Screening neonatale delle immunodeficienze congenite: stato attuale e prospettive

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1 Ottobre-Dicembre 2013 Vol. 43 N. 172 Pp immunologia pediatrica Screening delle immunodeficienze congenite: stato attuale e prospettive Chiara Azzari 1,2, Roberta Cupone 1,2, Elisa Giocaliere 3,4, Clementina Canessa 1,2, Francesca Lippi 1,2, Giancarlo la Marca 3,4 1 Divisione di Immunologia e Allergia, Ospedale pediatrico universitario Anna Meyer, Firenze 2 Dipartimento di Scienze della Salute, Università di Firenze 3 Laboratorio di Screening, Biochimica e Farmacologia, Unità e laboratorio di Neurologia pediatrica, Dipartimento di Neuroscienze, Ospedale pediatrico universitario Anna Meyer, Firenze 4 Dipartimento di Neuroscienze, Psicologia, Farmacologia e Salute del Bambino, Università di Firenze Riassunto Gli screening neonatali sono procedure diagnostiche che hanno come scopo quello di evidenziare patologie in fase presintomatica, con notevoli vantaggi sia per il paziente (in termini di salute), che per la società (in termini di risparmi di risorse). In molti paesi viene effettuato screening per numerosi errori congeniti del metabolismo (ECM); in alcuni di essi, con l impiego della spettrometria di massa (MS), si può ottenere la diagnosi di oltre 40 ECM fra difetti della beta-ossidazione degli acidi grassi, amminoacidopatie, acidurie organiche e difetti del ciclo dell urea. Nel 2010 il Secretary s Advisory Committee for Heritable Disorders in Newborns and Children (ACHDNC) ha raccomandato l estensione dello screening anche alle immunodeficienze severe combinate (SCID). È noto, infatti, che il bambino con immunodeficienza congenita nasce sano, ma va rapidamente incontro a gravi infezioni che possono portare a danni permanenti o addirittura alla morte. Una diagnosi precoce ottenuta mediante screening consente di ottenere il massimo risultato terapeutico. Summary Neonatal screenings are diagnostic procedures made to identify pre-symptomatic diseases. Such procedures lead to benefits in terms of both health for the patient and resources for society. Several countries have adopted neonatal screenings for many congenital metabolic diseases (CMD), often using tandem mass spectrometry (MS). This allows the diagnosis of over 40 different CMD such as defects of fatty acid beta-oxidation, amino acids and urea cicle disorders. In 2010 the Secretary s Advisory Committee for Heritable Disorders in Newborns and Children (ACHDNC) recommended to extend the use of neonatal screenings to detect Severe Combined Immunodeficiencies (SCID). It s a known fact that immunodeficient babies are born healthy and later suffer severe infections which can lead to permanent damages or even death. Early diagnosis through newborn screening would allow to perform the most effective treatment. Parole chiave: immunodeficienze severe combinate, screening, TRECs; KRECs; Spettrometria di massa Key words: severe combined immunodeficiency, neonatal screening, TRECs; KRECs, tandem mass spettrometry Metodologia della ricerca bibliografica La ricerca degli articoli rilevanti lo Screening Neonatale delle Immunodeficienze Severe Combinate è stata effettuata sulla banca bibliografica Medline, utilizzando come motore di ricerca Pubmed e come parole chiave: Neonatal Screening, SCID, Tandem mass, TREC, KREC, RT-PCR. Le immunodeficienze severe combinate (SCID) Le SCID sono condizioni cliniche ereditarie che si manifestano con un grave deficit del sistema immunitario, ad esordio nella maggior parte dei casi precoce nei primi mesi dopo la nascita e decorso invariabilmente fatale, se non trattate, solitamente entro i primi due anni di vita. I neonati affetti da SCID sono perfettamente sani alla nascita, ma precocemente si ammalano di gravi infezioni a causa del difetto numerico o funzionale dei linfociti T e/o B. È prioritario, dunque, riconoscere le SCID prima che esse si manifestino con gravi o fatali episodi infettivi, in modo da