Considerazioni sulla sorveglianza passiva della West Nile Disease negli equidi. L esperienza dell Emilia-Romagna nel triennio

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1 Considerazioni sulla sorveglianza passiva della West Nile Disease negli equidi. L esperienza dell Emilia-Romagna nel triennio Annalisa Santi 1, Gualtiero Gandini 2, Antonella Gallucci 2, Silvia Dell Anna 1, Marco Tamba 1 1 Sorveglianza Epidemiologica Emilia-Romagna, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia-Romagna, Via P. Fiorini 5, Bologna, Italy 2 Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, Via Tolara di Sopra, 50, Ozzano Emilia (BO), Italy RIASSUNTO La West Nile Disease (WND) è considerata in Italia una zoonosi riemergente in seguito alla ricomparsa sul territorio nazionale nell estate del 2008, a distanza di 10 anni dal primo episodio di malattia registrato in Toscana (Macini et al. 2008). Il West Nile Virus (WNV) si mantiene in natura grazie ad un ciclo che coinvolge gli uccelli e le zanzare, tuttavia diversi mammiferi come l uomo e il cavallo possono infettarsi manifestando generalmente sintomi simil-influenzali e in alcuni casi anche gravi meningoencefaliti. L obiettivo principale della sorveglianza veterinaria è la rilevazione precoce della circolazione virale al fine di adottare misure di prevenzione dell infezione nel cavallo e nell uomo. Uno degli strumenti più efficaci a questo scopo è la valutazione dello stato clinico dei cavalli di proprietà, mirata alla segnalazione di casi sospetti da sottoporre ad accertamenti diagnostici (OM 5/11/2008). Sono state esaminate le schede anamnestiche relative ai casi clinici confermati di WND nel cavallo, riscontrati in Emilia-Romagna nel corso del triennio Il quadro clinico è risultato assai variabile e aspecifico confermando la necessità di ricorrere a specifici test di laboratorio per giungere alla diagnosi. Una maggiore informazione e sensibilizzazione dei veterinari operanti nel settore ippiatrico renderà più efficiente questo sistema di sorveglianza individuando prontamente nuovi casi sul territorio. L obiettivo di questo articolo è mettere a disposizione dei veterinari libero-professionisti alcuni strumenti diagnostici utili al riconoscimento della patologia neurologica e le modalità di segnalazione dei sospetti clinici di WND nel cavallo. INTRODUZIONE La West Nile Disease (WND) è una zoonosi trasmessa da zanzare divenuta negli ultimi anni una delle malattie più rilevanti in Sanità Pubblica Veterinaria, in seguito all aumento del numero di focolai registrati in Europa e nel bacino del mediterraneo (Zeller e Schuffenecker 2004; Calistri et al., 2010). La malattia è causata dal West Nile virus (WNV), un virus ad RNA della famiglia Flaviviridae, genere Flavivirus, appartenente al gruppo antigenico dell Encefalite Giapponese (Campbell et al., 2002). Il ciclo di trasmissione del WNV si svolge tra gli uccelli, che costituiscono il serbatoio di infezione e le zanzare ornitofile, che svolgono il ruolo di vettori. In Europa il ruolo principale per la trasmissione sembra essere svolto principalmente da zanzare del genere Culex (Hubalek Z. et al., 1999; Bellini et al., 2009). Gli uccelli selvatici costituiscono generalmente il serbatoio principale per il mantenimento del virus in natura, tra questi, i passeracei appaiono particolarmente sensibili (Komar et al., 2003). Il WNV può infettare anche specie diverse di mammiferi, che però sviluppano bassi livelli di viremia e non sono in grado di trasmettere il virus agli insetti vettori (ospiti a fondo cieco) (Dauphin 2004). Tra i mammiferi l uomo e il cavallo possono manifestare, in seguito ad infezione, sintomatologia clinica riferibile nella maggior parte dei casi a un quadro clinico simil-influenzale, e in percentuale molto più ridotta, a quadri di interessamento del Sistema Nervoso Centrale (SNC) a volte tanto severi da produrre gravi invalidità permanenti quando non la morte stessa del soggetto colpito (Long 2007). In Italia la WND è stata segnalata per la prima volta in Toscana nel 1998, in alcuni cavalli presenti nelle province di Pisa, Lucca e Pistoia, vicino ad una zona umida denominata Padule di Fucecchio (Autorino et al., 2002). A distanza di 10 anni dall episodio toscano il WNV si è manifestato nuovamente sul territorio nazionale: nel 2008 è stata rilevata sintomatologia nei cavalli in 3 regioni: Emilia-Romagna, Veneto e Lombardia dove si sono registrati 794 casi di infezione, di cui 32 con sintomi clinici (4%) e 5 deceduti (15,6%) (Calistri et al., 2009). L anno successivo il WNV ha continuato a circolare non solo nelle stesse zone Articolo ricevuto dal Comitato di Redazione il 01/08/2011 ed accettato per la pubblicazione dopo revisione il 16/02/2012. Ippologia, Anno 23, n. 1, Marzo

