Transgenesi dei mammiferi. Transgenesi dei mammiferi

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1 Transgenesi dei mammiferi

2 1980 La Corte Suprema Americana, durante il processo S.A. Diamond vs. A. M. Chakrabarty, stabilì che: tutto quello che esiste sotto il cielo, prodotto dalle mani dell uomo, inclusi quindi gli organismi modificati con le biotecnologie, è brevettabile. Ciò consentì alla Exxon di brevettare un microrganismo che mangia idrocarburi

3 1988 Phil Leder e Tim Stewart brevettarono il primo organismo transgenico multicelluare, il topo OncoMouse. OncoMouse Sequenze LTR del virus del tumore mammario murino (MMTV) e dell oncogene umano myc, codificante per un potente fattore di trascrizione umano.

4 Mammiferi transgenici : come si producono? 1) Vettori retrovirali 2) Microiniezione del DNA GFP 3) Manipolazione di Cellule ES

5 Requisiti generali per la produzione di organismi transgenici 1) Una metodica che consenta fisicamente di far entrare in contatto il transgene con il DNA dell organismo da trasformare. 2) Un sistema molecolare che consenta il trasferimento della molecola di DNA ricombinante nel genoma dell organismo ospite. 3) Un marcatore molecolare che l avvenuto trasferimento genico. 4) Un sistema di espressione all organismo da modificare. consenta del di transgene monitorare appropriato 5) Un sistema che consenta la trasformazione di tutte le cellule dell organismo bersaglio. Trasformazione di cellule della linea germinale Animali Piante Propagazione clonale di cellule totipotenti

6 b) Integrazione illegittima a) Ricombinazione omologa

7 Integrazione illegittima

8 1) I vettori retrovirali Ciclo vitale di un retrovirus Genoma a RNA, 2 copie. L enzima trascrittasi inversa converte l RNA in DNA a doppio filamento nel citoplasma della cellula infetta. Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato è chiamato provirus. L apparato della cellula ospite trascrive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mrna che da genomi e saranno impaccati nei nuovi virioni. 2 copie di RNA genomico vengono inserite in ogni virione.

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10 Struttura genomica ed espressione genica di un retrovirus Un tipico genoma retrovirale contiene 3 regioni : Gag (geni per componenti del core proteico del capside) Pol (geni per trascrittasi inversa, integrasi e proteasi) Env (geni per le proteine della superficie esterna)

11 Genoma retrovirale Trascrittasi inversa e integrasi Proteine strutturali capside Proteine per involucro Regione Psi+ non codificante ma indispensabile. per confezionamento dell RNA nel capside. Lunga sequenza terminale ripetuta (inserzione) Vettore retrovirale Inserito nelle cellule eucariotiche con bassissima efficienza tramite trasfezione o elettroporazione Lunghezza massima: 8Kb Con alta efficienza Mediante INFEZIONE

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13 Accoppiamento con maschio e prelievo di ovociti fecondati. Infezione in cellule in divisione (i retrovirus infettano solo queste). Impianto in una madre adottiva, resa pseudo gravida dall accoppiamento con un maschio vasectomizzato. Selezione dei topi transgenici (Southern blot o PCR su frammento di coda). Per incroci successivi si può ottenere una linea transgenica pura. 1) Vettori retrovirali

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15 Vettori Retrovirali Vantaggi Alta efficienza di trasduzione Svantaggi Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell ospite. Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma). Molecole di DNA di dimensioni limitate (8 Kb). Reazioni immunitarie. Costi elevati.

16 2) Microiniezione di DNA Gli organismi transgenici possono essere ottenuti modificando cellule embrionali totipotenti mediante iniezione di materiale genetico ricombinante. Promotore Pronucleo femminile Introne 1 2 ATG Pronucleo maschile poly-a * Iniezione di costrutti di espressione lineari, che si integrano spesso sotto forma di concatameri a partire dai primissimi stadi di sviluppo.

17 Stimolazione della ovulazione di femmine donatrici con iniezione di siero di cavalla gravida e, dopo 48h, di gonadotropina corionica umana. Si ottengono così fino a 35 ovuli per femmina. Le femmine superovulate vengono accoppiate con maschi e poi sacrificate per la raccolta delle uova fecondate. Prima della fusione dei nuclei si effettua la microiniezione del costrutto ricombinante nel pronucleo maschile, più grande e facile da localizzare. Impianto delle uova iniettate in una madre adottiva, resa pseudo - gravida dall accoppiamento con un maschio vasectomizzato. Selezione dei topi transgenici (Southern blot o PCR su frammento di coda). Per incroci successivi si può ottenere una linea transgenica pura. 2) Microiniezione di DNA

