Contaminazione Microbiologica e Metodi Rapidi
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- Dante Silvestri
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1 Contaminazione Microbiologica e Metodi Rapidi Presentazione Linea Guida Autori: Commissione Qualità AFI: Gruppo di Microbiologia di Roma Coordinatore: Francesco Antonetti
2 SCOPO DELLA LINEA GUIDA Scopo della presente LINEA GUIDA è di facilitare gli utenti all implementazione dei Metodi Rapidi in Microbiologia, conducendoli ad un buona conoscenza delle tecnologie e coadiuvandoli nella dimostrazione della loro equivalenza ai metodi tradizionali, che li renda accettabili dalle agenzie regolatorie. La guida ha inoltre lo scopo di descrivere le principali tecnologie riguardanti i RMM, dettagliando per ogni strumento o tecnologia la descrizione, il principio di funzionamento, le procedure operative, la validazione, i campi d applicazione ed i vantaggi e svantaggi.
3 INTRODUZIONE AI METODI RAPIDI IN MICROBIOLOGIA (RMM) Molte delle tecniche microbiologiche oggi in uso sono antiche e si basano principalmente sulla crescita di microrganismi su terreni di coltura (Metodi Tradizionali). Tali metodi prevedono la crescita di colonie, che si rendono stimabili non prima di 48 o 72 ore dalla semina, o l intorbidamento di terreni liquidi, generalmente non visibile prima di 5-7 giorni. Questo fa sì che con le tecniche tradizionali non si possano ottenere risposte, circa il grado d inquinamento di un prodotto, prima di 3 giorni per un controllo di carica batterica e di 5-7 giorni per un controllo rapido di sterilità.
4 INTRODUZIONE AI METODI RAPIDI IN MICROBIOLOGIA (RMM) Durante la preparazione di un principio attivo o di un prodotto finito esistono diversi stadi di processo che è necessario controllare per prevenire possibili inquinamenti che, se non evitati, danneggerebbero irrimediabilmente il prodotto o peggio minerebbero la sicurezza e salute dei pazienti utilizzatori. In molti casi, i vari stadi di processo sono consequenziali, richiedono tempi d esecuzione rapidi e quindi non è possibile fermare il processo per attendere la risposta di presenza/assenza o quantificazione di un eventuale inquinante batterico.
5 INTRODUZIONE AI METODI RAPIDI IN MICROBIOLOGIA (RMM) La possibile soluzione agli inconvenienti sopra descritti è quella di utilizzare gli RMM per la determinazione quantitativa e qualitativa dei microrganismi. Queste tecniche permettono di rilevare la presenza e consentono la quantificazione di microrganismi in tempi molto brevi, da real time ad alcune ore, in dipendenza dalla tecnica. L applicabilità di tali metodi copre i test più comunemente effettuati, quali test di carica batterica, test di sterilità, test dell efficacia dei batteriostatici, monitoraggio delle clean rooms, vari controlli ambientali incluso le acque di produzione e ricerca endotossine.
6 MICROBIOLOGICAL ASPECT OF THE BIOTECH PROCESS process 0.22 filtration C laim N on Sterile C laim Sterile Stop for release C L U SP C apture ID S D SP D S Filling D P Product is sterile N on sterile N on sterile product N on Ster Sterile Secure R educe tim e to release 14 days A ccelerate investigation E nvironnem ental M o nitoring E quipem ent cleaning (w ater rinsing) Secure Secure R aw m aterial (M edia in U SP, B uffer in D SP, W ater as com ponent for D P ) W ater L oop O fficial S terility U n official Sterility B ioburden : Pass / Failed (avoid release at risk) B ioburden for Investigation or rapid qualification after m aintenance
7 INTRODUZIONE AI METODI RAPIDI IN MICROBIOLOGIA (RMM) I metodi rapidi si avvalgono di diverse tecnologie quali la: Bioluminescenza Citometria a flusso Amplificazione di acidi nucleici Tecnologia ottica Colorimetria Rilevazione diretta della fluorescenza Identificazione fenotipica e genotipica
8 RMM e BIOLUMINESCENZA La bioluminescenza è un fenomeno che consente ad organismi viventi di emettere luce attraverso particolari reazioni enzimatiche, nel corso delle quali l'energia chimica è convertita in energia luminosa. La reazione avviene in presenza di uno specifico enzima, chiamato luciferasi, il substrato luciferina e la molecola ATP. L ATP è presente in tutte le cellule metabolicamente attive, sia di origine procariotica che eucariotica, ed è la molecola utilizzata dalle cellule per accumulare energia. La bioluminescenza è una tecnologia consolidata ed approvata e rappresenta un valido strumento analitico per la valutazione della contaminazione microbica in ambiente farmaceutico.