2 colpite dall epidemia l anno precedente ma anche in aree limitrofe. Nel 2009 sono state interessate dalla circolazione virale diverse regioni d Italia (Emilia-Romagna, Lombardia, Veneto, Toscana, Lazio e Friuli Venezia Giulia) e sono stati rilevati 221 casi di infezione nei cavalli, di cui 37 casi clinici e 9 decessi (CESME 2009; Monaco et al., 2011). Nel 2010 sono stati registrati casi clinici nei cavalli in Veneto e in Sicilia e una sieroconversione in Emilia-Romagna, (CESME 2010). In Italia il WNV ha colpito nel biennio non solo la popolazione animale ma anche la popolazione umana determinando 8 casi di malattia neuro-invasiva nel 2008 e 18 nel 2009, di cui 4 fatali (Rizzo et al., 2009; Angelini et al., 2010). La ricomparsa del WNV in Italia ha reso necessario un aggiornamento della normativa nazionale: sono state emanate nuove norme (OM 5/11/2008, DM 29/11/2007, DM 15/09/2009 e OM 4/8/2011) con l obiettivo di rilevare il più precocemente possibile la circolazione virale sia nelle aree già interessate dall epidemia dell anno precedente che nelle restanti parti del territorio nazionale. È stata resa obbligatoria la segnalazione di sospetti clinici di WND negli equidi, ai sensi dell art. 1 del Regolamento di Polizia Veterinaria. Tra le attività svolte, la sorveglianza passiva, mediante la valutazione dello stato clinico dei cavalli di proprietà, si è rivelata un buon strumento di rilevazione del WNV su tutto il territorio nazionale. Questa attività deve essere incentivata con azioni di sensibilizzazione e informazione dei veterinari liberi professionisti operanti nel settore ippiatrico. L intento di questo articolo è mettere a disposizione gli strumenti diagnostici utili al riconoscimento della patologia neurologica e le modalità di segnalazione dei sospetti clinici di WND nel cavallo. PATOGENESI E SINTOMATOLOGIA DELLA WND NEL CAVALLO In seguito all inoculazione cutanea del virus della WND mediante la puntura di una zanzara infetta, la replicazione virale inizia nei tessuti locali e nei linfonodi regionali, raggiungendo la circolazione sistemica attraverso i vasi linfatici del sistema reticolo-endoteliale. (Deubel et al., 2001; Petersen et al., 2003; Castillo-Olivares e Wood 2004; Zeller e Schuffenecker, 2004). All infezione segue una viremia di breve durata che permette al virus di diffondere ai tessuti extraneurali e che probabilmente precede l invasione del sistema nervoso e, di conseguenza, anche la comparsa dei segni clinici specifici (Castillo-Olivares e Wood 2004). In questa fase il titolo virale in circolo aumenta notevolmente, ma non supera le 10 3 PFU/ml di siero risultando insufficiente a trasmettere il virus all insetto vettore (Bunning et al., 2002). La breve durata della viremia, ma soprattutto l insufficiente concentrazione virale nel sangue rendono il cavallo incapace di diffondere la malattia e ne fanno di fatto un ospite a fondo cieco. Nel cavallo, il meccanismo di invasione del tessuto nervoso da parte del Flavivirus non è ancora del tutto noto, e le ipotesi sulle potenziali modalità di penetrazione del virus nel SNC comprendono la diffusione passiva attraverso l endotelio dei capillari, la replicazione virale nelle cellule endoteliali e successivamente nel parenchima del SNC, e il trasporto retroassonale del virus da parte di neuroni infetti dell epitelio olfattorio (Castillo - Olivares e Wood 2004). Negli equidi, a differenza di ciò che è stato riscontrato nei volatili, il basso titolo virale, la viremia di breve durata e l assenza di riscontro dell antigene nelle cellule dell endotelio vasale, rendono la prima ipotesi relativamente improbabile (Cantile et al., 2001; Bunning et al., 2002; Castillo-Olivares e Wood 2004). Anche l ipotesi del trasporto retroassonale sembra perdere di validità in base ai risultati negativi derivanti da studi su criceti infettati sperimentalmente, dove l antigene virale non fu riscontrato nel bulbo olfattivo di nessuna delle cavie infette (Xiao et al., 2001). Istologicamente, le lesioni determinate dal WNV sono caratterizzate da un quadro di polioencefalomielite non suppurativa, di severità variabile, maggiormente riscontrabile nella parte caudale del tronco encefalico e nelle corna ventrali del midollo spinale, in particolare del suo tratto toracolombare. Le lesioni sono caratterizzate da un pattern infiammatorio, consistente in manicotti perivascolari di linfociti e macrofagi, associato a frequenti emorragie. A livello dell endotelio capillare non è però mai stata documentata l azione lesiva del virus