29/04/2016. Genetica dei Procarioti - 9 BACTERIOPHAGES

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1 A.A Dipartimento di Scienze della Vita CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6) The modular and hierarchical composition of MGEs. Genetica dei Procarioti - 9 Prof. Laura Marri ricevimento: previo appuntamento telefonico o Anders Norman et al. Phil. Trans. R. Soc. B 2009;364: MGEs: segmenti di DNA codficanti enzimi o altre proteine che consentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilità intracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare) BACTERIOPHAGES Bacteriophages are viruses that infect prokaryotes. They can function as vehicles for the lateral transmission of genetic information, can genetically modify their host by insertion into the genome (prophages) and can carry genes that encode new functions or modify existing ones. 1

2 MGEs: segmenti di DNA codficanti enzimi o altre proteine che consentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilità intracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare) 2

3 TRASPOSONI discovered by Barbara McClintock in maize (1940's) Nobel Prize 1983 Elementi trasponibili Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito all altro del cromosoma sito donatore sito accettore Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ristrutturazione genomica, per la trasposizione non c è nessuna omologia tra le sequenze del sito donatore e accettore 1 2 Elementi IS Le IS sono unità autonome e codificano solo per le proteine necessarie alla propria trasposizione. Sono costituenti comuni di cromosomi e plasmidi IR Trasposasi IR IS1 Escherichia coli 3-12 Shigella {Serratia 2 IS2, IS3, IS4, IS5 IS elements are pieces of DNA that are thought of as jumping genes and usually encode only the transposase that catalyses the transposition event lunghezza media sequenze IS: bp lunghezza media IR: bp 3

4 Transposons are pieces of DNA that are thought of as JUMPING GENES as they can frequently change their chromosomal localization. Elementi trasponibili Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito all altro del cromosoma They usually encode the TRANSPOSASE that catalyses transposition event and can carry determinants for ANTIBIOTIC RESISTANCE and other properties. sito donatore sito accettore They are flanked by inverted repeat DNA sequences and have the capability to move within or between replicons. Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ristrutturazione genomica, per la trasposizione non c è omologia tra le sequenze del sito donatore e accettore Trasposoni complessi/composti 4

5 Il processo della trasposizione richiede 3 substrati di DNA: le due sequenze ripetute alle estremità il DNA bersaglio trasposasi hotspots ogni trasposasi riconosce SOLO le sequenze terminali del proprio trasposone sito bersaglio: sequenza priva di specificità GGGTTTCCAA C inserzione del trasposone A CCAAAGGTTT GATCA CTAGT sito bersaglio 3 -OH libero riempimento delle interruzioni GATCA CTAGT GATCA CTAGT G GGTTTCCAA C CCAAAGGTT GGTTTCCAA A CCAAAGGTT T ripetizioni dirette del sito bersaglio 5

6 Modalità di spostamento /Tn/ generazione excisive mechanism (cut-and-paste) es.: Tn5, Tn10 replicative mechanism es.: Tn3, batteriofago Mu Trasposizione NON replicativa Tn5, Tn10 6

7 Tn3, Mu Trasposizione replicativa transposase makes single-stranded breaks at the ends of the transposon (2) staggered double-stranded breaks are made in the target DNA (1) Trasposizone intermolecolare target DNA 3 -OH Tn the 3 ends of the transposon are ligated to the 5 ends of the target DNA (3) 5 -P transposase makes single-stranded breaks at the ends of the transposon staggered double-stranded breaks are made in the target DNA 7

8 the 3 ends of the transposon are ligated to the 5 ends of the target DNA 3 -OH 3 -OH Le estremità 3 -OH del ricevente fungono da innesco per la replicazione At this stage, a single DNA molecule called a cointegrate is present that represents the donor and target DNA separated by two copies of the transposon. Risoluzione dei cointegrati Resolution is catalyzed by a resolvase encoded by the transposon. RESOLVASI risolve co-integrati, riconosce e ricombina due sequenze res sulla stessa elica di DNA The result is one copy of the transposon in both the donor and the target DNA. 8

9 Risoluzione dei cointegrati Conjugative transposons Conjugative transposons are normally integrated into the chromosome. They can excise in a precise manner to be subsequently transferred to recipient cells by conjugation and they carry genes required for mating-pair formation and conjugative DNA metabolism that are related to plasmid-encoded conjugation systems Rappresentazione schematica di Tn916 Enterococcus faecalis bp ICE: integrative and conjugative elements Plasmids, phages or transposons? 9

