Acetobacter Gluconobacter Gluconacetobacter Asaia

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1 BATTERI ACETICI Gruppo di batteri molto diffusi in natura, crescono su mezzi zuccherini e alcolici (vino, birra, sidro); Familia Acetobacteriaceae -> 13 generi Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter, Acidomonas, Asaia, Kozakia, Swaminathania, Saccharibacter, Neoasaia, Granulibacter, Commensalibacter, Tanticharoenia, Ameyamaea gram negativi, non sporigeni, talvolta mobili per ciglia e flagelli aerobi obbligati, metabolismo respiratorio, sviluppano sulla superficie dei mezzi sulle uve possono essere associati a marciume acido instaurano simbiosi con insetti -> tab. 1 e fig. 1 utilizzazione degli zuccheri mediante via degli esosi monofosfati (assenti o parzialmente presenti enzimi della glicolisi) producono sostanze inibitrici dei lieviti interesse enologico principalmente Acetobacter e Gluconobacter: entrambi hanno la capacità di ossidare l etanolo in acido acetico, ma in Acetobacter l ossidazione degli acidi organici acetico e lattico prosegue fino ad anidride carbonica e acqua

2 Da Crotti et al., 2010, AEM

3 Scaphoideus titanus, vettore flavescenza dorata Da Crotti et al., 2010, AEM

4 Acetobacter (A. aceti, A. pasteurianus) A. cellule bastoncellari 0,7 x 2,0 µm, talvolta pleiomorfe mobili (flagelli peritrichi) o non mobili ph 5,4-6,3; T ottimale 30 C ossidano acido lattico e acetico fino a CO 2 ossidazione di ETOH ad ac. acetico (princ.) presente ciclo di Krebs; maggior affinità per ETOH che per glucosio maggiore tolleranza all ETOH si ritrovano principalmente nei vini

5 Gluconobacter (G. oxydans) cellule ellittiche/bastoncellari, singole o catenelle 0,5-0,8 x 0,9-4,2 µm mobili (flagelli polari) o non mobili ph 5,5-6,0; T ottimale C non ossidano acido lattico e acetico fino a CO 2 ossidazione degli zuccheri a composti chetonici (princ.) D-gluconico - ac. 5-, 2-, 2,5 (di-) chetogluconico maggior affinità per glucosio che per ETOH minore tolleranza all ETOH si ritrovano principalmente nei mosti e sulle uve (10 2 in uve sane, uve in cattivo stato)

6 I BATTERI ACETICI IN LABORATORIO

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10 FERMENTAZIONE MALOLATTICA (FML) substrato acido L-malico COOH CHOH CH 2 COOH prodotto acido L-lattico + CO 2 COOH O CHOH C CH O 3 ENZIMA MALOLATTICO - MLE codificato dal gene mle Via metabolica identificata già da Möslinger > acido lattico ottenuto da acido malico in concomitanza con la fermentazione di carboidrati Diminuzione di acidità Attività batterica, a carico di LAB - Lactic Acid Bacteria definiti Batteri Malolattici (MLB - malolactic bacteria)

11 CENNI STORICI FML PASTEUR RILEVA LA PRESENZA DI BATTERI NEL VINO MALATTIE DEL VINO PERDITA DI ACIDITÀ MÜLLER-THURGAU (1981) NON DOVUTA A LIEVITI TENTATIVI DI CONTROLLARLA ALFRED KOCH (1900) 1 ISOLAMENTO DI BATTERI MALOLATTICI (BML) INOCULO CORRELAZIONE CON ACIDO MALICO BATTERI RESPONSABILI (AC. SALICILICO) W. T. SEIFERT (1901) Micrococcus malolacticus H. MULLER-THURGAU E A. OSTERWALDER (1913) CHIAVE TASSONOMICA BATTERI NON-AGENTI DI MALATTIE IN VINI E BEVANDE