9 RMM e BIOLUMINESCENZA Il sistema Milliflex Rapid di Merck Millipore permette di effettuare una determinazione quantitativa di microrganismi vitali e colturabili, sia in campioni filtrabili sia in campioni non filtrabili, ma che possono essere resi solubili, sia in campioni ambientali (superfici o aria), purché prelevati con metodologie che consentano la successiva dispersione dei microrganismi in fase liquida. I risultati sono espressi in Unità Formanti Colonia (UFC). Il limite di rilevazione è pari a 1 UFC per volume filtrato. Tempi d analisi ridotti da 4 a 8 volte rispetto al metodo tradizionale. Il Rapid Microbiology System Pallchek di Pall consente di effettuare una determinazione qualitativa e quantitativa di microrganismi vitali, colturabili e non, in campioni filtrabili o solubilizzabili. Il sistema consente anche il monitoraggio degli ambienti e delle superfici, mediante l utilizzo di appositi sistemi di campionamento. I risultati sono espressi in Relative Light Units (RLU). Il limite di rilevazione è pari ad 1 UFC per campione. Test di sterilità in 48 ore
10 RMM e CITOMETRIA La CITOMETRIA A FLUSSO è una tecnica che permette la misurazione e la caratterizzazione di cellule vive sospese in mezzo fluido. Tali cellule sono state precedentemente marcate da un fluorocromo, che viene scelto in base alle caratteristiche fisiche e morfologiche della cellula. Il BactiFlow ALS è un sistema in grado di leggere, ad una determinata lunghezza d onda, la fluorescenza emessa dai microrganismi (e/o particelle). Tutto il procedimento viene diviso in 3 passaggi principali. Marcatura automatica e sequenziale delle cellule di microrganismi. Eccitazione laser. Analisi e discriminazione automatica del sistema. Numerazione carica batterica entro 20 minuti - Test di presenza/assenza entro 24 ore.