che, mediante colorazioni immunoistochimiche specifiche, è invece rinvenuto in modo estremamente esiguo nel tessuto nervoso. Tipicamente, il cervelletto e la corteccia cerebrale sembrano essere più risparmiati rispetto ad altre aree (Cantile et al., 2001). Nel cavallo, la WND decorre solitamente in forma asintomatica, eccetto che in una bassa percentuale di casi (circa il 10%), in cui si osserva, dopo un periodo di incubazione compreso tra 3 e 15 giorni, l insorgenza di una sintomatologia dapprima tipicamente febbrile, che a volte può risolversi spontaneamente o, più spesso, evolvere in un quadro clinico più grave, caratterizzato da deficit neurologici di entità diversa a carico dell encefalo e/o del midollo spinale. Nei casi più gravi la sintomatologia neurologica può progredire determinando paresi progressiva, con paralisi e decubito permanente dell animale. La severità dei segni clinici sembra essere dovuta alla carica infettante, al distretto interessato e alla capacità reattiva del sistema immunitario del soggetto colpito. 34 Considerazioni sulla sorveglianza passiva della West Nile Disease negli equidi. L esperienza dell Emilia-Romagna nel triennio

3 In alcuni casi la sintomatologia è invece modesta e transitoria, con completa remissione addirittura in 5-7 giorni, e può pertanto passare quasi inosservata. Una significativa percentuale dei cavalli colpiti guarisce spontaneamente, mentre il tasso di letalità risulta compreso tra il 30% e 40% e sembra legato al grado di patogenicità virale. Le maggiori percentuali di letalità sono state osservate nelle epidemie che hanno colpito gli Stati Uniti e la Francia (Long 2007; Castillo-Olivares e Wood 2004). I segni non neurologici e più aspecifici testimoniano gli effetti della fase viremica ed il risentimento generale del soggetto colpito. In questo primo momento i segni clinici sono caratterizzati da febbre (da lieve o moderata), abbattimento, disoressia e, talvolta, è descritta una sintomatologia colica. I segni appena descritti possono esaurirsi e portare ad una guarigione spontanea o evolvere verso una più chiara sindrome clinica neurologica che, nelle sue manifestazioni, riflette la distribuzione delle lesioni a livello di sistema nervoso centrale (SNC) (Cantile et al., 2000; Cantile et al., 2001; Castillo-Olivares e Wood 2004). A differenza di quanto accade per le altre encefaliti virali del cavallo, la WND produce sintomi che riflettono maggiormente il coinvolgimento del midollo spinale. I segni neurologici di più frequente riscontro sono le alterazioni dell andatura, ed in particolare l atassia propriocettiva, che può essere accompagnata da diversi gradi di paresi, ed interessare solo gli arti posteriori o coinvolgere tutte e quattro le estremità. Non è infrequente vedere casi caratterizzati da una lateralizzazione anche marcata dei deficit locomotori. L atassia si manifesta come una incoordinazione caratterizzata da movimenti esagerati, iper- o ipometrici, incespicamento, dorsoflessione spontanea del piede, evidenti soprattutto durante i cambi di direzione. Alla visita clinica può essere utile effettuare manovre specifiche che servano a stressare la funzione propriocettiva, quali lo sway test, l andatura in circolo stretto, la retropulsione, l andatura con la testa bendata. Altri segni neurologici riportati di frequente sono le fascicolazioni, i tremori muscolari e le alterazioni del comportamento, consistenti in irrequietezza, digrignamento dei denti e iperreattività ai rumori e agli stimoli tattili, fino all assunzione di comportamenti manifestamente aggressivi (Cantile et al., 2000; Long 2007). Nelle epidemie che hanno colpito il continente nord americano è descritto che circa un terzo dei soggetti sintomatici sviluppa una sintomatologia più grave, caratterizzata da incapacità a mantenere la stazione, paralisi, segni di disfunzione vestibolare, deficit dei nervi cranici (paresi/paralisi del facciale, disfagia, paralisi della lingua), che può portare ad un exitus spontaneo o fare propendere il proprietario per l eutanasia dell animale alla luce della gravità dei deficit della funzione nervosa (Ostlund et al., 2001). Tra i diversi autori vi è accordo nell associare la condizione di decubito permanente del soggetto colpito ad una prognosi infausta (Long et al., 2002; Scott Weese et al., 2003; Ward et al., 2006). La diagnosi clinica viene emessa sulla base dei sospetti scaturiti dalla sintomatologia neurologica riscontrata, peraltro assai variabile, e deve essere confermata almeno con l esame sierologico, che rivela la presenza di Anticorpi contro il virus WN, o con prove rivolte a svelare la presenza del virus. Le IgM sono