Effettori TAL e la tecnologia TALEN per la modifica sito-specifica del genoma (genome editing)

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1 Effettori TAL e la tecnologia TALEN per la modifica sito-specifica del genoma (genome editing)

2 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) l agente patogeno responsabile della macchiettatura bruna batterica e maculatura ad alone del peperone e pomodoro

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4 Gli Effettori TAL Gli Effettori TAL (Transcription activator like effectors, TALE) vengono iniettati nella cellula della pianta ospite attraverso la via di secrezione type III presente in numerosi batteri patogeni come Xanthomonas spp.; questi contribuiscono alla malattia o a scatenare la resistenza mediante il legame al DNA e attivando geni TALE-specifici della pianta ospite.

5 Tipi di secrezione delle proteine nei batteri

6 Apparato di secrezione di Type III del batterio patogeno Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Apparato di secrezione type IV del batterio patogeno Agrobacterium tumefaciens che lo utilizza per effettuare il trasferimento del T-DNA alla pianta ospite

7 Caratteristiche strutturali e funzionali dell effettore AvrBs3, il fondatore della famiglia TALE, secreto da Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) I TALEs hanno in comune: 1. Un N-terminus necessario per la secrezione typeiii (T3S) 2. Un C-terminus contenente segnali per la localizzazione nucleare (NLS) 3. Un dominio di attivazione acido tipico dei fattori di trascrizione (AAD) 4. Una regione centrale formata da ripetizioni quasi perfette di amminoacidi ciascuna, che termina con una ripetizione tronca di 20 aa

8 Le diverse ripetizione possono presentare delle variazioni, tuttavia, il maggior polimorfismo è presente nei residui 12 e 13, denominati repeat-variable diresidue (RVD). I diversi TALEs possono variare nel numero di ripetizioni (nell AvrBs3 sono 17,5)

9 I TALEs attivano geni TALE-specifici della pianta ospite (chiamati UPA per upregulated by AvrBs3 ) legandosi ad elementi conservati nel promotore dei geni target. AvrBs3 induce più di 20 geni nel peperone Il legame al DNA è mediato dalla regione ripetuta

10 Ciascun RVD ( repeatvariable diresidue ) si lega ad uno specifico nucleotide.

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12 Tentative model for TALE DNA association

13 Pianta suscettibile

14 Pianta resistente

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16 Sommario 1. Xanthomonas secerne membri della grande famiglia di effettori TAL che funzionano da attivatori trascrizionali nelle cellule della pianta. Si localizzano nel nucleo e modulano l espressione dei geni della pianta. 2. Nelle piante siscettibili, gli effettori TAL attivano l espressione dei geni per la suscettibilità per supportare la virulenza batterica. Nelle piante resistenti, gli effettori TAL inducono l espressione dei egni di resistenza, che determinano l induzione di specifiche reazioni di difesa. 3. Gli effettori TAL contengono NLSs, che mediano l ingresso nel nucleo della cellula vegetale, un AD C-terminal necessario per attivare l espressione dei geni della pianta, e un dominio ripetuto centrale che si lega direttamente al DNA. 4. La specificità degli effettori TAL è relegata nel dominio centrale nelle ripetizioni consecutive. Ciascuna ripetizione riconosce una coppia di basi del DNA. Due amminoacidi variabili alle posizioni 12 e 13 di ciascuna ripetizione determina il riconoscimento della coppia di basi del DNA. La disposizione consecutiva delle ripetizioni si lega ad una consecutiva sequenza di DNA sequence.

17 Applicazione biotecnologica di queste conoscenze: la tecnologia TALEN (che consente modificazioni e silenziamenti gene-specifici)

18 Sin dalla scoperta che una rottura specifica della doppia elica del DNA (double-strand break, DSB) aumenta la frequenza del riparo mediato dalla ricombinazione omologa (Rouet P, Smih F, Jasin M: Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: ) sono stati effettuati numerosi tentativi per migliorare l efficacia e la specificità delle nucleasi.

19 Nelle cellule il riparo delle DSB generate dalle nucleasi viene effettuatp mediante: 1. L unione non-omologa delle estremità ( non-homologous end-joining (NHEJ) che unisce le estremità rotte del DNA con modalità error-prone e quindi può causare la formazione di brevi delezioni o inserzione nel punto di rottura; 2. La ricombinazione omologa ( HR-based repair ), nella quale la DSB è precisamente ricostruita usando una sequenza omologa come stampo. NHEJ HR

20 I primi risultati importanti sono stati ottenuti con la tecnologia del zinc-finger nucleases (ZFNs), ovvero l unione del domino di legame al DNA dei fattori di trascrizione zing-finger ed il dominio catalitico di una nucleasi (FokI). (Urnov FD, Rebar EJ, Holmes MC, Zhang HS, Gregory PD: Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet 2010, 11: )

21 FokI è una nucleasi di tipo IIS isolata inizialmente dal batterio Flavobacterium okeanokoites. FokI è composta da due domini separati un dominio N- terminale per il legame al DNA (DNAbinding domain) e un dominio C-terminale per il taglio del DNA (DNA-cleavage domain). Il DNA-binding domain riconosce la sequenza non-palindromica 5 -GGATG-3 mentre il dominio catalitico taglia la doppia elica del DNA in modo non specifico ad una distanza di 9 e13 nucleotidi a valle del sito di legame FokI è attivo solo come dimero. Si ritiene che per formare un dimero funzionale, due molecole di FokI si legano ciascuna ad un sito del DNA e poi dimerizzano in modo che I due domini nucleasici formano una endonucleasi funzionale che taglia la doppia elica del DNA al sito specifico.

22 TALE-TF FokI endonucleasi

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25 TALENs: Transcription Activator-Like Effector Nucleases are a novel class of sequence-specific nucleases created by the fusion of transcription activator-like effectors (TALEs) to the catalytic domain of an endonuclease.

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27 Gene knock-out Gene knock-out is defined as the functional disruption of a gene s activity.

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29 Gene modification Gene tagging with an Integration Matrix near a TALEN recognition site. (A) DSB-stimulated HR at the TALEN cleaving site; (B) The gene tag to be integrated is in between the regions of homology. (C) Successful integration of a gene tag with TALEN technology.

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