11 RMM e CITOMETRIA La CITOMETRIA A SCANSIONE LASER in fase solida (Solid Phase Citometry) permette la rilevazione e la conta di cellule vive quali microrganismi, lieviti, funghi e spore le quali vengono marcate e successivamente rilevate mediante scansione su membrana (fase solida). Il ChemScan RDI è un sistema con alto livello di sensibilità che permette il rilevamento diretto di singole cellule ed elimina la necessità della crescita e moltiplicazione cellulare. Il principio di funzionamento è basato sulla marcatura diretta di microrganismi vivi che vengono riconosciuti da una scansione laser ultrasensibile. è un sistema che permette il rilevamento e la conta di microrganismi nei prodotti filtrabili. Tutto il procedimento viene diviso in tre passaggi principali: - Filtrazione su membrana - Marcatura delle cellule - Scansione laser Risultato rapido in circa 3 ore
12 RMM e TECNOLOGIE DI AMPLIFICAZIONE ACIDI NUCLEICI (NAT) Comprendono reazioni a catena della polimerasi quantitativa (qpcr) o non (PCR); più recentemente è stata sviluppata la reazione di amplificazione mediata da trascrizione (TMA) con tecnologia di riduzione del background (BRT). Generalmente hanno come target il DNA genomico o in alcuni casi (i.e Micoplasmi) il DNA ribosomale (rdna) o l RNA ribosomale (rrna). Sono generalmente molto rapide (3-8 ore) e rappresentano quindi un attraente alternativa ai metodi basati sulla coltivazione e crescita dei microrganismi. CAMPI DI APPLICAZIONE nell industria Farmaceutica per la rilevazioni di Micoplasmi e altri microrganismi in: - Produzioni farmaceutiche (prodotti grezzi o finiti) - Acqua Purificata e WFI, monitoraggio ambientale - Verifica del Clean-in-Place (CIP) - Rilevazione e prevenzione di Biofilm, Colture Cellulari
13 RMM e TECNOLOGIE DI AMPLIFICAZIONE ACIDI NUCLEICI (NAT) LifeTechnologies MycoSEQ permette di evidenziare l eventuale contaminazione di Mycoplasmi. Il metodo si basa su una PCR in Real Time Risultato rapido (4-5 ore) MERCK_MILLIPORE MilliPROBE : un sistema per la rilevazione real-time di contaminanti nelle produzioni farmaceutiche basato su Amplificazione Real Time Mediata da Trascrizione (TMA) e Tecnologia di Riduzione del Background (BRT) Tempi d analisi ridotti fino a 4 ore. PALL GeneDisc : sistema basato su Real time qpcr, permette la determinazione e la quantificazione di Microrganismi Specifici eventualmente presenti nel campione Risultato rapido (7-8 ore)
14 RMM e TECNOLOGIA OTTICA La IMD-A (Istantaneous Microbial Detector of Air ) è una tecnologia ottica in grado di determinare simultaneamente la quantità e la dimensione delle particelle presenti in aria, permettendo inoltre di distinguere se ciascuna particella sia viable o nonviable, il tutto in tempo reale. Le cellule, batteriche o fungine, in forma vegetativa o sporale, non necessitano di marcatura, essendo discriminate quali unità viventi per eccitazione tramite raggi laser di metaboliti auto-fluorescenti (NADH e Riboflavina per forme vegetative, acido dipicolinico per le forme sporali). Air Path Laser Path
15 RMM e TECNOLOGIA OTTICA AzbilBiovigilant Inc. La metodologia del sistema IMD-A non si basa sulla crescita cellulare per effettuare una conta dei microrganismi, ma sfrutta i principi dell ottica e della fluorescenza, non richiedendo quindi la coltivazione degli stessi. La capacità dello strumento IMD-A nel fornire una rilevazione microbiologica istantanea permette: - un monitoraggio continuo ed una valutazione in tempo reale dell andamento della contaminazione nell ambiente produttivo farmaceutico; - di intraprendere azioni correttive in tempi rapidi per correggere eventuali fuori specifica; - di storicizzare i dati di contaminazione particellare e microbiologica dei punti critici; - di aumentare il livello qualitativo e di assicurazione di qualità del prodotto farmaceutico.
16 RMM e COLORIMETRIA La colorimetria è la disciplina che si occupa della standardizzazione della misura del colore attraverso lo studio dei modelli di colore. La colorimetria può essere applicata alla misurazione della produzione o del consumo di gas. La moltiplicazione degli organismi presenti in un ambiente limitato, fa in modo che, grazie al loro metabolismo ed al consumo di appropriati substrati di sviluppo, vengano prodotti metaboliti o scartati nutrienti specifici. Tra i vari cambiamenti che avvengono, la modifica della composizione gassosa dello spazio di testa può essere monitorata in colture chiuse misurando la produzione di gas (CO2) o il consumo di gas (O2).