rilevabili da 7 giorni post infezione (g.p.i.) fino ad 1-2 mesi, mentre le IgG che compaiono 8-10 g.p.i persistono sino a 15 mesi e oltre, dopo l infezione (Bunning et al., 2002). DIAGNOSI DIFFERENZIALE Da un punto di vista clinico, l encefalomielite da West Nile virus si presenta con quadri anche molto diversi tra loro, sia per i distretti del SNC colpiti che, a parità di area lesionata, per la severità dei sintomi neurologici. Ciò non aiuta il clinico perché non esiste evidenza di uno specifico corredo sintomatologico che possa suggerire la presenza della malattia e, di fatto, apre in modo significativo il ventaglio delle possibilità diagnostico-differenziali. Da un punto di vista procedurale, l encefalomielite causata dal virus West Nile, dovrebbe quindi essere distinta da tutte quelle patologie che possono presentarsi con le medesime modalità, ovvero con insorgenza acuta e decorso progressivo e con una localizzazione neuroanatomica al Sistema Nervoso Centrale, con particolare interessamento del midollo spinale, del romboencefalo e del mesencefalo (Cantile et al., 2000; Castillo-Olivares e Wood 2004). Indubbiamente però, la presenza di un cavallo con sintomatologia neurologica in associazione a determinati fattori epidemiologici come l infestazione di zanzare, la particolare stagione dell anno (luglio-settembre), il verificarsi di casi clinici simili in aree limitrofe e un eventuale riscontro di mortalità anomale negli uccelli selvatici, inducono a ipotizzare con buona approssimazione la responsabilità del virus della WND e contribuiscono a guidare l impostazione del protocollo diagnostico. Tra le malattie di natura infettiva, devono essere di norma considerate in diagnosi differenziale la mielopatia da Herpesvirus (EHV-1), le encefaliti equine sostenute da Alfa-Virus (Encefalite equina dell est, Encefalite equina dell ovest, Encefalite equina venezuelana), la mieloencefalite protozoaria equina (EPM), la rabbia e, meno comunemente, il botulismo, le sporadiche mieliti batteriche o micotiche e la meningoencefalomielite verminosa (Long et al., 2002). Tra le forme non infettive si devono con- Ippologia, Anno 23, n. 1, Marzo

4 siderare l ipocalcemia, le neoplasie, l intossicazione con sostanze tremorgeniche, l encefalopatia epatica, la leucoencefalomalacia. Quando questo elenco di malattie viene trasferito nella realtà italiana, appare evidente che l occorrenza di alcune malattie è un fattore decisamente improbabile. Alcune patologie come le encefaliti da alfa virus e l EPM sono malattie esotiche non presenti in Italia; la rabbia è attualmente confinata all area alpina del nord est. Va aggiunto che queste malattie (ad eccezione dell EPM) producono segni di origine marcatamente intracranica, gravi e rapidamente progressivi, abbastanza diversi da quelli prodotti dalla WND. Situazioni patologiche di origine non infettiva, seppur decisamente sporadiche, possono essere avvalorate in presenza di specifici riferimenti anamnestici. Tra le patologie a localizzazione spinale, si devono considerare anche malattie degenerative strutturali come la Mielopatia Stenotica Cervicale, meglio conosciuta come sindrome Wobbler e, in misura meno rilevante, malattie degenerative del midollo spinale come la Mieloencefalopatia Degenerativa Equina (Salvadori et al., 2007). Nel singolo soggetto possono essere considerate infine in diagnosi differenziale anche lesioni traumatiche e vascolari a carico del SNC, in presenza di manifestazioni cliniche ad esordio acuto e non progressivo, spesso caratterizzate da uno spontaneo miglioramento della sintomatologia. DIAGNOSI DI LABORATORIO Come accennato in precedenza, il sospetto diagnostico emesso sulla base dei dati clinici ed anamnestici deve essere confermato con una diagnosi di laboratorio. I campioni prelevati sono esaminati mediante prove di laboratorio che evidenziano anticorpi specifici prodotti in seguito all infezione (diagnosi indiretta) o che ricercano il WNV (diagnosi diretta). Il primo test eseguito per la ricerca di anticorpi è l ELISA (Elisa IgG, Elisa IgM), a cui segue come test di conferma, nel caso di positività, il test di Sieroneutralizzazione (SN) e il test di riduzione del numero delle placche (Plaque reduction neutralisation test-prnt) (OIE, 2008). Nel caso di sospetto clinico, la PCR da siero o sangue risulta generalmente negativa in quanto la viremia è di breve durata e solitamente non è più rilevabile all insorgenza dei sintomi clinici. In assenza di sintomi clinici, sono considerati casi di infezione recente anche quelli in cui si evidenzia presenza di anticorpi di classe IgM, sieroconversione o un incremento di almeno 4 log del titolo