Chimica Analitica.
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- Mariana Mora
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1 Chimica Analitica 1
2 INTRODUZIONE Obiettivi formativi Il corso di Chimica Analitica fornisce allo Studente le nozioni fondamentali di chimica analitica utili all'espletamento ed alla valutazione dei controlli dei medicamenti ed alla comprensione degli studi di validazione dei farmaci. Si propone di dare una visione globale del processo analitico, a partire dalla scelta del metodo di analisi fino all'elaborazione dei risultati, e delle tipologie di metodiche classiche e strumentali di analisi. Fornire gli strumenti per poter valutare criticamente (anche per via statistica e chemiometrica) sia i risultati sperimentali ottenuti che quelli riportati negli studi di applicazione dei farmaci e nel controllo di qualità dei medicinali e prodotti per la salute. Consentire l acquisizione di conoscenze culturali necessarie per affrontare i corsi degli anni seguenti, in particolare quelli di analisi dei medicinali 2
3 Introduzione alla Chimica Analitica Riepilogo di alcuni concetti basilari CONTENUTI DEL CORSO Gli errori nell'analisi chimica Definizione dei termini. Errori causali. Il trattamento statistico dell'errore. La deviazione standard di risultati calcolati. Metodi per riportare i dati analitici. Valutazione dei dati analitici Errori sistematici. Applicazione della statistica alla valutazione dei dati Introduzione ai metodi spettroscopici di analisi. Proprietà della radiazione elettromagnetica. Lo spettro elettromagnetico. Componenti degli strumenti per spettroscopia ottica. Teoria della spettroscopia di assorbimento molecolare Termini impiegati in spettroscopia di assorbimento. La legge di Beer. Teoria dell'assorbimento molecolare. Applicazioni della spettroscopia di assorbimento molecolare 3
4 CONTENUTI DEL CORSO Strumenti per misure di assorbimento ottico. Spettrometria e fotometria nell'ultravioletto/visibile Applicazioni della spettroscopia di assorbimento nell'infrarosso. Errori nelle analisi spettrofotometriche. Spettroscopia di fluorescenza molecolare Teoria della fluorescenza molecolare. Effetto della concentrazione sull'intensità di fluorescenza. Strumenti per la misura della fluorescenza. Spettroscopia atomica Origine degli spettri atomici. Spettroscopia basata sull'atomizzazione con fiamma. Spettroscopia atomica con atomizzatori elettrotermici. Metodi di emissione atomica basati su sorgenti a plasma. Separazioni analitiche per estrazione e scambio ionico Separazione per estrazione. Separazione per scambio ionico. Introduzione ai metodi cromatografici Descrizione generale della cromatografia. Velocità di migrazione dei soluti. 4
5 CONTENUTI DEL CORSO Efficienza delle colonne cromatografiche. Risoluzione di una colonna. Applicazioni della cromatografia. Applicazioni della cromatografia Cromatografia gas-liquido. Cromatografia liquida ad alta efficienza. Confronto tra la cromatografia liquida ad alta prestazione e la cromatografia gas-liquido 5
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7 Chimica Analitica E costituita da due sezioni: Chimica analitica qualitativa che si occupa della determinazione di quale costituente o costituenti esistono in un campione Chimica analitica quantitativa che si occupa della determinazione di quanto di una data sostanza è presente nel campione 7
8 Chimica Analitica Metodiche Analitiche I metodi quantitativi si possono suddividere in diversi gruppi, in funzione della misura finale che si ottiene nell analisi, la grandezza della quale è proporzionale alla quantità di analita presente nel campione. Esistono pertanto : - analisi gravimetrica - analisi volumetrica - metodi elettroanalitici - metodi spettroscopici (Strumentali) 8
9 Procedimento analitico definizione del problema campionamento preparazione del campione trattamento del campione separazione di potenziali interferenze completamento dell analisi 9
10 Scelta del Metodo di analisi La scelta del metodo e l attenzione con cui esso viene eseguito sono strettamente dipendenti dall accuratezza che viene richiesta. L aumento dell attendibilità di una analisi richiede con ogni probabilità un aumento esponenziale del tempo di analisi. Un analisi che non riuscirà a fornire l attendibilità richiesta sarà ovviamente uno spreco di tempo 10
