02/ , SADA 06/03/ , GAPA 12/08/ , SCME 22/09/ , SCAN 29/05/ , HAAD 08/12/ , TODO 07/11/ , POMA 26/08/ ,06 9 8BAMA 28/02/ ,46 2 1SPMO 20/04/ , DEMO 16/02/ , CAMA 12/04/ , CAMA 12/04/ , ASAN 31/08/ , SAEN 22/03/ , BAWI 28/09/ , SOGI 28/11/ , RULA 26/02/ , GRFR 24/01/ , IAFE 13/06/ , CODI 02/04/ , ZALO 01/09/ , CORO 25/05/ , MOMA 06/09/ , RUGI 12/05/ , LUCA 07/03/ , NOGI 05/12/ , COSA 01/02/ , PEMA 06/02/ ,91 Fig. 3. Confronto fra livello di espressione di HSP70 valutato mediante immunoblot, e livello di esposizione dei pazienti analizzati dall unità operativa 5. Il codice colore indica il livello di espressione arbitrariamente Pagina 12 di 14

13 fissato per comodità di lettura in espressione molto sopra la media dell esperimento (rosso), espressione moderatamente sopra la media dell esperimento (giallo), espressione media (bianco), espressione poco sotto la media dell esperimento (verde), nessuna espressione rilevata (azzurro). I campioni non in elenco non presentavano immunoreattività verso la tubulina e le HSP90 di quantità/qualità tali da consentirne un efficiente utilizzo nella quantificazione dei segnali di immunoblot. Pagina 13 di 14

14 BIBLIOGRAFIA Chomczynski P, Sacchi N. Anal Biochem. 162: , Gobba F, Malagoli D, Ottaviani E. Effect of 50 Hz magnetic fields on fmlp-induced shape changes in invertebrate immunocytes: the role of calcium ion channels. Bioelectromagnetics. 24: , Goodman R, Blank M. Magnetic field stress induces expression of hsp70. Cell Stress 3: 74-88, Goodman R, Blank M. Insights into electromagnetic interaction mechanisms. J. Cell. Phy. 192: 16-22, Malagoli D, Gobba F, Ottaviani E. Effects of 50 Hz magnetic fields on the signalling pathway of fmlp-induced shape change in invertebrate immunocytes: the activation of an alternative stess pathway. Biochim. Biophis. Acta. 1620: , Malagoli D, Gobba F, Ottaviani E. 50 Hz magnetic fields of constant or fluctuating intensity: effects on immunocyte hsp70 in the mussel Mytilus galloprovincialis. Bioelectromagnetics 27: Malagoli D, Lusvardi M, Gobba F, Ottaviani E. 50 Hz magnetic fields activate mussel immunocyte p38 MAP kinase and induce HSP70 and 90. Comparative Biochemistry and Physiology Part C 137: 75-79, Morimoto RI, Kline MP, Bimston DN, Cotto JJ. The heat shock response: regulation and function of heat shock proteins and molecular cheperones. Biochemistry 32: 17-29, Ottaviani E, Malagoli D, Ferrari A, Tagliazucchi D, Conte A, Gobba F. 50 Hz magnetic fields of varying flux intensity affect cells shape changes in invertebrate immunocytes: the role of potassium ion channels. Bioelectromagnetics 23: , Pagina 14 di 14