anticorpale ai test SN o PNRT tra due campioni di siero prelevati a distanza di almeno 3 settimane. Nelle aree in cui sono presenti diversi Flavivirus (Usutu virus in Europa, St Louis Encephalitis virus in USA) sono relativamente frequenti le crossreazioni, che devono essere sempre considerate nell interpretazione dei risultati nel caso si utilizzi per la diagnosi il test ELISA. Per quanto riguarda le metodiche di diagnosi diretta, il test utilizzato per la ricerca virale è la PCR, che è effettuata su tutti i campioni prelevati dagli organi d elezione dei soggetti deceduti (cervello, midollo spinale, cuore e milza). L isolamento virale può essere effettuato a partire da tessuti d elezione quali cervello, midollo spinale o dal liquido cefalorachidiano. Il WNV è in grado di replicare su differenti cellule primarie e linee cellulari di mammiferi (VERO, BHK 21, RK 13 ), tuttavia sono necessari vari passaggi per rilevare l effetto citopatico (CPE). La conferma della presenza del virus è effettuata con il test di immunofluorescenza indiretta (IFI) o con tecniche di biologia molecolare (RT-PCR), metodiche che possono essere applicate anche direttamente su campioni di organo e tessuti (OIE, 2008). PREVENZIONE E CONTROLLO L uso di vaccini è utile per contenere e ridurre il rischio di malattia nelle aree in cui la malattia è endemica. Sono state create differenti tipologie di vaccini: inattivati, vivi attenuati e ricombinanti. La vaccinazione fornisce una buona copertura nei confronti del WNV e nel caso di infezione si osserva nei soggetti vaccinati una riduzione dell insorgenza di casi clinici gravi e decesso (Salazar et al., 2004). I vaccini inattivati sono già largamente impiegati in America e in Europa e da giugno 2009 possono essere utilizzati anche in Italia; forniscono una buona copertura per circa 12 mesi, dopo la somministrazione di 2 dosi inoculate a distanza di 3-5 settimane (Dauphin e Zientara 2007). Solitamente la prima vaccinazione è effettuata dopo i 6 mesi di età, per evitare l interferenza con anticorpi di origine materna, in seguito sono effettuati richiami annuali. La vaccinazione deve essere comunicata alla Azienda USL mediante apposito modello 12 e registrata sul passaporto del cavallo, perché la sieropositività da vaccino è indistinguibile da quella dovuta all infezione ed è necessario, in caso di indagini sierologiche in seguito a focolai, scartare dal controllo i cavalli vaccinati. Oltre alla vaccinazione, la prevenzione nei confronti dell infezione si basa sulla riduzione dell esposizione al vettore, attraverso semplici interventi come il ricovero notturno degli animali all interno delle strutture, l uso di ventilatori. Altre utili azioni sono lo spegnere le luci nei locali di stabulazione dei cavalli, mantenendone altre accese lontane dai ricoveri, il tenere gli uccelli fuori dalle scuderie e impedire la loro nidificazione nelle vici- 36 Considerazioni sulla sorveglianza passiva della West Nile Disease negli equidi. L esperienza dell Emilia-Romagna nel triennio

5 nanze. Inoltre è sempre conveniente, nelle strutture dove si detengono gli equidi, eseguire la lotta al vettore con trattamenti periodici degli ambienti e pulizia e sfalcio della vegetazione circostante (USDA, 2004). RILEVAZIONE E SEGNALAZIONE DEI CASI SOSPETTI Come già accennato, la segnalazione di sospetti clinici di WND negli equidi è obbligatoria ai sensi dell art. 1 del Regolamento di Polizia Veterinaria. Il quadro clinico rilevato a seguito di infezione da WNV è del tutto aspecifico e comune a più patologie virali a carico del SNC. Per giungere alla diagnosi è quindi fondamentale ricorrere a specifici test di laboratorio finalizzati alla rilevazione del virus o di una eventuale sieroconversione. Nel caso in cui si rilevi una sintomatologia neurologica è fondamentale considerare la WND tra le possibili cause, procedendo rapidamente al prelievo di campioni. È importante ricordare che il tempo trascorso tra la formulazione del sospetto clinico e l esito di conferma del laboratorio determina il livello di efficienza del sistema stesso che, come ricordato in precedenza, è mirato a rilevare il più precocemente possibile la circolazione virale sul territorio. A tale proposito, per facilitare l individuazione rapida di nuovi casi, l OM 5/11/2008 definisce sospetto clinico un equide che, nel periodo di attività dei vettori (indicativamente da inizio maggio a inizio novembre), manifesta atassia locomotoria oppure almeno uno dei seguenti sintomi: movimenti in circolo incapacità a mantenere la stazione quadrupedale paralisi/paresi degli arti fascicolazioni muscolari deficit propriocettivi. Tali sintomi