poter intervenire tempestivamente. Perché lo screening? Non tutte le patologie possono essere sottoposte a screening. Perché ciò possa avvenire e sia vantaggioso per la comunità e per il paziente è infatti necessario che la patologia suddetta abbia un elevato tasso di morbilità e mortalità e un incidenza notevole nella popolazione, che venga individuato un marcatore altamente specifico per la patologia stessa e che sia disponibile una terapia in grado di modificarne il decorso clinico dopo aver effettuato la diagnosi precoce. Le SCID, pur essendo comunemente considerate patologie rare, in realtà rispondono a questi requisiti. Diversi studi in letteratura hanno, infatti, dimostrato come il trattamento precoce delle SCID possa favorevolmente modificarne l andamento altrimenti fatale: un trapianto di midollo osseo o di cellule staminali, effettuati nel corso dei primi 3,5 mesi di vita del paziente con SCID, ossia prima che possa sviluppare infezioni gravi, garantisce un tasso di sopravvivenza intorno al 95%. Di contro, per quei pazienti sottoposti a trapianto più tardivamente, il tasso di sopravvivenza scende al 60-70% (Buckley, 2004; Gaspar et al., 2004; Puck, 2007). In merito all incidenza 208

2 Screening delle immunodeficienze congenite: stato attuale e prospettive nella popolazione, va precisato che le SCID sono patologie la cui reale frequenza è probabilmente sottostimata a seguito della mancanza di un metodo diagnostico valido che ne permettesse, negli anni passati, l identificazione. Non è inverosimile che un numero imprecisato di piccoli pazienti deceduti precocemente a seguito di infezioni gravi fosse affetto da SCID non diagnosticata. Un calcolo approssimativo dell incidenza cumulativa di SCID nella popolazione si aggira intorno ad 1 caso su nuovi nati (Backer et al., 2009). Si rende necessaria, pertanto, una metodica di screening dal basso costo e che possa indagare la presenza di diverse patologie causa di immunodeficienza severa utilizzando un unico test. I primi tentativi di screening Uno dei primi metodi proposti nel tentativo di identificare precocemente un immunodeficienza in tutti i nuovi nati era rappresentato dall esecuzione di un emocromo. Sebbene si tratti di un esame dal costo contenuto e che non richiede una specifica formazione del personale, esso non si è dimostrato sufficientemente sensibile e specifico nell identificazione delle SCID. In molte SCID non è presente alla nascita la linfopenia che sarebbe individuabile con l emocromo e, di contro, la presenza di una linfopenia non è necessariamente sinonimo di SCID. Uno studio effettuato da Lipstein et al. ha tentato di individuare il cut-off del valore di globuli bianchi (GB) che potesse garantire una sufficiente sensibilità e specificità del test: considerando un cut-off di 2800 GB/mm 3, l emocromo avrebbe una sensibilità dell 86% e una specificità del 94% nell individuare una SCID; alzando il cut-off a 5000 GB/mm 3 la sensibilità salirebbe al 100%, con una specificità di appena il 56% e, dunque, un alto numero di falsi positivi (Lipstein et al., 2010). Inoltre, effettuare un prelievo venoso in tutti i nuovi nati rappresenterebbe una procedura non routinaria. Un ulteriore tentativo di screening delle SCID, anch esso di difficile attuazione, è dato dal dosaggio di IL-7 su spot (DBS), dal momento che tale citochina è normalmente elevata nei pazienti con basso numero di linfociti T. La metodica necessita però di ulteriore conferma con altri test più specifici e, pertanto, raggiungerebbe costi troppo elevati. T cell receptor excision circles (TREC) Figura 1. Rappresentazione schematica della produzione dei TREC durante la ricombinazione VDJ. Il recettore VDJ del linfocita T si forma mediante l unione di un tratto V, un tratto D e un tratto J. Il DNA umano contiene numerosi tratti V (V1,V2,V3..), numerosi D e numerosi J. Tra tutti quelli contenuti nel genoma umano, soltanto un V, un D e un J vengono casualmente selezionati a formare il recettore. Il