18 Microiniezione di DNA Vantaggi Possibilità di integrare costrutti più grandi di 8Kb. Costi relativamente bassi. Svantaggi Integrazione casuale del transgene. Mutagenesi inserzionale. Spesso integrazioni multiple e conseguente effetto tossico per l organismo accettore. Bassa efficienza di integrazione (50 transgenici per 1000 uova iniettate). Nonostante tutto è la metodica ad oggi più utilizzata per generare topi transgenici ed in generale mammiferi transgenici

19 Efficienza della microiniezione del DNA Nei topi al massimo il 5% degli ovuli inoculati genera prole transgenica.

20 Using the mammary gland as a bioreactor (see adjacent figure): Increase casein content in milk. Express lactase in milk (to remove lactose). Resistance to bacterial, viral, and parasitic diseases. Some exogenous proteins that have been expressed in the mammary glands of transgenic animals: Erythropoietin Factor IX Factor VIII Fibrinogen Growth hormone Hemoglobin Insulin Monoclonal antibodies Tissue plasminogen activator (TPA) α1-antitrypsin

21 Pesci transgenici AquAdvantage Salmon In normal salmon, the gene that controls the production of Growth Hormone is activated by light, so the fish generally grow only during the sunny summer months. But by attaching a constitutive "promoter sequence", Aqua Bounty ended up with salmon that make growth hormone all year round.

22 3) Manipolazione di Cellule staminali embrionali (ES cells)

23 3) Manipolazione di Cellule staminali embrionali (ES cells)

24 3) Manipolazione di Cellule staminali embrionali (ES cells)

25 3) Manipolazione di Cellule staminali embrionali (ES cells) Le cellule ES sono cellule embrionali pluripotenti, che possono dare origine a cellule di tutti i tessuti embrionali. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti (cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione Nodo embrionale

26 Come si coltivano le cellule ES? Le cellule del nodo embrionale si possono prelevare mediante l utilizzo di un micromanipolatore e possono essere messe in coltura su piastre contenenti un monostrato di cellule nutrici. Nodo embrionale Le cellule nutrici sono di solito cellule embrionali epidermiche, trattate in modo che non possano più dividersi. Tali cellule forniscono il substrato per l adesione ed il rilascio di nutrienti per le cellule ES. Le cellule ES, a differenza di molte altre linee cellulari animali, possono essere mantenute in coltura per molte generazioni. Blastocisti Cellule nutrici Embrione Cloni di ES in coltura

27 Cellule totipotenti Leukemia Inhibitory Factor (L. I. F.) Serum free medium neuroectoderma days BMP4 Epidermide Oct3/4, Fgf4, etc. mesoderma endoderma Sox-1 Cellule βpancreatiche Neuroni Cardiomiociti Muscolo liscio Eritrociti

28 Accoppiamento con maschio e prelievo di ovociti fecondati. Prelievo cellule del nodo embrionale. Allestimento della coltura di cellule ES. Trasformazione delle cellule ES mediante una delle tecniche convenzionali (Calcio Fosfato, Lipofezione o Elettroporazione. Arricchimento delle cellule trasformate mediante selezione (resistenza Neo). Microiniezione delle cellule ES trasformate in una nuova blastocisti ricevente. Il topo transgenico che si svilupperà dalla blastocisti manipolata sarà una chimera. Impianto in una madre adottiva, resa pseudo - gravida dall accoppiamento con un maschio vasectomizzato. Selezione dei topi transgenici (Southern blot o PCR su frammento di coda). Per incroci successivi si può ottenere una linea transgenica pura.

29 Introduzione di cellule ES nella blastocisti Cellule ES derivanti dalla blastocisti donatrice da Topo nero (oppure ES trasformate contenenti un transgene) Blastocisti ricevente da topo albino (oppure da topo wild-type) Chimera transgenica (nel caso delle cellule ES transgeniche l effetto chimera potrebbe essere non visibile)

30 Manipolazione di Cellule staminali embrionali (ES cells) Vantaggi Buona efficienza di integrazione Possibilità di utilizzare le metodiche di ricombinazione omologa e sito-specifica. Svantaggi Necessità di avere a disposizione delle linee cellulari ES. Mutagenesi inserzionale (se si sfrutta il meccanismo dell inserzione illegittima). Costi abbastanza elevati.

31 Types of Recombination Homologous - occurs between sequences that are nearly identical (e.g., during meiosis). Site-Specific - occurs between sequences with a limited stretch of similarity; involves specific sites.