possono essere accompagnati da debolezza degli arti posteriori, cecità, ptosi del labbro inferiore o paresi dei muscoli labiali o facciale, digrignamento dei denti. Nel caso in cui il veterinario LP identifichi un sospetto clinico, deve comunicare all Azienda USL competente per territorio il caso riscontrato e concordare il prelievo di campioni per i successivi test di laboratorio. La modulistica necessaria allo svolgimento delle procedure operative nell ambito della sorveglianza passiva è indicata nel DM 15/09/2009 ed è aggiornata e resa disponibile sul sito del Centro di Referenza Nazionale per le Malattie Esotiche (CESME) all indirizzo: emergenze.htm. Al momento del prelievo deve essere compilata la scheda di accompagnamento dei campioni, sulla quale devono essere raccolte le informazioni anagrafiche relative all allevamento, all identificazione del capo e al tipo di campione prelevato. Sulla scheda deve essere riportata l anamnesi raccolta al momento della visita clinica. Per ciascun sospetto devono essere prelevati due campioni di sangue da porre in due provette: una senza anticoagulante ed una con EDTA (almeno 8 ml di sangue per provetta da conservare a temperatura di +4 C). Nel caso di soggetti morti in seguito a sintomatologia neurologica devono essere prelevati, nel corso dell esame anatomopatologico, gli organi di elezione per l isolamento virale quali cervello, midollo spinale, liquido cefalorachidiano, cuore e milza. La carcassa deve essere conferita all IZS dove, in idonei spazi, con la dovuta attrezzatura e seguendo le norme di bio-protezione si procederà al prelievo dei campioni di organo. I campioni prelevati dai sospetti clinici, insieme alla scheda di accompagnamento dei campioni, devono essere consegnati alla sezione IZS competente per territorio, tramite la quale saranno poi inviati al CESME di Teramo per l esecuzione delle indagini di laboratorio. Il sospetto clinico deve essere immediatamente notificato, a cura del Servizio Veterinario Regionale, al Ministero della Salute tramite il sistema informativo SIMAN ( Per questa ragione, in attesa degli esiti diagnostici, il veterinario ASL deve comunicare il sospetto clinico al Servizio Veterinario Regionale ed effettuare l indagine epidemiologica, raccogliendo le informazioni relative all azienda (codice, coordinate geografiche, indirizzo produttivo, numero di equidi presenti). A seguito della conferma diagnostica del sospetto, il veterinario ufficiale provvede ad effettuare la visita clinica e il prelievo di tutti gli equidi presenti in azienda, predispone le trappole per la cattura dei culicidi e completa l indagine epidemiologica, compilando anche le parti relative ai dati anamnestici dei cavalli sieropositivi e alla descrizione delle strutture presenti in azienda. La normativa non prevede alcun provvedimento restrittivo sugli allevamenti con casi confermati di WND, ma in caso di dimostrata circolazione di WNV sono previste misure di sorveglianza e prevenzione sulla popolazione umana (Min. Sal. DGPREV del 21/07/2010). Nella Tabella 2 sono elencati i principali siti web istituzionali in cui reperire informazioni utili, normativa, aggiornamenti sulla situazione epidemiologica nazionale. In seguito alla comparsa del WNV in Emilia-Romagna nel 2008 è stato avviato un piano di sorveglianza regionale, rinnovato e integrato negli anni successivi sulla base dell evoluzione della situazione epidemiologica del territorio. Per la raccolta delle informazioni anamnestiche relative ai sospetti clinici è stata predisposta un apposita scheda in cui descrivere e classificare mediante una checklist i disturbi nervosi osservati indicando la data di Ippologia, Anno 23, n. 1, Marzo

6 insorgenza e la durata della sintomatologia. Sulla scheda anamnestica possono essere segnalati anche eventuali sintomi a carico di altri apparati o di altri sintomi aspecifici come la febbre (PG 2009/ del 21/08/2009). Di seguito vengono descritti i risultati ottenuti dalla raccolta ed elaborazione delle informazioni riportate sulle schede anamnestiche relative ai casi clinici confermati rilevati in Emilia-Romagna dal 2008 al MATERIALI E METODI I cavalli con sintomi clinici neurologici che i veterinari liberi professionisti hanno segnalato all azienda ASL competente sono stati sottoposti a prelievo di sangue e siero. Sono stati confermati come casi clinici di WND i cavalli sospetti risultati positivi ai test ELISA IgM e SN (considerando un titolo soglia per la positività di 1:10). Al momento del prelievo sono state compilate le schede anamnestiche relative alla sintomatologia manifestata. Le schede utilizzate nel 2008 sono state perfezionate l anno