INDAGINI MICROBIOLOGICHE E MOLECOLARI A SEGUITO DELL OSSERVAZIONE DI UN AUMENTO DI LISTERIOSI UMANA IN BELGIO,

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1 Eurosurveillance, Volume 15, Issue 6, 11 febbraio 2010 INDAGINI MICROBIOLOGICHE E MOLECOLARI A SEGUITO DELL OSSERVAZIONE DI UN AUMENTO DI LISTERIOSI UMANA IN BELGIO, M Yde ( ) 1, N Botteldoorn 1, S Bertrand 1, JM Collard 1, K Dierick 1 Istituto scientifico della sanità pubblica, Sezione di Batteriologia, Bruxelles, Belgio Stile di citazione per questo articolo: Yde M, N Botteldoorn, Bertrand S, Collard JM, Dierick K. Indagini microbiologiche e molecolari a seguito dell osservazione di un aumento di listeriosi umana in Belgio, Euro Surveill. 2010; 15 (6): pii = Disponibile online: Date of submission: 30 June 2009 Data di presentazione: 30 giugno 2009 In Belgio, la maggior parte dei casi di listeriosi sono casi sporadici. In questo studio presentiamo le evidenze di un episodio di listeriosi: un cluster di casi che si sono verificati nel 2006 e 2007, con identificazione di ceppi identici. L'episodio ha coinvolto 11 pazienti, affetti da Listeria monocytogenes di sierotipo 4b. La fonte di infezione non è stata rilevata. Introduzione Listeria monocytogenes è un batterio gram-positivo intracellulare di origine alimentare. In alcuni gruppi (persone immunodepresse, neonati, donne incinte ed i loro bambini non ancora nati), può essere una causa importante di pericolo di vita, potendo causare batteriemia e meningite. Nella Listeriosi, poichè il tempo di incubazione è relativamente lungo (da 3 a 60 giorni), è spesso difficile rintracciare la fonte di infezione. Ciò spiega perché la stragrande maggioranza dei casi vengono notificati come sporadici. Tuttavia, alcuni ben documentati focolai di listeriosi sono stati segnalati da Finlandia, Francia, Svizzera, Regno Unito (UK) e Stati Uniti (USA). In Belgio, una epidemia di listeriosi è stata descritta nel 2001 ; i dati provenienti da un ulteriore studio sono stati inconcludenti. Nel presente studio, 36 ceppi umani provenienti da laboratori ospedalieri e cinque ceppi di origine alimentare sono stati caratterizzati tramite sierotipizzazione, metal resistance typing e pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Questa combinazione di indagini ci ha fornito l'opportunità di collegare i ceppi da 11 casi sporadici. Metodi I pazienti non sono stati sistematicamente intervistati sulle loro abitudini alimentari, i dati clinici sono stati forniti dai laboratori. Identificazione e tipizzazione molecolare Dal 1966, il Centro di Riferimento Belga per la Listeria (BLRC) ha ricevuto ceppi isolati in ospedale di L. monocytogenes da campioni consegnati su base volontaria. L'identificazione del ceppo è stata effettuata con il kit API Listeria (biomérieux, Francia). Tutti i ceppi sono sierotipizzati secondo un protocollo standard, utilizzando un test commerciale di agglutinazione (Denka Seiken, Tokyo, Giappone) per antigeni somatici (O) e flagellari (H). La sensibilità all'arsenico e cadmio è stata determinata secondo McLauchlin et al. La tipizzazione molecolare è stata eseguita su gruppi di isolati sospetti in base a considerazioni geografiche, su verificarsi di casi multipli all'interno di un breve periodo di tempo o su un cluster di isolati con sierotipo identici.