17 RMM e COLORIMETRIA BioMérieux Bact/ALERT : sistema che ricerca in modo automatico e non distruttivo la presenza di microrganismi nel campione in analisi. La tecnologia utilizzata si basa sulla presenza di un sensore colorimetrico posto all interno del flacone di coltura BacT/ALERT. In caso di crescita batterica l aumento della concentrazione di CO2 disciolta nel brodo di coltura provoca una variazione del ph che viene rilevato dal sensore. Il Bact/ALERT è da considerarsi un metodo alternativo per effettuare la verifica della sterilità di un prodotto farmaceutico o biotecnologico, come indicato dalla EP 5.1.6, EP e USP <1223>. Tempi di conferma sterilità ridotti da 14 giorni a 7 giorni o meno.
18 RMM e RILEVAZIONE DIRETTA FLUORESCENZA La fluorescenza è la proprietà di assorbire radiazioni elettromagnetiche e di riemetterle nel visibile ad una lunghezza d onda più elevata. In campo farmaceutico sono stati di recente sviluppati sistemi innovativi basati sulla rilevazione diretta della fluorescenza per il monitoraggio rapido della contaminazione microbica. CAMPI DI APPLICAZIONE: per la rilevazioni di contaminazioni microbiologiche in materie prime, produzioni farmaceutiche (prodotti grezzi o finiti), in acqua Purificata e WFI, aria e superfici e bioreattori.
19 RMM e RILEVAZIONE DIRETTA FLUORESCENZA MERCK_MILLIPORE Milliflex Quantum : permette la rapida rilevazione ed enumerazione in unità formanti colonia (ufc) di batteri, lieviti e muffe presenti su campioni filtrabili. La rilevazione avviene dopo breve incubazione grazie alla marcatura fluorescente delle microcolonie presenti sulla membrana. Il sistema consente la successiva identificazione dei contaminanti. Risultati in 24/48 ore per analisi convenzionali RAPID MICRO BIOSYSTEMS Growth DirectTM : permette di contare colonie di microrganismi in fase di crescita su terreni nutritivi. La tecnologia permette di rilevare le colonie molte generazioni prima che diventino visibili all occhio umano attraverso una camera CCD sensibile all auto-fluorescenza emessa dai microrganismi. Il sistema consente la successiva identificazione dei contaminanti. Rileva la presenza di contaminanti in meno di 7 giorni per test sterilità.
20 RMM e METODI DI IDENTIFICAZIONE FENOTIPICA L identificazione fenotipica in microbiologia si basa sulle capacità dei singoli microrganismi di utilizzare per la crescita, o modificare, un substrato biochimico nel quale sono in sospensione a determinate concentrazioni. Ogni classe, famiglia e specie microbica presenta particolari reazioni biochimiche nei confronti di specifici substrati. L identificazione microbica si ottiene confrontando il profilo di reazione ottenuto per il microrganismo in esame con un profilo standard specie-specifico presente in database. CAMPI DI APPLICAZIONE: Le metodologie di identificazione fenotipica sono utilizzate prevalentemente a scopo diagnostico umano, per identificare i microrganismi di natura ambientale o per monitorare la flora contaminante i farmaci e la contaminazione delle aree destinate alla produzione farmaceutica.
21 RMM e METODI DI IDENTIFICAZIONE FENOTIPICA BIOLOG OMNILOG : Il sistema è in grado di utilizzare ed interpretare le diverse risposte dei microrganismi alla presenza di fonti energetiche (azoto e carbonio) al fine di produrre una identificazione o caratterizzazione. SPETROMETRIA DI MASSA MALDI-TOF: L analisi di cellule batteriche mediante MALDI-TOF consente di ottenere uno spettro di massa che rappresenta un fingerprint specifico specifico della specie batterica analizzata. Ricerche in banche dati dedicate consentano di identificare campioni incogniti in pochi minuti. Per 30 campioni risultati in 3 ore
22 RMM e METODI DI IDENTIFICAZIONE FENOTIPICA BIOMERIEUX VITEK2 : sistema altamente automatico che usando i reattivi VITEK 2 (chiamati per comodità Card) permette l identificazione biochimica di batteri e lieviti impiegando test di acidificazione/utilizzo dei carboidrati e test enzimatici prealiquotati in micropozzetti. Time to results ridotto dalle 2 alle 18 ore a seconda del parametro.