DNA eccedente (quello che conteneva i tratti genomici codificanti per tutti gli altri V, D e J non selezionati) viene espulso e va a formare dei piccoli frammenti di DNA circolare, detti appunto T cell receptor excision circles (il cui acronimo è TREC). Negli USA è stato messo a punto e validato un metodo basato su una tecnica di amplificazione genica capace di effettuare un dosaggio quantitativo dei T-cell receptor excision circles (TREC), piccoli frammenti di DNA normalmente prodotti da cellule T nel timo durante la differenziazione del T cell receptor (Chan et al., 2005; Hazenberg et al., 2001). Durante questa maturazione, tutto il DNA relativo ai loci V, D e J non utilizzato, viene fisiologicamente espulso. Questo fenomeno, che viene definito ricombinazione, dà luogo alla formazione, nelle cellule T, di un prodotto finito, che è il TCR (con i suoi segmenti VDJ), e ad una grande quantità di DNA avanzato che resta nella cellula. I frammenti di DNA che vengono generati durante la maturazione dei linfociti T e la formazione del recettore specifico TCR, si aggregano a costituire strutture circolari definite TREC (Fig. 1). I TREC non si moltiplicano durante la divisione cellulare cosicché un dosaggio quantitativo di questi elementi dà un idea quantitativa sul numero delle cellule T che sono andate incontro a maturazione; è utile quindi per individuare la presenza di recenti emigranti timici, cioè di cellule appena uscite dal timo. Un quantitativo normale di TREC è presente solo quando il processo di ricombinazione avviene normalmente, mentre quando la ricombinazione non avviene correttamente o quando esiste un grave difetto numerico dei linfociti T la quantità di TREC risulterà molto ridotta. Nonostante le SCID siano causate da mutazioni in molti geni diversi, la maggior parte dei pazienti con SCID ha un ridotto numero di cellule T funzionali e quindi un basso numero di TREC (Notarangelo, 2010). Per tale motivo, l analisi quantitativa dei TREC è stata proposta come metodo di screening delle SCID. Il primo stato americano ad avviare un progetto pilota di screening delle SCID mediante il dosaggio dei TREC è stato il Wisconsin. Il progetto, attuato grazie al sostegno della Jeffrey Modell Foundation, del Children s Hospital del Wisconsin e del Wisconsin Laboratory of Hygiene, ha permesso di analizzare la presenza dei TREC direttamente sullo spot (DBS) di 207,696 nuovi nati da gennaio 2008 a dicembre I TREC vengono dosati su DBS (Fig. 2) mediante una tecnica di biologia molecolare, Real-time PCR (Verbsky et al., 2012). La Real-time PCR supera molti dei limiti esposti da altri test di biologia molecolare: è una metodica di rapida esecuzione in quanto consente di analizzare l avvenuta amplificazione del DNA specifico ricercato nel corso della stessa reazione, senza attenderne il termine; ha un elevata sensibilità rilevando anche meno di 5 copie di sequenza per campione ed elevatissima specificità; inoltre può utilizzare contemporaneamente diversi fluorocromi per marcare le sonde nel corso di una stessa reazione, permettendo così di identificare contemporaneamente più geni. Nell analisi dei TREC, il DNA necessario per la RT-PCR può essere ottenuto con estrazione da DBS; questo approccio è molto pratico e abbatte notevolmente i costi. Infatti si possono utilizzare, per l analisi quantitativa dei TRECs gli stessi spot neonatali comunemente effettuati su tutti i nuovi nati per 209