successivo con l aggiunta di ulteriori sintomi rilevabili nel corso della visita clinica (es. alterazione dei nervi cranici). I dati sono stati elaborati scegliendo la scheda anamnestica del 2009 come modello di riferimento e riconducendo a questa la sintomatologia descritta nel Sono state calcolate le frequenze dei sintomi indicati nelle schede e il tasso di letalità (numero di soggetti deceduti/numero di casi clinici confermati) rilevato nel 2008 e nel È stato usato il test chi-quadro per valutare eventuali differenze nel tasso di letalità osservato nei due anni. I sintomi risultati più frequenti sono stati confrontati con quanto riportato in bibliografia relativamente alla sintomatologia manifestata dai cavalli colpiti nel 1998 in Toscana e in altri recenti focolai, per evidenziare eventuali differenze nel quadro clinico. RISULTATI Complessivamente nel triennio in Emilia-Romagna sono stati segnalati 91 casi sospetti, di cui 49 (53,8%) sono stati confermati dalle prove di laboratorio, nelle province di Bologna, Modena, Ferrara, Parma e Reggio Emilia, rispettivamente 23 nel 2008 e 26 nel Nessuno dei 12 sospetti clinici segnalati nel 2010 è stato confermato. La maggior parte dei casi clinici è stata rilevata nei mesi di agosto e settembre, in linea con il tipico andamento stagionale della malattia, caratterizzata dall insorgenza di casi in tarda estate e in autunno, quando le condizioni climatiche sono favorevoli all aumento della densità di vettori e della carica virale nell ambiente (Calistri et al., 2009; Fig. 1). Nel 2008 in 20 soggetti è stata osservata una remissione spontanea della sintomatologia fino a completa guarigione; 3 sono stati sottoposti ad eutanasia per la gravità del quadro clinico (tasso di letalità 13%). Anche nel 2009 la maggior parte dei soggetti è guarita dopo l infezione, 6 equidi sono deceduti (tasso di letalità 23%). FIGURA 1 - Andamento temporale dei casi (segnalati e confermati) in Emilia-Romagna nel biennio , sulla base della data di insorgenza della sintomatologia. 38 Considerazioni sulla sorveglianza passiva della West Nile Disease negli equidi. L esperienza dell Emilia-Romagna nel triennio

7 I sintomi osservati con maggior frequenza sono stati atassia (65%), depressione (61%) e tremori (45%), seguiti da alterazioni della postura (appoggio su base più ampia, 33%) e delle reazioni posturali e propriocettive (mancato riposizionamento dopo incrocio forzato degli arti, 31%). Sono risultate meno frequenti le alterazioni sensoriali e le alterazioni dei nervi cranici (Tab. 1). I sintomi rilevati in Emilia-Romagna sono stati confrontati con quelli manifestati dai cavalli in Toscana nel 1998 e con quelli rilevati in altri recenti focolai. In Toscana e in Emilia-Romagna, l atassia locomotoria è stata il sintomo osservato con maggior frequenza seguito dalla depressione; la febbre è stata osservata in entrambi i casi con una bassa frequenza (8%) mentre nei focolai registrati in Francia e negli Stati Uniti nel 2000 questo sintomo è stato riportato con frequenza più elevata (rispettivamente 62% e 23%). Il tasso di letalità registrato nel 2009 in Emilia-Romagna non risulta significativamente superiore rispetto a quello osservato l anno precedente (chiquadro=0,32; P>0,05) suggerendo che la patogeni- TABELLA 1 Frequenza dei sintomi rilevati nei casi clinici confermati di WND in cavalli in Emilia-Romagna 2008/2009. Sintomatologia Cavalli (N=49) % Sintomatologia Cavalli (N=49) % ALTERAZIONI DELLO STATO MENTALE ALTERAZIONI DEL MOVIMENTO Depressione 30 61% Paresi/Plegia Stupore 3 6% Monoparesi/plegia 0 0% Coma 0 0% Paraparesi/plegia 4 8% Tetraparesi/plegia 4 8% ALTERAZIONI DEL TEMPERAMENTO Emiparesi/plegia 2 4% Ipereccitabilità 14 29% Trascinamento dell arto/degli arti 14 29% Aggressività 1 2% Atassia locomotoria 32 65% Disorientamento 9 18% Ipermetria 3 6% Ipometria 5 10% ALTERAZIONI DELLA POSTURA Dismetrie degli arti 14 29% A carico della testa Cadute a terra improvvise 9 18% Emprostotono 12 24% Movimenti di maneggio 1 2% Deviazione laterale 5 10% Rotazione laterale 0 0% ALTERAZIONI SENSORIALI Opistotono 3 6% Disturbi visivi (non attribuibili a traumi) 3 6% Pleurototono 0 0% Prurito (non attribuibile ad ectoparassiti) 1 2% A carico degli arti Appoggio su base più ampia 16 33% ALTERAZIONE DEI NERVI CRANICI Appoggio su base più ridotta 4 8% Deficit della risposta alla minaccia 3 6% Movimenti anomali/involontari Deficit del riflesso palpebrale 3 6% Tremori 22 45% Paralisi del nervo facciale 2 4% Mioclonie 3 6% Strabismo 0 0% Digrignamento dei denti 5 10% Alterata deglutizione 3 6% Ptosi del labbro inferiore 4 8% ALTERAZIONI DELLE REAZIONI Paralisi della mandibola 0 0% POSTURALI E PROPRIOCETTIVE Dorsoflessione spontanea degli arti 6 12% ALTRO 12 24% Mancato riposizionamento dopo incrocio forzato 15 31% degli arti TABELLA 2 Principali siti web sulla WND. Centro Studi Malattie Esotiche (CESME) dell IZS di Teramo Centro Nazionale di Epidemiologia, Sorveglianza e Promozione della Salute (EpiCentro) dell ISS Centers for Disease control and Prevention (CDC) di Atlanta (USA) Facoltà di Medicina Veterinaria Università degli Studi di Bologna (video casi 2008) CEREV (Centro Emiliano Romagnolo di Epidemiologia Veterinaria) sezione West Nile id_pagina=736 Ippologia, Anno 23, n. 1, Marzo