23 RMM e METODI DI IDENTIFICAZIONE GENOTIPICA Le tecniche di caratterizzazione genotipica si basano sulla determinazione di differenze presenti nel DNA cromosomico o in elementi genetici extra cromosomiali. L identificazione microbica si ottiene confrontando il profilo genetico con i profili presenti nei database. Le tecniche di amplificazione degli acidi nucleici si basano sulla reiterazione della polimerizzazione del DNA, che aumenta esponenzialmente un frammento di acido nucleico, utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR). CAMPI DI APPLICAZIONE: Le metodologie di identificazione genotipica sono utilizzate prevalentemente per identificare i microrganismi di natura ambientale o per monitorare la flora contaminante i farmaci e la contaminazione delle aree destinate alla produzione farmaceutica.
24 RMM e METODI DI IDENTIFICAZIONE GENOTIPICA Il BIOMERIEUX DIVERSILAB : è un sistema modulare basato su tecnologia molecolare che esegue la genotipizzazione automatica tramite REP PCR dei ceppi batterici, funghi e lieviti, a partire da colture pure. Risultati in 4 ore LIFETECHNOLOGIES MICROSEQ : è un sistema che amplifica porzioni del DNA batterico ribosomiale (16S per batteri e R2D per muffe e lieviti) e previa sequenziazione le confronta con una banca dati validata. Risultati in 2-6 ore
25 RMM e METODI DI IDENTIFICAZIONE GENOTIPICA RiboPrinter Microbial Characterization System (DuPont- Qualicon) consente di effettuare la tipizzazione genotipica degli isolati mediante un processo di ribotipizzazione automatizzata, altrimenti noto come 'riboprinting'. Si tratta di un'ulteriore evoluzione rispetto alle metodiche di ribotipizzazione manuale Risultati in 4-8 ore.
26 RMM e PIROGENI ED ENDOTOSSINE BATTERICHE I Pirogeni costituiscono un gruppo eterogeneo composto da contaminanti di origine microbica e non. Tra i pirogeni più noti vi sono le endotossine (LPS = Lipopolisaccaridi), prodotte da batteri gram-negativi, altre sostanze microbiche derivate da batteri gram-positivi come l'acido Lipoteicoico (LTA) e particelle derivate da lieviti e virus. I metodi utilizzati per la rilevazione dei pirogeni sono:
27 RMM e PIROGENI ED ENDOTOSSINE BATTERICHE PTS è un sistema portatile per la determinazione quantitativa delle endotossine batteriche direttamente sul punto di raccolta dei campioni. Si basa su metodo cinetico cromogenico. Il campione da analizzare viene miscelato con un reagente LAL/substrato e in presenza di endotossine si sviluppa un colore giallo. Un fotometro termostatato misura la reazione. La concentrazione di endotossine viene calcolata dallo strumento utilizzando una curva standard di riferimento (l entità del colore sviluppata dalla reazione è proporzionale alla concentrazione delle endotossine). Risultato rapido in circa 15 minuti.
28 RMM e PIROGENI ED ENDOTOSSINE BATTERICHE Cryoblut Incubation ELISA Test Pyrogen in solution Interleukin 1β (IL1-β) ELISA Test ELISA Reader Monocytes in cryoblut Monocyte Activation Test (MAT) è il terzo metodo ufficiale per la determinazione dei pirogeni. Il principio del metodo prevede la rilevazione della produzione di citochine rilasciate quale risposta immunitaria in presenza di sostanze pirogene. Nella procedura sono utilizzati monociti umani posti a contatto con il materiale da esaminare. La risposta anticorpale prevede la produzione di citochine in presenza di pirogeni. La rilevazione citochine avviene mediante metodica ELISA e la concentrazione di pirogeni viene calcolata utilizzando una curva standard di riferimento.
