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1 Ogni passaggio della procedura di purificazione determina la separazione delle proteine totali presenti nel campione in una serie di frazioni (frazionamento( frazionamento). Per ciascuna frazione è determinata la quantità di proteine totali e le unità di attività enzimatica della proteina di interesse. Una unità enzimatica (U) è definita come la quantità di enzima richiesta per convertire 1 µmol di substrato in prodotto in 1 min in condizioni definite (generalmente( 25 o 30 C, ad un valore di ph ottimale). RESA mg o U di proteina di interesse nella frazione mg o U di proteina di interesse nella preparazione originale Il grado di purezza di un enzima in una particolare frazione è espresso tramite l attività specifica,, la quale pone in relazione l attivitl attività enzimatica totale con il contenuto totale di proteine presenti nella preparazione. ATTIVITA SPECIFICA U di enzima di interesse nella frazione mg di proteine totali nella frazione

2 Nel corso di una purificazione ottimale la resa diminuisce e l attività specifica aumenta

3 proteine totali (mg) Enzima (mg) Resa % Purezza (%) U totali A s (U/mg) Omogenato % 10% stadio di purificazione % 50% stadio di purificazione % 92% stadio di purificazione % 99% Saggio colorimetrico Stima da SDS-PAGE Saggio di attività enzimatica Valore ipotetico proteina pura = 100 U/mg

4 La messa a punto di un procedimento sperimentale di purificazione e di una proteina richiede la possibilità di: 1. Identificare e quantizzare la proteina di interesse fra tutte le altre proteine del campione di partenza (gli ENZIMI possono essere identificati sulla base della reazione che essi catalizzano tramite un opportuno SAGGIO ENZIMATICO) 2. Misurare la quantità di proteine totali nel campione 3. Valutare la presenza di proteine contaminanti nel campione di interesse

5 Identificare e quantizzare la proteina di interesse fra tutte le altre proteine del campione di partenza E necessario disporre di un opportuno saggio che consenta di seguire la proteina durante i vari passaggi del procedimento ento di purificazione E importante che il saggio disponibile sia eseguibile rapidamente su molti campioni Il saggio deve indicare in maniera affidabile la quantità della proteina desiderata presente ai vari stadi di purificazione Inoltre il saggio deve essere eseguibile con una piccola quantità di campione proteico

6 Specifico Quantitativo Gruppo di enzimi che catalizzano l idrolisi l di monoesteri del fosfato FOSFATASI R-O-PO H 2 O R-O-H + HO-PO 2-3 NO 2 NO 2 FOSFATASI -PO H 2 O -H + HO-PO 2- O O 3 p-nitrofenil-fosfato p-nitrofenolo INCOLORE GIALLO

7 Le reazioni che richiedono nucleotidi piridinici sono molto usate nei metodi enzimatici di analisi. Tali coenzimi (NAD, NADH, NADP, NADPH) sono ideali perché sono usati stechiometricamente in un gran numero di reazioni di ossido-riduzione. Composto ridotto + NAD + Composto ossidato + NADH NAD+ (non assorbe a 340 nm) NADH (assorbe a 340 nm) Saggio enzimatico non specifico, dal momento che evidenzia tutti gli enzimi che usano come coenzima il NAD +.

8

9 proteine totali (mg) Enzima (mg) Resa % Purezza (%) U totali A s (U/mg) Omogenato % 10% stadio purificazione stadio purificazione stadio purificazione 1980 Saggio colorimetrico Stima da SDS-PAGE Saggio di attività enzimatica Valore ipotetico proteina pura = 100 U/mg

10 La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante all interno dei processi biologici.

11 Concetti basilari per lo studio del binding recettoriale I recettori sono presenti in concentrazioni molto piccole nei tessuti. Incubando il tessuto contenente i recettori R ed il ligando radiomarcato D in opportune condizioni sperimentali si formerà il complesso RD secondo l equazione R + D RD Quando il sistema raggiunge l equilibrio in ogni provetta avremo:

12 Radioligando Tessuto Tampone di incubazione Incubazione Equilibrio Ligando radiomarcato D Recettore RD Recettore libero R Il recettore libero R non potrà essere misurata ma possiamo misurare la quantità di complesso ligando-recettore RD.

13 Per poter calcolare la quantità del complesso RD è necessaria un operazione di separazione del legato (Bound) dalla quantità di ligando radiomarcato D libero in soluzione non legato al tessuto (Free). Equilibrio Separazione

14 Metodi di separazione del RD dal mezzo di reazione Filtrazione Il metodo più semplice e classico è quello della filtrazione su membrane in fibra di vetro Whatman GF/A, GF/B, GF/C dove varia la porosità 0.7 µm-2.7 µm Il tessuto contenente il recettore legato al radioligando aderisce al filtro mentre il radioligando libero passa attraverso la membrana.

15 [RL] = [R] [L] K K d = ([R tot ] - [RL]) [L] d [RL] K d = [R tot ] [L] - [RL] [L] [RL] K d + [RL] [L] = [R tot ] [L] [RL] (K d + [L] ) = [R tot ] [L] [RL] = [R tot ] [L] Kd + [L]

16 Bound (pmol/mg protein) Binding totale Binding non specifico Binding specifico [ 3 H]spiroperidolo, (nm) Le tre curve corrispondenti sono riportate in figura Visualizzando solo la curva del binding specifico possiamo individuare la K d e la Bound (pmol/mg protein) K d Bmax B max [ 3 H]spiroperidolo, (nm)

17 METODI DI Estrazione delle proteine

18 Compartimenti circoscritti da membrana Reticolo Endoplasmatico Nucleo Perossisoma Lisosoma Vescicola Mitocondrio Apparato Del Golgi Membrana plasmatica

19 Doppio strato (bilayer) lipidico Bilayer lipidico (5 nm) Molecole lipidiche Molecole proteiche

20 Le membrane biologiche sono composte di 1. Lipidi il doppio strato lipidico crea una barriera idrofobica Per la maggior parte fosfolipidi ma anche glicolipidi e colesterolo 2. Proteine conferiscono specificità alle funzioni svolte dalla membrana a. Proteine di membrana periferiche legate alla superficie della membrana b. Proteine di membrana integrali contengono domini idrofobici e idrofilici anfipatiche c. Glicoproteine (integrali) contengono molecole glucidiche recettori di superficie

21 Struttura dei Fosfolipidi gruppo di testa polare (idrofilico) testa code code non polari (idrofobiche) doppio legame cis

22 Ricostruzione di un bilayer lipidico + H 2 O

23 Tutte le membrane biologiche sono bilayers lipidici Le proteine conferiscono proprietà uniche a ciascun tipo di membrana

24 Classi di Proteine di Membrana periferiche ancorate superfice extracell. Superfice citosolica integrali ancorate

25 Come può un legame peptidico polare essere inserito nel core idrofobico di un bilayer fosfolipidico? estremità amino (N-) terminale estremità carbossi (C-) terminale

26 Le - eliche transmembrana tipicamente sono costituite da aminoacidi la maggior parte dei quali idrofobici. triptofano fenilalanina prolina isoleucina

27 3.6 residui/giro In una -elica i legami peptidici polari si trovano all interno e i gruppi R delle catene laterali protrudono all esterno

28 Glicoforina: tipica proteina che attraversa la membrana plasmatica una volta

29 Batteriorodopsina, tipica proteina che attraversa la membrana plasmatica sette volte

30 Associazione di proteine di membrana con un bilayer lipidico Integrali Periferche Transmembrana -elica foglietto- legate a lipidi attaccate a proteine SPAZIO EXTRACELLULARE Bilayer lipidico CITOSOL Legame covalente a molecola lipidica Legame debole, non-covalente, ad un altra proteina di membrana

31 Proteine di membrana Nelle cellule animali, il 50% della massa del plasmalemma sono proteine Le proteine di membrane hanno molte funzioni: Trasportatori Collegamento Recettori Enzimi SPAZIO EXTRACELLULARE CITOSOL Membrane differenti esprimono proteine differenti funzioni differenti

32 Tutte le membrane biologiche sono bilayers di fosfolipidi Le proteine in ciascun tipo di membrana le conferiscono proprietà uniche

33 DETERGENTI Si usano per solubilizzare proteine intrinseche di membrana Ionici: SDS, sodio deossicolato, CTAB e CHAPS Non ionici: Triton X-100 e Nonoident P-40

34 C o n d i z i o n i p e r l e s t r a z i o n e L estrazione se possibile va fatta a freddo, specialmente per i metodi meno delicati; talvolta puo essere necessario farla sotto azoto per ridurre l ossigeno in soluzione. L estrazione non va mai fatta a secco, usualmente si fa in tampone bassa G, ph neutro, con inibitori di proteasi, EDTA. Per proteine di membrana, aggiungere un detergente non ionico e non denaturante (es. Triton X100, Octyl-glucoside, Tween). Per proteine facilmente ossidabili, aggiungere DTT o b-me Per proteine molto delicate, aggiungere glicerolo fino al 50% Attenzione alle letture a 280 nm in caso di queste aggiunte.

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