8 cità virale verso la popolazione equina sia rimasta invariata nei due anni, come rilevato a livello nazionale anche da Monaco et al. (2011). I livelli di letalità osservati in Emilia-Romagna sono risultati comunque inferiori sia rispetto a quelli rilevati nel 2000 in Francia (tra il 34% e il 38%), sia rispetto ai livelli registrati in Toscana nel 1998 (43%) (Murgue et al., 2001; Ostlund et al., 2001). CONCLUSIONI Il ciclo di trasmissione del WNV è piuttosto complesso e non sono ancora del tutto chiari i fattori che possono determinare la comparsa di un epidemia. Tuttavia è possibile rilevare la circolazione virale sul territorio prima della comparsa di casi umani, mediante un sistema di sorveglianza multidisciplinare che contempli la sorveglianza entomologica, la sorveglianza attiva e passiva sull avifauna selvatica o l impiego di polli sentinella, il controllo sierologico e virologico di cavalli sentinella, la sorveglianza passiva sulla popolazione equina e, per quel che riguarda la Sanità Pubblica umana, la sorveglianza sulle sindromi neurologiche e sulle febbri estive (Angelini et al., 2010). In Emilia-Romagna i sintomi clinici osservati nei cavalli durante il periodo sono risultati variabili e aspecifici confermando l importanza di ricorrere a specifici test di laboratorio per giungere alla diagnosi. La sorveglianza passiva sugli equidi si è dimostrata comunque uno strumento efficace per rilevare precocemente la circolazione del WNV: nel 2008 il primo caso clinico di WND è stato rilevato alla fine di agosto, mentre l anno successivo la maggiore sensibilizzazione dei veterinari ha permesso di rilevare il primo caso a luglio, un mese in anticipo rispetto all anno precedente. La segnalazione di sintomi compatibili con la WND da parte dei veterinari liberi professionisti costituisce pertanto un punto essenziale del sistema di epidemiosorveglianza della West Nile Disease. Parole chiave West Nile Virus, Sorveglianza passiva, sindrome neurologica, cavallo. Remarks about West Nile Disease passive surveillance in horses. The experience of Emilia-Romagna Summary West Nile Disease (WND) has been considered in Italy a re-emerging zoonosis, due to West Nile Virus (WNV) appearance on national territory in summer of 2008, 10 years after the last epidemic outbreak in Tuscany. WNV cycle involves birds and mosquitoes, however several mammals, as humans and horses, can be infected showing influenza-like symptoms and sometimes severe meningoencephalitis. Main objective of veterinary surveillance is the early detection of WNV circulation, in order to manage specific preventive measures. One of the most effective tools for this purpose is the passive surveillance on horses (OM 5/11/2008). Data about WND confirmed cases in horses in Emilia-Romagna region between 2008 and 2010 were examined. Clinical features resulted variable and unspecific. More information and awareness of veterinary practitioners working in the equine field will make this surveillance system more effective for early detection of new cases in the region.the aim of this article is to make available to practitioners some diagnostic tools, useful to identify neurological syndrome and to report suspected cases of WND in horse. Key words West Nile Virus; passive surveillance, neurological syndrome, horse. 40 Considerazioni sulla sorveglianza passiva della West Nile Disease negli equidi. L esperienza dell Emilia-Romagna nel triennio

9 BIBLIOGRAFIA 1. Angelini P, Tamba M, Finarelli AC, Bellini R, Albieri A, Bonilauri P, Cavrini F, Dottori M, Gaibani P, Martini E, Mattivi A, Pierro AM, Rugna G, Sambri V, Squintani G, Macini P (2010) West Nile virus circulation in Emilia-Romagna, Italy: the integrated surveillance system 2009 Euro Surveill. 15(16). Available online: viewarticle.aspx?articleid= Autorino GL, Battisti A, Deubel V, Ferrari G, Forletta R, Giovanni A, Lelli R, Murri S, Scicluna MT (2002) West Nile Virus Epidemic in horses, Tuscany Region, Italy. Emerg. Infect. 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