11 Campionamento E fondamentale, in qualsiasi analisi chimica, essere in possesso di un campione la cui composizione sia rappresentativa di una vasta quantità di sostanza. Quanto più il materiale iniziale è omogeneo, tanto più facile sarà ottenere un campione rappresentativo. 11
12 Preparazione del campione Per quanto riguarda le sostanze solide il campione deve essere macinato per ridurre la grandezza delle particelle ed assicurarne quindi l omogeneità. Per quanto riguarda le analisi che si effettuano su soluzioni del campione il solvente dovrebbe sciogliere completamente l analita, rapidamente, stabilmente e nelle condizioni più blande possibili. 12
13 Trattamento del campione Il campione come tale viene sottoposto ad una serie di trattamenti atti a renderlo idoneo al tipo di analisi che si intende effettuare. Le operazioni più comuni che si effettuano sono: Macinazione (Solido), miscelazione, essiccamento, calcinazione, filtrazione e solubilizzazione. Spesso la determinazione sia qualitativa che quantititativa di un analita è preceduta da operazioni di estrazione o separazione di quest ultimo dagli altri componenti presenti nel campione Es. misurazione del ph diretta. Nella maggiorparte dei casi è necessario trattare il campione 13
14 Definizione dei campioni replicati La maggior parte delle analisi chimiche viene eseguita su campioni replicati le cui masse o volumi sono stati determinati da misure accurate con una bilancia analitica o con uno strumento volumetrico preciso. La replicazione accresce la qualità dei risultati e fornisce una misura della loro attendibilità. Solitamente, le misure quantitative sui replicati vengono mediate e sui risultati vengono eseguiti i vari test statistici per stabilirne l'attendibilità. 14
15 Separazione di potenziali interferenze Le sostanze che ostacolano la misura diretta della concentrazione di analita vengono dette interferenze; la loro eliminazione prima della misura finale è uno stadio importante nella maggior parte delle analisi. Non esistono regole assolute e veloci per eliminare le interferenze; questa difficoltà spesso rappresenta l aspetto più problematico dell analisi. 15
16 Calibrazione e misura della concentrazione Tutti i risultati analitici dipendono dalla misura finale X di una proprietà fisica o chimica dell'analita. Questa proprietà deve variare in modo noto e riproducibile con la concentrazione c A dell'analita. Idealmente, la misura della proprietà è direttamente proporzionale alla concentrazione. Cioè, c A = kx dove k è una costante di proporzionalità. Con poche eccezioni, i metodi analitici richiedono la determinazione empirica di k con standard chimici per i quali c A sia noto. Il processo di determinazione di k costituisce perciò una fase importante nella maggior parte delle analisi; questa fase è chiamata calibrazione. 16
17 Completamento dell analisi Questo generalmente è lo stadio più veloce e facile di tutti, ma può essere attendibile solo se le fasi precedenti sono state effettuate in maniera corretta. Una necessità fondamentale è che sia nota la proporzionalità tra la grandezza misurata e la quantità di analita presente. 17
18 UN RUOLO INTEGRALE PER L'ANALISI CHIMICA: SISTEMI DI CONTROLLO A RETROAZIONE Si determina lo stato desiderato, si misura lo stato attuale del sistema e si confrontano i due stati. La differenza tra i due stati viene usata per variare una quantità controllabile che conduce ad una variazione dello stato del sistema. Sul sistema vengono nuovamente eseguite le misure quantitative e viene ripetuto il confronto. La nuova differenza tra lo stato desiderato e lo stato attuale viene ancora usata, se necessario, per cambiare lo stato del sistema. Il processo fornisce un continuo monitoraggio e feedback per mantenere la quantità controllabile, e quindi lo stato attuale, ad un livello appropriato. Il testo descrive il monitoraggio e il controllo della concentrazione di glucosio nel sangue come esempio di un sistema di controllo 18 retroattivo.
