SOPPRESSIONE DELL ALLOREATTIVITÀ IN VIVO ED IN VITRO IN UN MODELLO MURINO DI TRAPIANTO DI CUTE

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1 SOPPRESSIONE DELL ALLOREATTIVITÀ IN VIVO ED IN VITRO IN UN MODELLO MURINO DI TRAPIANTO DI CUTE A. Gaspari, C. Matteotti, E. Casabianca, J. Rademacher, R. Maccario, F. Locatelli, P. Dionigi, A. Zonta, M. Maestri CHIRURGIA SPERIMENTALE, SEZIONE DI CHIRURGIA GENERALE A, DIPARTIMENTO DI CHIRURGIA, UNIVERSITÀ DI PAVIA INTRODUZIONE La tolleranza è una proprietà fondamentale del sistema immunitario che sottolinea una non responsività selettiva verso self-autoantigeni. Nel caso specifico dei trapianti d organo, con il termine tolleranza viene indicata una condizione di equilibrio tra il sistema immunitario dell ospite e quello del donatore, rappresentato dalle cellule immunocompetenti presenti nel graft (1). Il nostro studio prevede di indagare i meccanismi coinvolti nei processi di adattamento al graft, focalizzando l attenzione sulle cellule responsabili dell induzione di tolleranza. Il blocco delle vie di costimolazione, CD28:B7 e CD40-CD40L, in presenza della massiccia esposizione agli antigeni del donatore DST sembra essere fondamentale nello sviluppo di uno stato di tolleranza stabile nel nostro modello sperimentale di trapianto di cute. È altresì possibile che il mantenimento di questo stato di tolleranza donatore-specifica sia almeno parzialmente dovuto alla induzione di cellule a funzione regolatoria che, se infuse in vivo sono in grado di trasferire questa proprietà e in vitro di sopprimere le reazioni di alloreattività. MATERIALI E METODI Nel corso di questo studio sono stati utilizzati topi BALB/c (H2 d ) quali riceventi di cute e splenociti da topi C57BL/6 (H2 b ), due ceppi murini fra loro incompatibili. Dal dorso di topi donatori C57BL/6 si è prelevato un lembo cutaneo circolare di circa 1 cm 2 ed il tessuto sottocutaneo è stato eliminato. Il frammento di cute così preparato è stato impiantato in un area corrispondente della regione dorsale dei topi riceventi BALB/c. Al termine dell intervento gli animali, ancora sedati, hanno ricevuto splenociti da topi donatori di cute DST alla concentrazione di 10 7 cellule/100 ml 101

2 PBS per via endovenosa e 200 ìg di anti-cd40l intraperitoneale. In seconda giornata postoperatoria è stata somministrata la proteina di fusione CTLA4Ig alla dose di 200 mg. Gli animali trapiantati sono stati sottoposti a controllo giornaliero per la valutazione precoce dell insorgenza del rigetto. Il termine del periodo di osservazione è stato posto alla rilevazione di una necrosi pari ad un area del 90% della cute trapiantata. Il trapianto è stato effettuato in condizioni di sterilità ed in anestesia generale. In 50 a giornata postoperatoria gli a- nimali il cui graft cutaneo non dava segni di rigetto sono stati considerati tolleranti, sacrificati, le milze raccolte ed omogenate. Gli splenociti così ottenuti sono stati in parte infusi in vivo ed in parte testati in vitro secondo lo schema di seguito riportato. a) topi BALB/c naï ve sono stati sottoposti a trapianto di cute da donatori C57BL/6. Al termine dell intervento, anzichè essere trattati con splenociti del donatore DST, hanno ricevuto in infusione EV la stessa concentrazione di splenociti (10 7 cellule/100 ml PBS) derivanti dalla milza dei topi tolleranti TMS, dello stesso ceppo cioè del ricevente. Gli animali trapiantati sono stati poi sottoposti a controllo giornaliero per la valutazione precoce dell insorgenza del rigetto. b) Sono state allestite colture cellulari per testare l alloreattività fra riceventi BALB/c e donatori C57BL/6 e l effetto dell addizione alla coltura di splenociti dei topi tolleranti. La proliferazione T -cellulare è stata misurata in una reazione leucocitaria mista unidirezionale (MLC) in piastre da 96-well, utilizzando 2x10 5 splenociti di BALB/c naï ve quali responders e 10 6 splenociti di C57BL/6 irradiati (2000 rad) quali stimulators in un volume finale di 200 ml. Alla coltura è stata aggiunta 3 HTdR (1 mci/well) in quinta giornata ed in sesta è stata misurata l incorporatzione di timidina tritiata, indice della proliferazione cellulare. Gli splenociti da topi tolleranti, testati quali possibili cellule anergizzanti, sono stati aggiunti nella MLC in rapporti di concentrazioni TMS:Responders decrescenti. In parallelo sono stati allestiti dei preparati utilizzati come gruppo di controllo. Topi BALB/c, che sono stati trapiantati di cute da donatori C57BL/6 senza ulteriori trattamenti e che hanno rigettato, sono stati sacrificati, le loro milze raccolte ed omogenate. Gli splenociti di questi topi di controllo (CS), sono stati in parte infusi in vivo, con le stesse modalità riportate per i TMS. I dati ottenuti nel corso di questo studio sono stati valutati impiegando il metodo di analisi della sopravvivenza per quanto riguarda gli skin grafts. Le differenze tra i gruppi sono state valutate applicando il Log-Rank test (valori di p<0.05 sono stati considerati significativi). La soppressione della proliferazione cellulare in vitro viene indicata come percentuale rispetto alla MLC basale considerata come 100% di alloreattività. 102