3 C. Azzari et al. Figura 2. Estrazione, amplificazione e analisi dei TRECs da spot neonatali mediante RT-PCR. La procedura di quantificazione dei TREC mediante Realtime PCR è estremamente semplice e rapida. Si parte da uno spot del diametro di 3,2 mm, corrispondente a circa 3,4 µl di sangue, si estrae il DNA e si amplifica con sonde e primers specifici. lo screening di patologie quali la fenilchetonuria (PKU), l ipotiroidismo congenito e la fibrosi cistica. Il metodo di raccolta del campione è dunque lo stesso già utilizzato per tutti i neonati e le procedure di spedizione ai centri di riferimento sono ben collaudate. Questo riduce il rischio di mancata raccolta o perdita di campioni da parte dei reparti di neonatologia. Accanto alla diagnosi di SCID, la riduzione dei TRECs può essere talvolta evidenziata anche in pazienti con forme intermedie di SCID ( leaky SCID), nei pazienti con engrafment T materno (Morinishi et al., 2009) e nei pazienti con sindromi talvolta associate a immunodeficienza, quali la Sindrome di Di George. Il metodo presenta, tuttavia, alcune mancanze: innanzitutto non può evidenziare i difetti isolati dei linfociti B, come la agammaglobulinemia congenita (XLA o malattia di Bruton) che possono manifestarsi già nel primo anno di vita con una sintomatologia di gravità e conseguenze paragonabili a quelle delle SCID con difetto di T, inoltre è un metodo dal costo non trascurabile (circa 6-8$ /test) e presenta una specificità e sensibilità buone ma non del tutto soddisfacenti. Per quanto riguarda la specificità, è stato dimostrato che la ricerca dei TREC con RT-PCR può dare falsi positivi in bambini prematuri, in neonati i corso di sepsi o anche in pazienti con linfopenie transitorie non associate ad immunodeficienza (Mallott et al., 2013). In merito, poi, alla sensibilità, il metodo non è risultato in grado di diagnosticare alla nascita tutti i casi di SCID, e può considerare falsamente negativi alcuni casi di SCID sindromiche, come l immunodeficienza associata alla malattia veno-occlusiva, alcuni difetti di adenosina deaminasi (ADA-SCID) (La Marca et al., 2013) o di purina-nucleoside fosforilasi (PNP-SCID) (Azzari, dati non pubblicati), forme di SCID caratterizzate da alterazioni di vie metaboliche con accumulo di metaboliti a monte delle vie compromesse. La spettrometria di massa Alla ricerca di un approccio alternativo, in Italia è stato sviluppato e validato un nuovo metodo basato sulla MS in grado di identificare due forme di SCID, il difetto di adenosina deaminasi e il difetto di purina-nucleoside-fosforilasi caratterizzate da profonde alterazioni metaboliche. Le alterazioni sono già presenti alla nascita e sono caratterizzate, nel caso di ADA-SCID, dall accumulo di due metaboliti, l adenosina e la desossiadenosina e, nel caso di PNP-SCID, di guanosina, inosina e dei loro deossi-derivati. I metaboliti specifici sono facilmente individuabili negli spot di sangue prelevati alla nascita (DBS), utilizzando la stessa procedura di MS con cui oggi, nella maggior parte dei paesi del mondo, si effettua lo screening degli errori congeniti del metabolismo (Azzari et al., 2011). Dalla fine degli anni 90 i progressi tecnologici, e in particolare l utilizzo della spettrometria di massa tandem (MS), che consente l analisi di più metaboliti su un unica goccia di sangue, hanno portato a modificare il concetto di screening, da un sistema con un test per malattia (come il test di Guthrie effettuato in origine per la diagnosi di PKU) ad un sistema con un test per molte malattie (screening in MS). Nella MS, con la medesima goccia di sangue, vengono contemporaneamente analizzati e quantificati vari metaboliti (acilcarnitine, amminoacidi), marcatori che si trovano alterati in oltre 40 malattie metaboliche (acidurie organiche, difetti della β-ossidazione degli acidi grassi, amminoacidopatie e difetti del ciclo dell urea) (La Marca et al., 2008). Queste patologie, rare singolarmente, mostrano elevata frequenza come gruppo e sono suscettibili di trattamento. Se non diagnosticate possono portare rapidamente ad exitus o a gravi sequele neurologiche. Il prelievo di sangue, sotto forma di DBS, è raccolto tra le 48 e le 72 ore di vita. Ad ogni neonato viene punto il tallone, e alcune gocce di sangue vengono raccolte su carta bibula Whatmann 903, essiccate, quotidianamente spedite al laboratorio di screening tramite corriere e analizzate entro due giorni dalla raccolta. La puntura del tallone avviene abitualmente sulla porzione mediale o su quella laterale del tallone