19 MISURAZIONE DEL GLUCOSIO NEL SANGUE Quantificazione della reazione Enzimatica di ossidazione del glucosio, prporzionale alla sua concentrazione nel sangue ed operata dall enzima glucosio ossidasi. Nel metodo impedenziomentrico viene misurata la conduttività elettrica del sangue stesso, indotta dalla corrente generata dalla reazione di ossidoriduzione stessa. Caratteristiche tecniche: Dimensioni: 53 x 30 x 96 mm (2.1 x1.2 x 0.38 ) Metodo di misurazione: tecnologia amperometrica con glucosio ossidasi Gamma di risultati: 20 mg/dl ~ 600 mg/dl (1.1 mmol/l ~ 33.3 mmol/l) Alimentazione: CA 3,0 V, CR1620 Campione di sangue: sangue capillare completo Volume di sangue: min. 0.7 µl La glucosio ossidasi è un enzima ossidoredutatsi che catalizza: Β-D-glucosio + O 2 àd-glucono-1,5- lattone + H 2 O 2 19
20 Un esempio pratico Nel parco statale di Land between the lakes nel Kentucky si verificò una moria di cervi nei pressi di uno stagno. Venne sospettato l utilizzo di un erbicida a base di Arsenico. La preparazione dei campioni di reni prelevati dagli animali morti vennero preparati per incenerimento a secco in crogiuolo. Allo stesso modo vennero preparati i campioni di erba. 20
21 Il solido essiccato in ciascuno dei crogiuoli fu sciolto in HCl diluito, che trasformò l As 2 O 5 in H 3 AsO 4. L Arsenico può essere separato da altre sostanze che potrebbero interferire nell analisi, mediante trasformazione in Arsina, AsH 3, un gas tossico incolore che si sviluppa quando una soluzione di H 3 AsO 4 viene trattata con Zinco. 21
22 Le soluzioni risultanti dai campioni di cervo e di erba furono combinate con Sn 2+ e fu aggiunta una piccola quantità di di ioni ioduro per catalizzare la riduzione di H 3 AsO 4 in H 3 AsO 3 : H 3 AsO 4 + SnCl 2 +2HCl H 3 AsO 3 + SnCl 4 +H 2 O L H 3 AsO 3 fu poi trasformato in AsH 3 per aggiunta di Zn metallico H 3 AsO 3 + 3Zn+6HCl AsH 3 + 3ZnCl 2 +3H 2 O 22
23 L intera reazione venne eseguita in beute munite di tappo e di un tubo di trasferimento in modo tale che il gas di arsina potesse essere raccolto nella soluzione assorbente 23
24 L arsina viene raccolta in speciali contenitori trasparenti detti cuvette. 24
25 Non appena l arsina gorgoglia nella soluzione contenuta nella cuvetta reagisce con il ditiocarbammato di argento per formare un complesso colorato secondo la seguente reazione. AsH 3 + 6Ag As C 2 H 5 C 2 H 5 C 2 H 5 N C 2 H 5 S S - N S S - + 6Ag + 3H + rosso 25
26 Oltre alle beute contenenti i campioni di cervo e di erba, ne furono preparate diverse altre contenenti concentrazioni note di arsenico ed anche una beuta contenente solo i reagenti ma non l arsenico. Tale campione viene chiamato bianco. Il complesso di arsenico intensamente colorato che si formò non appena l arsina gorgogliò nella soluzione piridinica di dietilcarbammato, assorbiva luce alla lunghezza d onda di 535 nm. Il grado di assorbimento della luce poteva essere usato per misurare la concentrazione della specie assorbente utilizzando uno strumento chiamato spettrofotometro. Come si può vedere, l intensità di colore delle soluzioni è proporzionale alla quantità di arsenico nei campioni. I valori di assorbanza di soluzioni standard a concentrazione nota registrati dallo spettrofotometro vennero utilizzati per tracciare una curva di calibrazione. 26
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