12 LAB - LACTIC ACID BACTERIA SCHEDA MICROBIOLOGICA BATTERI GRAM POSITIVI, NON SPORIGENI, IMMOBILI, DI FORMA COCCICA O BASTONCELLARE, INCAPACI DI RESPIRARE, PRODUTTORI DI ACIDO LATTICO Microganismi fortemente adattati al particolare ambiente dove si sviluppano, spesso ricco in nutrienti e fonti di energia, scarsamente ossigenato Esigenze nutritive complesse Crescita lenta Assenza di ciclo di Krebs Assenza di sistemi di trasporto di elettroni Sistemi di trasporto molto efficenti Efficace sistema fermentativo dei carboidrati Fosforilazione a livello del substrato

13 METABOLISMO LAB Aldolase GLYCERALDEHYDE-3-P GLUCOSE GLUCOSE-6-P FRUCTOSE-6-P FRUCTOSE-1,6-DP 2 1,3 DIPHOSPHOGLYCERATE 2 3 PHOSPHOGLYCERATE 2 2 PHOSPHOGLYCERATE 2 2 PHOSPHOENOLPYRUVATE 2 2 PYIRUVATE DIHYDROXY- ACETONE-P GLYCERALDEHYDE-3-P GLUCOSE GLUCOSE-6-P 6-PHOSPHO-GLUCONATE RIBULOSE-5-PHOSPHATE XYLULOSE-5-PHOSPHATE 1 1,3 DIPHOSPHOGLYCERATE 1 3 PHOSPHOGLYCERATE 1 2 PHOSPHOGLYCERATE 1 2 PHOSPHOENOLPYRUVATE 1 2 PYIRUVATE Phosphoketolase ACETYL-PHOSPHATE ACETYL-CoA ACETALDEHYDE ETHANOL 2 LACTATE FERMENTAZIONE OMOLATTICA EMP - VIA DI EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS MOLTI LAB LACTATE FERMENTAZIONE ETEROLATTICA VIA DEL 6-PHOSPHOGLUCONATE/PHOSPHOKETOLASE 6-PG/PK NO Leuconostoc NO Oenococcus NO Weisella NO Lactobacillus Gruppo III

14 BATTERI LATTICI PRESENTI NEL VINO Pediococcus (P. cerevisiae) cocchi omolattici Lactobacillus L. plantarum, L. casei bacilli omolattici L. hilgardii, fructovorans, bacilli eterolattici L. brevis, L. buchneri, L. viridescens L. delbrueckii Oenococcus oeni cocchi eterolattici # buona tolleranza alcol # buona tolleranza SO 2 # resistenza a ph acidi

15 VIE DEGRADATIVE DELL ACIDO MALICO I MDH - Malico deidrogenasi acido malico acido ossalacetico acido piruvico acido lattico II EM - Enzima malico acido malico acido piruvico acido lattico III EML - Enzima malolattico acido malico acido lattico L attività degradativa prevalente nel vino è a carico dell enzima malolattico (malolactic enzyme), codificato dal gene mle riduzione dell acidità modificazioni organolettiche GUSTO aumento del corpo persistenza del gusto AROMA stabilità biologica riduzione erbaceo conservazione fruttato

16 GRUPPI METABOLICI - LAB I GRUPPO omofermentanti obbligati -> FDP aldolasi costitutiva; no chetolasi Lactobacillus gruppo I (L. delbrueckii e L. acidophilus; crescita a 45 C: no a 15 C) II GRUPPO eterofermentanti obbligati -> chetolasi costitutiva; no FDP aldolasi Leuconostoc, Oenococcus,, Weisella, Lactobacillus gruppo III (L. fermentum, L. brevis e L. keferi; da glucosio -> ac. lattico, CO 2 ed etanolo) III GRUPPO eterofermentanti facoltativi -> FDP aldolasi costitutiva Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Enterococcus, Lactobacillus gruppo II (L. casei, L. plantarum, si crescita a 15 C, talvolta a 45 C, in aerobiosi -> acetato e altri prodotti)