stesso, utilizzando una lancetta pungidito. La disinfezione della cute avviene mediante alcool isopropilico al 70%. Occorre lasciare asciugare completamente la cute prima di pungere il tallone, ed eliminare con garza sterile la prima goccia di sangue, al fine di evitare commistioni di sangue e disinfettante, che possono interferire con le determinazioni analitiche. Standard chimici e marcati Gli standard marcati con isotopi stabili sono disponibili commercialmente e sono utilizzati per l analisi quantitativa. La soluzione madre viene preparata in metanolo per le acilcarnitine e in una miscela 50:50 v/v acqua/metanolo per gli amminoacidi. Le concentrazioni degli standard sono comprese nell intervallo μmol/l per gli aminoacidi e fra 7,6-152 μmol/l per le acilcarnitine. Le concentrazioni di succinilacetone, adenosina, 2-deossiadenosina, guanosina, deossi-guanosina, inosina e deossi-inosina sono 10 μmol/l. Le soluzioni giornaliere vengono preparate per diluizione 1:200 v/v 210

4 Screening delle immunodeficienze congenite: stato attuale e prospettive dalle soluzioni madri usando una miscela acqua/metanolo 10:90 v/v. Tutti i solventi utilizzati sono di grado HPLC. Preparazione del campione e analisi MS/MS Uno spot del diametro di 3,2 mm, corrispondente a circa 3,4 µl di sangue viene prelevato dal DBS ed inserito in una piastra a 96 pozzetti. Duecento μl della soluzione di metanolo contenente gli standard marcati e 100µL di una soluzione acquosa di idrazina 3mmol/L vengono aggiunti ai campioni. La piastra contenente i campioni viene incubata a 37 C per 25 minuti sotto agitazione per ottenere una completa estrazione degli analiti di interesse dallo spot di sangue. Al termine dell estrazione, il surnatante viene prelevato e trasferito in una nuova piastra e quindi essiccato sotto corrente di azoto a circa 50 C. I campioni vengono risospesi con 300µL di una soluzione 70:30 v/v acetonitrile-h 2 O (0,1% acido formico). Una volta preparato, il campione è pronto per essere analizzato con uno strumento HPLC-MS/MS. Le analisi di routine vengono eseguite su uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo, utilizzando come modalità di scansione in ionizzazione positiva il neutral loss scan per gli amminoacidi, il precursor ion scan per le acilcarnitine e il multiple reaction monitoring (MRM) per altri metaboliti di interesse, tra cui il succinilacetone e i nucleosidi purinici. La diagnosi precoce mediante screening consente una terapia, in fase presintomatica. Attualmente esiste ampia variabilità nel gruppo di difetti metabolici ricercati su spot nei diversi paesi. In Italia, dal 1992, lo screening include esclusivamente la ricerca della Fenilchetonuria (PKU), dell ipotiroidismo congenito e della Fibrosi Cistica. In anticipo rispetto alle altre regioni italiane, dal 2004 la Toscana si è adeguata ai protocolli internazionali sottoponendo tutti i nuovi nati a screening su DBS mediante MS per più di 40 patologie. Inoltre, da gennaio 2011, il pannello di patologie sottoposte a screening in MS è stato allargato alle immunodeficienze causate da deficit dell enzima Adenosina Deaminasi (ADA) e di Purina-nucleoside Fosforilasi (PNP). I primi 18 mesi di esperienza toscana hanno permesso di individuare un paziente ADA, suggerendo così che l incidenza della malattia è largamente sottostimata. L ADA-SCID è una delle più frequenti SCID (10-25%) e nella sua forma (early onset) porta rapidamente a morte per infezioni gravi. Esistono anche forme più tardive di questa immunodeficienza (delayed and late onset) che si manifestano con severe infezioni ricorrenti, autoimmunità, danno neurologico; anche questi fenotipi possono portare a danni permanenti e a morte. Proprio per la loro caratteristica di progressività e quindi per il fatto che il danno timico può non essere completo alla nascita, le forme che non hanno esordio sfuggono al test basato su dosaggio di TREC mentre vengono individuate mediante il test in MS (La Marca et al., 2008; Azzari