3 RISULTATI L associazione di CTLA4Ig, anti-cd40l e DST è risultata efficace nel prolungare la sopravvivenza delle cuti trapiantate fino alla 50 a giornata postoperatoria (N=4), termine fissato come end point dell osservazione e comunemente considerato limite temporale oltre il quale nel modello murino vi è sviluppo di tolleranza stabile. L infusione di splenociti da animali tolleranti TMS in topi singenici naive BALB/c trapiantati di cute da donatore C57BL/6 ha portato ad un prolungamento della sopravvivenza del graft (N=9; mediana 17 giorni) rispetto agli a- nimali trapiantati di sola cute (N=7; mediana 10 giorni) e rispetto agli animali trapiantati e trattati con splenociti del donatore DST (N=7; mediana 15 giorni). L infusione di splenociti da topi che hanno rigettato la cute trapiantata CS non porta ad un prolungamento significativo della sopravvivenza dei grafts cutanei (N=5; mediana 10 giorni). Dall analisi delle curve di sopravvivenza dei grafts è emersa una differenza statisticamente significativa fra i diversi gruppi di studio (p<0.01, Kaplan-Meier, multiple samples survival analysis), come si può osservare in figura 1. Figura 1 Curve di sopravvivenza dei grafts nei diversi gruppi di studio 103

4 In tabella I vengono riportate le sopravvivenze ottenute nei singoli esperimenti ed i risultati ottenuti dal confronto fra i singoli gruppi di studio (LogRank test, two samples survival analysis). In nessun caso però si è assistito allo sviluppo di tolleranza immunologica stabile e tutti i grafts cutanei sono stati rigettati. Rimane l ipotesi che nei topi resi tolleranti, mediante blocco delle vie di costimolazione B7-CD28 e CD40-CD40L ed infusione di splenociti del donatore, si inducano in vivo cellule capaci di sopprimere le risposte immunitarie donatore-specifiche. Per testare questa possibilità sono state allestite reazioni leucocitarie miste unidirezionali alle quali sono stati aggiunti splenociti da topi tolleranti TMS in rapporti di concentrazione decrescenti rispetto alle cellule responders. I risultati dei due esperimenti preliminari effettuati sono riportati in figura 2 ed espressi come percentuale di alloreattività residua rispetto ad una MLC basale. Da notare che l effetto di soppressione evidenziato non sembra essere particolarmente influenzato dal numero di cellule TMS aggiunto. Infatti anche a basse concentrazioni i TMS sono in grado di inibire fortemente la risposta immunitaria donatore-specifica. Tabella I Gruppi Trattamento Sopravvivenze grafts cutanei Log-Rank test (two samples survival analysis, p<0,05) 1 vs 2 p<0,01 1 Tp cute 9, 9, 10, 10, 11, 11, 11 1 vs 3 p<0,01 2 Tp cute + DST 12, 12, 17, 15, 15, 15, 15 1 vs 4 p=0,31 3 Tp cute + TMS 18, 18, 17, 15, 22, 23, 14, 17, 17 2 vs 3 p<0,01 4 Tp cute + CS 10, 10, 9, 13, 13 2 vs 4 p=0,02 3 vs 4 p=0,01 DISCUSSIONE Negli ultimi anni, lo sviluppo di nuovi protocolli e la scoperta di farmaci immunosoppressori progressivamente più efficaci hanno migliorato sensibilmente la riuscita dei trapianti d organo. Nonostante ciò, l uso di questi farmaci non è scevro di effetti collaterali e tossici; gli attuali schemi terapeutici sono ancora gravati da una significativa morbilità e morbilità (2). Alla base di molti studi in corso negli ultimi anni vi è la possibilità di interagire con le reazioni immunologiche che portano al rigetto d organo e di indurre uno stato di tolleranza stabile donatore-specifica, che mantenga cioè inalterata la capacità di risposta immune dell ospite verso antigeni non-self 104