17 VIE DI UTILIZZO ALTERNATIVE DEL PIRUVATO 1. Diacetil sintasi 2. Acetolattato sintasi 3. Piruvato formiato liasi 4. Piruvato deidrogenasi 5. Piruvato ossidasi 6. Acetato chinasi anaerobiosi carenze del substato vie alternative di utilizzo del piruvato, a seconda delle specie e delle condiizioni ambientali specie diverse utilizzano vie diverse anche in funzione delle condizioni ambientali Es. PIRUVATO FORMIATO LIASI: in risposta a condizioni di anaerobiosi e carenze del substrato la piruvato formiato liasi porta alla formazione di acido formico e Acetil CoA; Acetil Coa può fungere da accettore di elettroni e portare alla formazione di etanolo o essere utilizzato per una fosforilazione a livello del substato liberando ATP e acetato

18 FERMENTAZIONE MALOLATTICA (FML) substrato acido L-malico COOH CHOH CH 2 COOH prodotto acido L-lattico + CO 2 COOH O CHOH C CH O 3 ENZIMA MALOLATTICO - MLE Acido malico, da Malum = dal latino melo, è il principale acido organico della frutta e dell uva (con ac. tartarico), sintetizzato da glucosio via acido piruvico Viene convertito in acido lattico mediante la FML, operata da BML mediante MLE; FML anche in sidro, altri vini di frutta, salsa di soia, crauti Tutti i BML del vino sembrano utilizzare la via dell enzima MLE, senza composti intermedi liberi e con produzione di energia legando il trasporto e la decarbossilazione dell ac. malico ad un gradiente protonico attraverso la membrana

19 FML libera energia a seguito del trasporto elettrogenico del malato, dell enzima ML e del flusso di ac. lattico. L energia può essere utilizzata per trasporto o convertita in ATP da ATPasi di membrana Il malato entra per trasporto attivo che richiede energia e viene decarbossilato da MLE intracellulare; ac. lattico + CO 2 lasciano la cellula No trasporto attivo del lattato ma presenti meccanismi che favoriscono lo scambio malato/lattato Temperatura ottimale per attività MLE su ac. malico C; T ottimale per crescita O. oeni 25 C Non si libera carbonio per attività di sintesi -> zuccheri necessari, attenzione particolare in caso d inoculo dopo FA

20 Glucosio e fruttosio, principali zuccheri dell uva, sono utilizzati da molti LAB Esistono ceppi di O. oeni che fermentano solo glucosio e molto lentamente Possono essere utilizzati altri zuccheri quali ribosio, arabinosio, xilosio, mannosio e galattosio, nella norma sono utilizzati glucosio e fruttosio BML Malato -> Lattato, ma anche Citrato-> Piruvato, Lattato, Acetato, Etanolo e Diacetile Diacetile -> aroma burroso, se in eccesso aroma di burro rancido ; quantità in funzione della quantità di citrato, potenziale redox e SO 2

21 FML: ASPETTI POSITIVI E NEGATIVI A seconda del tipo di vino, locazione del vigneto, del metodo di produzione FML desiderata FML indesiderata BML incoraggiati BML ostacolati aumenta il corpo, la persistenza degli aromi, la morbidezza, la rotondità in funzione del ceppo, riduce aromi vegetale, erbaceo in presenza di concentrazioni elevate di diacetile, può essere proseguita fino al raggiungimento di livelli accettabili la versatilità metabolica dei LAB può creare problemi la fermentazione di quantità eccessive di fruttosio da parte di batteri eterolattici può portare ad eccessi di ac. acetico e mannitolo (favorisce la crescita di lattobacilli indesiderati perché agenti di difetti, es. L. plantarum) produzione di citrullina, dal metabolismo dell arginina, che favorisce L. buchneri e L. brevis

22 meno diffusa nei vini bianchi: SI champagne, vini secchi corposi, Chardonnay - NO vini delicati, Riesling Regioni fredde ( Canada, New Zealand) -> acidità elevata (ac.malico) Regione dello Champagne francese -> vini base acidi (ph <3) FML -> biodisacidificazione -> vini più equilibrati Vini bianchi della regione di Minho - nord Portogallo Vini molto acidi per pratiche di viticoltura tradizionali Vinho verde! Considerata OBBLIGATORIA SCONSIGLIATA in vini con bassa acidità, una ulteriore riduzione può diminuire la qualità; se utile per altri motivi, l acidità può essere corretta con ac. tartarico, talvolta citrico

23 Esempio di dati analitici in relazione allo svolgimento della FML