et al., 2011). I livelli dei metaboliti adenosina e desossiadenosina, marcatori del difetto di ADA sono, infatti, correlati alla mutazione genica che ha causato il difetto, con la conseguenza che i loro livelli sono già elevati alla nascita e restano stabilmente alterati nel corso della vita. La differenza tra i valori che si trovano nei pazienti con ADA-SCID e nei soggetti sani è estremamente ampia (Fig. 3), tanto che non esiste overlapping nei range tra sano e malato. La conseguenza di questo fenomeno è un altissima specificità e sensibilità del test. In maniera analoga, il metodo MS è in grado di identificare il difetto di PNP dosando i metaboliti specifici Guanosina ed Inosina e i loro Figura 3. Confronto tra i livelli di adenosina e 2-deossiadenosina dosati su DBS con MS in paziente sano e affetto da ADA-SCID. Nel paziente sano i livelli di adenosina sono molto bassi e la 2-desossiadenosina è addirittura assente. Al contrario, nel paziente con ADA-SCID i livelli dei due metaboliti possono essere anche 1000 volte più alti dell atteso. Non esiste overlapping tra i livelli trovati in soggetti sani e i livelli trovati nei pazienti con ADA-SCID, per cui il test non presenta falsi positivi. I metaboliti sono già presenti alla nascita, anche in pazienti con forme di immunodeficienza da difetto di ADA ad esordio tardivo; la tandem massa è quindi il metodo più sensibile per la diagnosi di ADA-SCID. 211

5 C. Azzari et al. Tabella I. Principali differenze tra screening per immunodeficienze effettuato con tecnologia Realtime per TREC e spettrometria di massa tandem. Screening con TRECs Screening con (per ADA-SCID e PNP-SCID) Sensibilità <100% 100% per ADA e PNP Non identifica i casi di difetto di ADA ad esordio tardivo Non identifica alcune SCID Identifica tutti i casi di ADA e PNP sia ad esordio precoce che tardivo Specificità <100% 100% per ADA e PNP Valuta come casi positivi anche linfopenie T non associate Non sono stati descritti falsi positivi ad immunodeficienza Tecnologia utilizzata Realtime PCR Spettrometria di massa Tecnologia non in uso routinario nei Tecnologia in uso routinario nei Costo per test 6 < 0,05 desossiderivati. Il metodo MS ha, per la diagnosi di SCID da difetto di ADA o PNP, una specificità e una sensibilità molto elevate (ad oggi entrambe del 100%) e un costo molto contenuto (inferiore a 0.05 /test). Lo svantaggio di questo metodo sta nel fatto che esso non riesce ad individuare, al momento, SCID diverse da ADA e PNP. Essendo, però, estremamente poco costoso e molto più sensibile dei TREC, specialmente nelle forme non neonatali, il metodo MS può essere utilizzato in aggiunta all uso dei TREC. Inoltre, per il bassissimo costo di applicazione, il metodo può essere introdotto in tutte quelle realtà che non dispongono di fondi sufficienti ad uno screening su base genetica (TREC) (Tab. I). Lo screening per ADA e PNP-SCID mediante spettrometria di massa tandem potrebbe essere facilmente incluso in un programma di screening sulla popolazione a causa del suo basso costo e perché non richiede né la strumentazione extra né tempo extra degli operatori, che già lavorano nei programmi di screening. Il presente metodo è applicabile anche ai neonati prematuri i cui livelli medi di adenosina, guanosina, inosina e dei loro deossi-derivati non differiscono da quelli osservati nei neonati a termine. Nessuno dei pazienti ADA o PNP analizzati fino ad ora è nato prematuro, ma è ben noto che elevati livelli di metaboliti tossici sono già presenti durante la vita fetale. Il metodo descritto non sembra essere influenzato da stoccaggio a lungo termine o condizione di cattiva conservazione. I metaboliti assorbiti sul cartoncino di Guthrie (DBS) prelevato alla nascita sono molto stabili, tanto che possono essere testati anche dopo anni (Azzari et al., 2011) permettendo di individuare in modo inequivocabile un paziente ADA o PNP-SCID nato molti anni prima. Figura 4. Schematica rappresentazione della produzione dei KREC (modificata da van Zelm MC et al., JEM, 2007). 212