2 La PFGE è stata fatta seguendo il protocollo americano PulseNet dopo la digestione del DNA con l'apa I e Asc I. L analisi delle bande è stata eseguita con il sistema di documentazione ImageMaster video (Amersham Pharmacia Biotech) e fingerprinting II software Informatix (Bio-Rad). L estrazione del DNA per la Random Amplified of Polymorphic DNA (RAPD) viene fatto con il QI Amp DNA Mini Kit; primer HLWL 74 e le condizioni di PCR sono stati descritti da Wernars et al.. Isolamento di Listeria monocytogenes da alimenti 25 g di campione alimentare sono stati aggiunti a 225 ml di brodo Fraser Half per 24 ore a 30 C, seguita da inoculazione di 0,1 ml in 10 ml di brodo di Frazer e incubazione per 24 ore a 37 C. Dopo l arricchimento, 500 microlitri della cultura sono stati utilizzati per la prova LM02 VIDAS (biomérieux). Nei positivi, 10 microlitri di brodo di arricchimento Fraser sono stati posti in sottocoltura su due supporti: RAPID L. Mono (Bio-Rad) e ALOA (biomérieux). Colonie caratteristiche per Listeria monocytogenes sono state ulteriormente confermate con il kit di Listeria Api. Risultati Il BLRC riceve ogni anno tra 30 e 68 ceppi di casi clinici di listeriosi umana, che rappresentano un'incidenza annuale di tre a sei casi per milione di abitanti. Questa incidenza è paragonabile a quella riportata da altri paesi industrializzati. Nel 2006, sono stati ricevuti 56 ceppi clinici: 19 di essi erano di sierotipo 4b. Gli isolamenti su base mensile di sierotipo 4b variano tra nessuno e due. Tuttavia, nel mese di ottobre e novembre 2006, sono stati isolati cinque e sei ceppi, rispettivamente, suggerendo un possibile focolaio di listeriosi (Figura 1). Questi 11 isolati sono stati differenziati testando la resistenza al metallo. Sono stati trovati 3 tipi di resistenza: arsenico sensibili - cadmio resistenti (SR) (un ceppo), arsenico e cadmio resistenti (RR) (due ceppi), e arsenico e cadmio-sensibili (SS) (otto ceppi). Era chiaro a questo punto che eravamo di fronte a un ceppo episodico del fenotipo SS. Figura 1. Isolati clinici di Listeria monocytogenes sierotipo 4b pervenuta alla belga Listeria Centro di Riferimento, da mesi, 2006 (n = 19) Gli otto ceppi di fenotipo 4b SS sono stati ulteriormente subtipizzati con PFGE. Essi appartengono a tre differenti pulsovar, con pulsovar A in sei ceppi (Figura 2). I rimanenti due ceppi appartenevano ad un pulsovar diverso. Uno di questi pulsovar (B) è stato filogeneticamente collegato al pulsovar A con un indice di somiglianza del 92,31% (II Fingerprinting applicazione software Informatix).

3 Figura 2. Pulsed-field gel elettroforesi Asc I e Apa I profili di Listeria monocytogenes pulsovar A Per valutare la durata dell'episodio, i restanti ceppi di fenotipo 4b - SS del 2006 e quelli isolati nel 2007 sono stati subtipizzati con PFGE. Altri cinque ceppi (tutti a partire dal 2007) sono stati trovati con un profilo indistinguibile dal ceppo derivante dall episodio in questione. Il tasso di isolamento nel 2007 è stato irregolare: gennaio (un ceppo), Febbraio (un ceppo), marzo (un ceppo), luglio (due ceppi) (Figura 3). Gli ultimi due casi sono stati geograficamente collegati indicando una estensione locale dell episodio. Prima dell'inizio dell episodio, ceppi pulsovar A sono stati molto rari: solo un ceppo è stato identificato nel Figura 3. Distribuzione mensile del episodica Listeria monocytogenes ceppo (4b, SS, pulsovar A), il Belgio, ottobre 2006-luglio 2007 (n = 11) 11 casi sembrano essere stati coinvolti in questo episodio (sei nel 2006 e cinque nel 2007). Le caratteristiche dei pazienti sono illustrate nella tabella. Delle culture positive di questi pazienti, nove sono state eseguite su sangue e due dal liquido cerebrospinale; quattro casi sono state donne in gravidanza o neonati. Una donna incinta ha avuto un gemello nato morto. L'episodio non è stato un cluster geografico, poiché gli stipiti sono stati ricevuti da tre diverse regioni del Belgio: Fiandre, Vallonia e Bruxelles. Tabella. Patients 'caratteristiche dell'episodio listeriosi, Belgio, ottobre 2006-luglio 2007 (n = 11) Il primo episodio è stato individuato dalla BLRC nel novembre Solo in quattro occasioni i pazienti sono stati interrogati sulla loro abitudini alimentari. Nessun questionario standard è stato utilizzato. Campioni di prodotti alimentari sospetti sono stati prelevati dai frigoriferi dei pazienti o dallo stesso lotto di prodotti alimentari sospetti a livello del dettaglio. E stato campionato salmone affumicato, perché in un caso di parto