32 Tipi di eventi di Ricombinazione

33 L esistenza della ricombinazione e della possibilità di trasformare le cellule ES in coltura prima dell impianto in una blastocisti rendono possibile le metodiche di Gene Targeting, cioè la sostituzione o l inserimento in punti precisi del genoma di una molecola di DNA con un altra. Nel caso dei mammiferi con genoma completamente sequenziato tale metodica consente di scegliere il sito esatto di inserzione/sostituzione. Questo consente di eliminare il problema dell effetto di posizione e della mutagenesi inserzionale. Come si produce un ceppo transgenico per Gene Targeting?

34 Costrutto per Gene Targeting in topi Sequenze di DNA per RICOMBINAZIONE OMOLOGA nel genoma bersaglio Gene che conferisce resistenza alla G418 TRANSGENE di interesse Geni della Timidina Kinasi (virus herpes simplex). In presenza di GANCICLOVIR: MORTE

35 ASPECIFICA SPECIFICA

36 ASPECIFICA SPECIFICA

37 ASPECIFICA SPECIFICA

38 SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA ASPECIFICA SPECIFICA 1) 2) Aggiunta di G418: SELEZIONE POSITIVA di cellule che hanno INTEGRATO il DNA Aggiunta di GANCICLOVIR: SELEZIONE NEGATIVA di cellule con INTEGRAZIONE ASPECIFICA

39 Accoppiamento con maschio e prelievo di ovociti fecondati. Prelievo cellule del nodo embrionale. Allestimento della coltura di cellule ES. Trasformazione delle cellule ES mediante una delle tecniche convenzionali (Calcio Fosfato, Lipofezione o Elettroporazione. Arricchimento delle cellule trasformate mediante doppia selezione (resistenza Neo + TK). Microiniezione delle cellule ES trasformate in una nuova blastocisti ricevente. Il topo transgenico che si svilupperà dalla blastocisti manipolata sarà una chimera. Impianto in una madre adottiva, resa pseudo - gravida dall accoppiamento con un maschio vasectomizzato. Selezione dei topi transgenici (Southern blot o PCR su frammento di coda). Per incroci successivi si può ottenere una linea transgenica pura.

40 Knock-In Knock-Out

41 La ricombinazione sito-specifica: il sistema Cre-lox Il limite principale dei topi transgenici Knock-Out (KO) per un gene e la possibile mortalità degli omozigoti durante lo sviluppo. Soluzione : l induzione della mutazione in modalità tempo e tessuto specifica.

42 Il sistema Cre-lox Sistema alla base della tecnica: Meccanismo di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox e la ricombinasi sito-specifica Cre. Cre Recombinase LoxP: locus di crossover (2 sequenze palindromiche di 13bp + regione centrale di 8bp) LoxP attira la ricombinasi CRE la quale ricombina le sequenze di DNA adiacenti.

43 Il sistema Cre-lox Sistema alla base della tecnica: Meccanismo di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox e la ricombinasi Cre. Lox Lox Lox Lox CRE Recombinase

44 Il sistema Cre-lox Con questo sistema si possono ottenere dei mutanti che perdono una data regione solo attivando la ricombinasi Cre. Per fare questo si devono costruire dei vettori con la regione genetica da eliminare fiancheggiata da siti Lox. Con questa strategia si possono ottenere topi transgenici per geni che sono letali in fasi diverse e soprattutto, con l espressione della ricombinasi Cre tessuto specifica, si può far avvenire il knock-out del gene solo in particolari tessuti dove si esprime o dove si induce Cre.

45 G418

46 I siti Lox derivano da fago P1 (non esistono nel genoma animale/vegetale) quindi non possibilità di ricombinazione in altri siti del genoma

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48 Il SISTEMA Cre-Lox permette il controllo dell espressione genica nello SPAZIO e nel TEMPO Utilizzo di un PROMOTORE TESSUTO SPECIFICO Utilizzo di un PROMOTORE: -dipendente dallo STADIO di SVILUPPO -INDUCIBILE

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51 Referenze 1) Curr Gene Ther Dec;9(6): State-of-the-art lentiviral vectors for research use: risk assessment and biosafety recommendations. Pauwels K, Gijsbers R, Toelen J, Schambach A, Willard-Gallo K, Verheust C, Debyser Z, Herman P. 2) Proc Natl Acad Sci U S A Dec;77(12): Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH. 3) Cell Feb 14;44(3): High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome. Thomas KR, Folger KR, Capecchi MR. 4) Science Sep 8;269(5229): Inducible gene targeting in mice. Kühn R, Schwenk F, Aguet M, Rajewsky K. 5) Transgenic Res Jun;19(3): Epub 2009 Sep 26. Zinc-finger nucleases: a powerful tool for genetic engineering of animals. Rémy S, Tesson L, Ménoret S, Usal C, Scharenberg AM, Anegon I.

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