6 Screening delle immunodeficienze congenite: stato attuale e prospettive Tabella II. Principali vantaggi e limiti dei metodi di screening sperimentati fino ad oggi. Emocromo Dosaggio IL-7 TREC KREC Spettrometria di massa Vantaggi Basso costo Effettuabile su spot Effettuabile su spot Effettuabile su spot Effettuabile su spot Individua linfopenia T, associata o meno a SCID Individua la maggior parte delle SCID con difetto di T Individua la maggior parte delle SCID con difetto di T e/o B Specificità 100% su deficit di ADA e PNP Sensibilità 100% su deficit di ADA e PNP Costo estremamente basso Limiti Bassa specificità; difficoltà di impostazione di un cut-off Necessaria esecuzione di prelievo ematico su tutti i nuovi nati già in uso routinario nei Costo elevato Costo elevato Costo elevato Dati disponibili solo su difetto di ADA e PNP Scarsa specificità (necessità di test di conferma mediante esami quali TREC) Non identifica i difetti di ADA ad esordio tardivo, né alcune SCID Individua linfopenie non associate ad immunodeficienza Non identifica i difetti di ADA ad esordio tardivo, né alcune SCID Deve essere effettuato insieme con il test TREC per raggiungere sensibilità e specificità adeguate Kappa-deleting recombination excision circles (KREC) Analogamente a quanto avviene nella maturazione del TCR nelle cellule T, anche nelle cellule B si verifica una ricombinazione che estromette piccole parti di DNA avanzato. Con procedura simile a quella dei TREC, che utilizza lo stesso metodo di amplificazione genica in Realtime, questi frammenti di DNA, chiamati KREC (Fig. 4) possono essere individuati e quantizzati, consentendo così di individuare forme di immunodeficienza primitiva con deficit isolato dei B (Nakagawa et al., 2011). L utilizzo dei KREC non deve essere però visto come limitato all individuazione delle immunodeficienze con difetto isolato di cellule B; è stato recentemente dimostrato che in alcune forme di SCID con fenotipo più lieve, può essere alterato anche uno solo dei due test TREC/KREC. L utilizzo di entrambi i metodi contemporaneamente consente di migliorare la sensibilità di diagnosi. È evidente però che raddoppiare un test genetico già di per sé costoso come quello dei TREC può rappresentare un ulteriore scoglio alla diffusione dello screening. Per questo motivo sono state introdotte tecniche di multiplex Realtime PCR, mediante le quali nella stessa provetta viene ricercata con primer e sonde specifiche sia la presenza di TREC che di KREC (Borte et al., 2012). In questo modo il costo è solo di poco superiore al costo dei TREC da soli. Resta tuttavia da chiarire quale sia la specificità del metodo KREC e quella del metodo multiplex (TREC più KREC) quando usati su un intera popolazione di nuovi nati. Questi dati potranno essere ottenuti soltanto mediante l applicazione del metodo ad uno screening di popolazione. Il passo successivo sarà, per tutti i ricercatori che si occupano di screening, quello di armonizzare le procedure in modo da avere risultati paragonabili, tendo conto dei vantaggi e svantaggi di tutte le tecnologie fino ad oggi utilizzate (Tab. II). Prospettive future In conclusione, l utilizzo di uno screening per le SCID può significativamente migliorare l outcome clinico della patologia e molti metodi, tra cui l analisi con amplificazione genica dei TREC e KREC, o metodi in spettrometria di possono essere utilizzati allo scopo di allargare il più possibile la popolazione sottoponibile a screening con il costo più ridotto possibile. 213