4 pretermine, la madre ricordava di aver mangiato il salmone affumicato. Carne cruda di cervello è stata l'unica voce alimenti sospetti in un caso di setticemia. La donna con feto morto ha riferito di aver mangiato lasagne preconfezionate; questo alimento era stato sospettato dopo che alcuni dei suoi coinquilini avevano presentato gastroenterite. Tuttavia, L. monocytogenes non è stato isolato da nessuno di questi campioni. Poiché la fonte di contaminazione non è stata individuata, un'altra linea di indagine è stata seguita. Abbiamo cercato nell archivio degli isolati da alimenti del BLRC un ceppo con le stesse caratteristiche del ceppo derivante dagli episodi in studio. Tra gli isolati da prodotti alimentari pervenuti in BLRC nel 2006 e nel 2007, solo sei sono stati i ceppi di fenotipo 4b- SS. Erano stati subtipizzati con RAPD. Due ceppi isolati da pollame hanno presentato lo stesso profilo RADP dei ceppi provenienti dagli episodi. Tuttavia, questi ceppi erano di pulsovar diverso, il che li esclude dal coinvolgimento nell'episodio. Discussione In Belgio, la maggior parte dei casi di listeriosi sono segnalati come casi singoli. I Laboratori clinici hanno l obbligo di legge di riportare i casi alle Autorità Sanitarie. Tuttavia, tali autorità raramente ricevono anche informazioni sulle caratteristiche genotipiche del ceppo, il che non facilita il collegamento tra casi sporadici. I Laboratori clinici possono far pervenire i loro isolati al BLRC. Si stima che il BLRC riceva circa il 70% del numero complessivo di isolati clinici in Belgio. Effettuando il BLRC la tipizzazione dei ceppi, i gruppi di ceppi identici sono facilmente riconoscibili. La combinazione di sierotipizzazione, resistenza al metallo e PFGE hanno portato all'individuazione di 11 isolati identici. Il ceppo è stato episodico, di sierotipo 4b, sensibile alle arsenico e cadmio e apparteneva a pulsovar A. Sei di essi sono stati isolati in un periodo di alcune settimane il che è eccezionale per un paese piccolo come il Belgio. Oltre agli isolamenti cluster nel 2006, il ceppo è stato isolato da altri cinque pazienti nel 2007, indicando una lunga estensione dell'episodio che continuò quindi fino al luglio La fonte di contaminazione non è stata individuata. Due fattori possono aver contribuito a questo fallimento: la mancata intervista dei pazienti e il mancato campionamento degli alimenti correlati. Durante questo episodio solo quattro pazienti sono stati contattati da ispettori sanitari e solo tre campioni di prodotti alimentari sono stati prelevati e si sono rivelati negativi per L. monocytogenes in 25 g. D'altra parte, il ceppo legato all episodio non era presente nella collezione BLRC di ceppi da alimenti, e quindi non si è in possesso di nessun indizio per sospettare prodotti alimentari su cui indagare. La non identificazione del cibo implicato non è un fatto eccezionale. Nel 1987, 23 casi di listeriosi in Gran Bretagna sono stati attribuiti a un ceppo di sierotipo insolito designato 4b (X); il cibo implicato non è stato identificato. Nei Paesi Bassi, un analisi di un cluster basata sulla sierotipizzazione e PFGE ha mostrato 15 casi di listeriosi, senza l'individuazione di una chiara fonte di infezione. Il sierotipo 4b non è insolito. In Europa e Nord-America, la maggior parte dei focolai di listeriosi pubblicati negli ultimi 20 anni hanno coinvolto ceppi 4b. Inoltre, ceppi di sierotipo 4b tendono ad essere sovrarappresentati in listeriosi perinatale, suggerendo la possibilità del possesso di attributi di virulenza particolarmente aggressivi in gravidanza con passaggio della barriera emato-placentare. Si presume che il ceppo legato all episodio sia stato particolarmente virulento, perché ha coinvolto un numero relativamente elevato di donne in gravidanza (4 di 11) e provocato casi di meningite, (2 di 11), rispettivamente. Secondo i dati annuali provenienti dal BLRC,

5 i ceppi da casi di listeriosi materno-neonatale rappresentano il 10% del numero totale di ceppi clinici e una percentuale simile è stato osservata per i casi di meningite. E 'generalmente accettato che le persone che presentano una malattia di base sono più soggetti a contrarre la listeriosi. In questo episodio, le informazioni erano disponibili da solo tre. Poichè non è obbligatorio per i laboratori clinici riportare questo genere di notizie al BLRC, molti dati epidemiologici sono sconosciuti. Durante questo episodio di listeriosi, abbiamo ricevuto un ceppo di Listeria umana strettamente connesso al ceppo in studio. Questo ceppo era di sierotipo 4b, sensibile a arsenico e cadmio, ma rappresentava un altro pulsovar (B). Pulsovar B si differenzia da pulsovar A soltanto per tre bande nel profilo I Apa. Secondo Tenover et al., due profili che si differenziano soltanto per tre bande sono considerati strettamente connessi. Tuttavia, l'indice di somiglianza tra i due profili era 92,31% e quindi inferiore al 95%, il livello minimo di ceppi altamente correlati. Pertanto, questo ceppo è stato escluso dal l'episodio. L'episodio sarebbe passato inosservato se il BLRC non avesse effettuato la tipizzazione dei ceppi. Un efficiente controllo della listeriosi richiede interviste approfondite ai pazienti con l utilizzo sistematico di un questionario standardizzato. La stretta cooperazione tra gli ispettori sanitari comunitari, l'agenzia Federale Belga per la sicurezza della catena alimentare (FASFC) e il BLRC si tradurrebbe in un rapido collegamento di casi sporadici e nel miglioramento della possibilità di trovare la fonte di infezione in caso di epidemia.