10 Gli ICE sono normalmente integrati nel cromosoma della cellula ospite e sono replicati e trasmessi alle cellule figlie allo stato integrato come fossero regioni del cromosoma del batterico. In alcune condizioni gli ICE si possono staccare dal cromosoma batterico, formando un intermedio circolare. L intermedio circolare si replica ed un filamento viene trasferito alle cellula ricevente tramite coniugazione. I componenti del sistema di trasferimento sono codificati dall ICE. ICE, fiancheggiato da sequenze specifiche, attl e attr, è integrato nel cromosoma dell ospite in un sito specifico (attb) in corrispondenza del proprio sito attp. La ricombinazione sito specifica tra le sequenze attl e attr causa l escissione di ICE circolare una singola elica di ICE è trasferita in una cellula ICE-free tramite il meccanismo del cerchio rotante la DNA polimerasi del ricevente ricostituisce la doppia elica ricombinazione sito specifica tra i siti attp di ICE e attb del cromosoma ricevente. in verità. Key characteristics of experimentally described ICEs ICEs have complex regulatory networks to control integration, excision and transfer 10

11 Plasmids, phages or transposons? The great diversity among ICEs for each functional module suggests that ICEs are unlikely to share one common ancestor. Instead, it seems more likely that different ICE groups arose independently. Vibrio cholerae I geni essenziali sono distribuiti su due cromosomi replicazione, divisione cellulare, trascrizione, traduzione, biogenesi dell involucro, loci associati con la virulenza VPI: Vibrio pathogenicity island CTX: cholera-toxin phage trasporto di zuccheri, ioni metallici e anioni, metabolismo degli zuccheri e la produzione di energia, sistemi a due componenti per la trasduzione del segnale, riparazione del DNA, proteine ribosomali "gene capture system" Gli integroni non sono elementi mobili di per sé come le sequenze IS o i Tn ma sono associati ad elementi trasponibili o a plasmidi coniugativi che li possono veicolare all interno della stessa specie o tra specie diverse. Struttura degli integroni Gene cassette sono caratterizzati da: Integrase Integration site Sulfonamide resistance un gene (inti)che codifica per l integrasi; Promotor una sequenza specifica (atti) utilizzata per l integrazione integrasimediata; Aminoglycoside resistance un promotore orientato verso l esterno che permette l espressione del gene integrato. INTEGRASI Riconosce due sequenze di DNA su due diverse eliche e media la ricombinazione tra loro (ricombinazione sito specifica) 11

12 recombination site: 59 bp located downstream of a promoterless resistance gene Le cassette geniche: generalmente contengono un singolo gene fiancheggiato da sequenze specifiche di DNA riconosciute dall integrasi; geni «promoterless» che non si esprimono finchè non vengono integrati nell integrone e possono essere trascritti dal promotore dell integrone GENOMIC ISLANDS Genomic islands are large chromosomal regions that are part of the flexible gene pool. They represent DNA regions that have been previously transferred by other mobile genetic elements and are present in certain bacteria but are absent in most closely related variants. They carry one or more genes that can increase the adaptability and versatility of the bacterium. They contain mobility genes coding for integrases or transposases that are required for chromosomal integration and excision. Le isole genomiche che hanno in qualche modo aumentato l adattabilità dell organismo ricevente sono dette isole di fitness ISOLE ECOLOGICHE (ecological islands, ECI): codificano per enzimi degradativi e/o resistenza agli antibiotici ISOLE DI SAPROFITISMO (saprophytic islands, SAI): codificano per adesine e sistemi di cattura del rame ISOLE DI SIMBIOSI (symbiosis islands, SYI): codificano enzimi per la fissazione dell azoto ISOLE DI PATOGENICITÀ (pathogenicity islands, PAI): codificano per fattori di virulenza 12

13 General characteristics of genomic islands (GEIs) Kb, GC General features of GEIs. GEIs are relatively large segments of DNA whose nucleotide characteristics often differ from the rest of the chromosome. int: integrase gene abc, def, ghi: genes encoding specific functions IS: insertion sequence element Mario Juhas et al. FEMS Microbiol Rev 2009;33:

14 Various functions encoded by GEIs of the same family. Fattori di virulenza codificati dalle PAI sistemi di secrezione interferenza con il sistema immune adesività e colonizzazione modulatori di funzioni della cellula ospite internalizzazione sopravvivenza/moltiplicazione intracellulare sottrazione di nutrienti ( es: ferro) Mario Juhas et al. FEMS Microbiol Rev 2009;33:

15 IslandViewer 3 results page for Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. L inversione di segmenti di DNA mediante ricombinazione sitospecifica è usata nel controllo dell espressione genica Esempio: - Salmonella: proteine flagellari H1, H2 Bhavjinder K. Dhillon et al. Nucl. Acids Res. 2015;43:W104-W108 The Hin invertase binds to the 14 bp inverted repeat sequences and flips the fragment. IRL IRR IRR IRL FASE 1 FASE 2 frequency of switching: 10-4 /generation 15

16 PLASTICITÀ GENOMICA FASE 2 Trasferimento genico orizzontale (HGT) Ricombinazione omologa Ricombinazione non omologa - ricombinazione sito-specifica FASE 1 16

17 The dynamic view of the prokaryotic world 17