7 C. Azzari et al. Bibliografia Azzari C, La Marca G, Resti M. Neonatal screening for severe combined immunodeficiency caused by an adenosine deaminase defect: a reliable and inexpensive method using tandem mass spectrometry. J Allergy Clin Immunol 2011;127: ** Gli autori utilizzano per la prima volta la Spettrometria di Massa per lo screening su spot dell ADA-SCID, validando e brevettando un nuovo metodo per la diagnosi prenatale delle immunodeficienze ad un costo irrisorio ed un elevata sensibilità e specificità. Baker MW, Grossman WJ, Laessig RH et al. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol 2009;124: Borte S, Von Döbeln U, Fasth A et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood 2012;119: Buckley RH. Molecular defects in human severe combined immunodeficiency and approaches to immune reconstitution. Annu Rev Immunol 2004;22: Chan K, Puck JM. Development of population-based newborn screening for severe combined immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol 2005;115: Gaspar HB, Parsley KL, Howe S et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet 2004;364: ** Gli autori hanno effettuato uno studio su quattro pazienti pediatrici affetti da immunodeficienza severa combinata X-linked, dimostrando l efficacia e la fattibilità della terapia genica nel ripristinare l immunità cellulare ed umorale. Hazenberg MD, Verschuren MC, Hamann D et al. T cell receptor excision circles as markers for recent thymic emigrants: basic aspects, technical approach, and guidelines for interpretation. J Mol Med (Berl) 2001;79: La Marca G, Malvagia S, Casetta B et al. Progress in expanded newborn screening for metabolic conditions by LC-MS/MS in Tuscany: update on methods to reduce false tests. J Inherit Metab Dis 2008;31: La Marca G, Canessa C, Giocaliere E et al. Tandem mass spectrometry, but not T- cell receptor excision circle analysis, identifies newborns with late-onset adenosine deaminase deficiency. J Allergy Clin Immunol 2013;131: Lipstein EA, Vorono S, Browning MF et al. Systematic evidence review of newborn screening and treatment of severe combined immunodeficiency. Pediatrics 2010;125: Mallott J, Kwan A, Church J et al. Newborn screening for SCID identifies patients with ataxia telangiectasia. J Clin Immunol 2013;33: Morinishi Y, Imai K, Nakagawa N et al. Identification of severe combined immunodeficiency by T-cell receptor excision circles quantification using neonatal guthrie cards. J Pediatr 2009;155: Nakagawa N, Imai K, Kanegane H et al. Quantification of κ-deleting recombination excision circles in Guthrie cards for the identification of early B-cell maturation defects. J Allergy Clin Immunol 2011;128: Notarangelo LD. Primary immunodeficiencies. J Allergy Clin Immunol 2010;125:s ** L autore riesamina, alla luce dei recenti progressi nell ambito della biologia molecolare e della genetica, le basi patogenetiche, i metodi di diagnosi e le possibilità terapeutiche delle immunodeficienze primarie. Puck JM. Population-based newborn screening for severe combined immunodeficiency: steps toward implementation. J Allergy Clin Immunol 2007;120: Verbsky J, Thakar M, Routes J. The Wisconsin approach to newborn screening for severe combined immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol 2012;129: Box di orientamento Cosa si sapeva prima Le immunodeficienze congenite sono malattie estremamente gravi e spesso mortali già nel primo anno di vita. Inizialmente si credeva che esse fossero estremamente rare. Nel passato sono stati proposti diversi metodi per la loro diagnosi molto precoce, tra cui il dosaggio di IL7, l emocromo a tutti i nuovi nati. Cosa sappiamo adesso Oggi sappiamo che la frequenza delle immunodeficienze congenite è grandemente sottostimata e che sono disponibili metodologie basate sulla biologia molecolare o sulla spettrometria di massa, altamente sensibili e specifiche, che consentono di effettuare uno screening di massa per la maggior parte di esse. Quali ricadute sulla pratica clinica. Considerando che esistono terapie risolutive, estremamente efficaci se utilizzate in fase pre-sintomatica, si può prevedere una diffusione sempre maggiore dello screening per le immunodeficienze congenite. Corrispondenza Chiara Azzari, Immunologia Pediatrica, Università degli Studi di Firenze, Azienda Ospedaliero-Universitaria Anna Meyer, Viale Pieraccini, 24, Firenze. chiara.azzari@unifi.it 214