29 AUTORI FASCICOLO 1 METODI RAPIDI IN MICROBIOLOGIA (RMM): PARTE INTRODUTTIVA Roberto Alesci (MERCK MILLIPORE) Francesco Antonetti (CONSULENTE) Gilberto Dalmaso (A&lco INDUSTRIES) Marco Sanvito (PALL) FASCICOLO 2 BIOLUMINESCENZA Roberto Alesci (MERCK MILLIPORE) Paola Barzi (MERCK SERONO) Francesco Cenci (SANOFI) Andrea Conti (Sanofi) Alessio De Santis (PALL) Ornella Finocchiaro (MERCK SERONO) Valeria Giannelli (PFIZER) Marco Sanvito (PALL) Case Study 1 Alessio Fantuzzi (CHIESI) Case Study 2 Serenella Bruschi (ANGELINI) Annarita Zacchilli (ANGELINI) FASCICOLO 3 CITOMETRIA Filippo Trionfera (BSP) Monika Fadione (CORDEN PHARMA) Veronica Bracaglia Gaia Malpocher (A&lco INDUSTRIES) Case Study 1 Manuel Selvaggio (PFIZER) FASCICOLO 4 TECNOLOGIE DI AMPLIFICAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI (NAT) Roberto Alesci (MERCK MILLIPORE) Daniele Quaratino (MERCK MILLIPORE) Mauro Anglana (MERCK MILLIPORE) Emiliano Toso (MERCK SERONO) Federico Biella (LIFE TECHNOLOGIES) Marco Sanvito (PALL) FASCICOLO 5 TECNOLOGIA OTTICA Matteo Bisceglia (GSK) Elena Salsi (GSK) Manuela Bini (GLAXO) Case Study Gaia Malpocher (A&lco INDUSTRIES) FASCICOLO 6 COLORIMETRIA Annalisa Milanesi (BIOMERIEUX) Luciano Ninu (BIOMERIEUX) FASCICOLO 7 RILEVAZIONE DIRETTA DELLA FLUORESCENZA Mauro Anglana (MERCK MILLIPORE) Federico Biella (LIFE TECHNOLOGIES) Case Study Valentina Nunziati (MOLTENI) FASCICOLO 8 IDENTIFICAZIONE FENOTIPICA Veronica Bracaglia (Consulente) Monica Fadione (CORDEN PHARMA) Annalisa Milanesi (BIOMERIEUX) Patrizia Muscas (ELI-LILLY) Luciano Ninu (BIOMERIEUX) Cherubina Santoro (ELI-LILLY) Rosa Siciliano (CNR) Filippo Trionfera (BSP) Federico Biella (LIFE TECHNOLOGIES) Maria Fiorella Mazzeo (CNR) FASCICOLO 9 IDENTIFICAZIONE GENOTIPICA Federico Biella (LIFE TECHNOLOGIES) Veronica Bracaglia (Consulente) Monica Fadione (CORDEN PHARMA) Annalisa Milanesi (BIOMERIEUX) Patrizia Muscas (ELI-LILLY) Cherubina Santoro (ELI-LILLY) Luciano Ninu (BIOMERIEUX) FASCICOLO 10 I PIROGENI E LE ENDOTOSSINE BATTERICHE Andrea Di Vora (MERK MILLIPORE) Stefano Ceccanti (ABIOGEN) Filippo Trionfera (BSP) Massimiliano Frasca (BSP) Patrizia Battirossi (MSD) Bodo Holtkamp (MERK MILLIPORE) Gabriele Schmitz (MERK MILLIPORE)
30 RINGRAZIAMENTI Si ringrazia la Dott.sa Valeria Giannelli per la collaborazione nella revisione dei testi della Linea Guida e della presentazione.
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