5 Figura 2 - Soppressione dell alloreattività riscontrata nei singoli esperimenti di soppressione in vitro. (3-4). Il blocco delle vie costimolatorie e l infusione di antigeni del donatore sembrano essere i trattamenti che maggiormente favoriscono l instaurarsi di questo stato di non responsività (4-5). Il nostro studio ne è un ulteriore conferma; infatti gli animali trapiantati di cute e trattati con CTLA4Ig, anticd40l ed infusione di DST sviluppano uno stato di tolleranza al graft. Al momento attuale non si conoscono i meccanismi effettivi alla base dell induzione e del ma n- tenimento della tolleranza antigene-specifica; sono state proposte diverse ipotesi: delezione clonale, anergia e soppressione mediata da cellule regolatorie (l, 6). Col nostro studio, per quanto ancora preliminare, abbiamo cercato di far luce su queste ipotesi. A tal scopo riceventi di cute BALB/c da donatori C57BL/6 sono stati trattati con splenociti di topi tolleranti. In tutti i casi si è registrato un prolungamento della sopravvivenza dei grafts, anche se non si è raggiunto uno stato di tolleranza permanente. Questo risultato è di per sé importante in quanto 105

6 in primo luogo conferma pienamente l ipotesi che la tolleranza, o al limite l accomodazione, possa essere empiricamente ottenibile attraverso infusione di cellule immunocompetenti ed in secondo luogo dimostra l induzione di una popolazione cellulare con caratteristiche soppressorie nei topi resi tolleranti. Tale popolazione non è costituita da cellule del donatore bensì da cellule immunocompetenti dello stesso ceppo del ricevente di cute. Una volta infuse sembrerebbero in grado di indurre uno stato di tolleranza, seppure temporanea, negli animali trapiantati. Il mancato raggiungimento di tolleranza stabile potrebbe essere imputabile ad un progressivo esaurimento in circolo delle cellule soppressorie. Una conferma, ancora indiziaria, delle proprietà soppressorie di queste cellule viene dagli esperimenti effettuati in vitro. Se aggiunte ad una normale reazione leucocitaria mista unidirezionale fra cellule del ricevente BALB/c e del donatore C57BL/6 sono in grado di sopprimere l alloreattività anche a concentrazioni molto basse. Sono in corso studi per meglio definire le proprietà fenotipiche e funzionali delle cellule coinvolte nell inibizione selettiva delle reazioni donatorespecifiche. BIBLIOGRAFIA 1. Matzinger P. Tolerance, danger, and the extended family. Ann. Rev Immunol 1994;12: Cecka JM. The UN05 scientific renal transplant registry. In: Cecka JM, Terasaki PI, eds. Clinical transplants. Los Angeles: UCLA Tissue Typing Laboratory, 1996: Sayegh MH, Turka LA. The role of T cell costimulatory activation pathways in transplant rejection. New Engl J Med 1998; 338(25): Kirk AD, Harlan DM, Armstrong NN, et al. CTLA4-lg and anticd40 ligand prevent renal allograft rejection in primates. Proc Natl Acad Sci U S A 1997;94: Iwakoshi N N, Mordes JP, Markees TG, Phillips NE, Rossini AA, Greiner DL. Treatment of allograft recipient with donor-specific transfusion and anti-cd 154 antibody leads to deletion of alloreactivity CD8+ T cells and prolongs graft survival in CTLA4-dependent manner. J Immunol 2000; 164: Finkelman FI), Lees A, Bimbaum R, Gause WC and Morris SC. Dendritic cells can present antigen in vivo in a tolerogenic or immunogenic fashion. J. Immunol. 1996; 157: