Oncologica. Seminari di Ematologia. Sindromi mielodisplastiche NEL PROSSIMO NUMERO

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1 Editor in chief Giorgio Lambertenghi Deliliers Anno 6 Numero Seminari di Ematologia Oncologica NEL PROSSIMO NUMERO LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA Profilo genetico Leucemie secondarie Terapie innovative La malattia in età pediatrica Sindromi mielodisplastiche EDIZIONI INTERNAZIONALI srl Edizioni Medico Scientifiche - Pavia

2 Sindromi mielodisplastiche Il percorso diagnostico 5 GIAN MATTEO RIGOLIN, GIANLUIGI CASTOLDI, FRANCESCO CAVAZZINI, ANTONIO CUNEO La sindrome 5q- 25 FRANCESCO ALBANO, LUISA ANELLI Le terapie emergenti 37 VALERIA SANTINI, ALBERTO BOSI Il trapianto di cellule staminali emopoietiche 51 PAOLO ALESSANDRINO Vol. 6 - n Editor in Chief Giorgio Lambertenghi Deliliers Università degli Studi, Milano Editorial Board Sergio Amadori Università degli Studi Tor Vergata, Roma Mario Boccadoro Università degli Studi, Torino Alberto Bosi Università degli Studi, Firenze Federico Caligaris Cappio Università Vita e Salute, Istituto San Raffaele, Milano Antonio Cuneo Università degli Studi, Ferrara Marco Gobbi Università degli Studi, Genova Mario Petrini Università degli Studi, Pisa Giovanni Pizzolo Università degli Studi, Verona Giorgina Specchia Università degli Studi, Bari Direttore Responsabile Paolo E. Zoncada Registrazione Trib. di Milano n. 532 del 6 settembre 2007 La qualità di vita 60 FABIO EFFICACE, FRANCO MANDELLI Edizioni Internazionali srl Divisione EDIMES Edizioni Medico-Scientifiche - Pavia Via Riviera, Pavia Tel r.a. - Fax edint.edimes@tin.it

3 2 Periodicità Quadrimestrale Scopi Seminari di Ematologia Oncologica è un periodico di aggiornamento che nasce come servizio per i medici con l intenzione di rendere più facilmente e rapidamente disponibili in formazioni su argomenti pertinenti l ematologia oncologica. Lo scopo della rivista è quello di as sistere il lettore fornendogli in maniera esaustiva: a) opinioni di esperti qualificati sui più recenti progressi in forma chiara, aggiornata e concisa; b) revisioni critiche di argomenti di grande rilevanza pertinenti gli interessi culturali degli specialisti interessati; NORME REDAZIONALI 1) Il testo dell articolo deve essere editato utilizzando il programma Microsoft Word per Windows o Macintosh. Agli AA. è riservata la correzione ed il rinvio (entro e non oltre 5 gg. dal ricevimento) delle sole prime bozze del lavoro. 2) L Autore è tenuto ad ottenere l autorizzazione di «Copyright» qualora riproduca nel testo tabelle, figure, microfotografie od altro materiale iconografico già pubblicato altrove. Tale materiale illustrativo dovrà essere riprodotto con la dicitura «per concessione di» seguito dalla citazione della fonte di provenienza. 3) Il manoscritto dovrebbe seguire nelle linee generali la seguente traccia: Titolo Conciso, ma informativo ed esauriente. Nome, Cognome degli AA., Istituzione di appartenenza senza abbreviazioni. Nome, Cognome, Foto a colori, Indirizzo, Telefono, Fax, del 1 Autore cui andrà indirizzata la corrispondenza. Introduzione Concisa ed essenziale, comunque tale da rendere in maniera chiara ed esaustiva lo scopo dell articolo. Parole chiave Si richiedono 3/5 parole. Corpo dell articolo Il contenuto non deve essere inferiore alle 30 cartelle dattiloscritte (2.000 battute cad.) compresa la bibliografia e dovrà rendere lo stato dell arte aggiornato dell argomento trattato. L articolo deve essere corredato di illustrazioni/fotografie, possibilmente a colori, in file ad alta risoluzione (salvati in formato.tif,.eps,.jpg). Le citazioni bibliografiche nel testo devono essere essenziali, ma aggiornate (non con i nomi degli AA. ma con la numerazione corrispondente alle voci della bibliografia), dovranno essere numerate con il numero arabo (1) secondo l ordine di comparsa nel testo e comunque in numero non superiore a Bibliografia Seminari di Ematologia Oncologica Periodico di aggiornamento sulla clinica e terapia delle emopatie neoplastiche Per lo stile nella stesura seguire le seguenti indicazioni o consultare il sito International Committee of Medical Journal Editors Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals: Sample References. Es. 1 - Articolo standard 1. Bianchi AG, Rossi EV. Immunologic effect of donor lymphocytes in bone marrow transplantation. N Engl J Med. 2004; 232: Es. 2 - Articolo con più di 6 autori (dopo il 6 autore et al.) 1. Bianchi AG, Rossi EV, Rose ME, Huerbin MB, Melick J, Marion DW, et al. Immunologic effect of donor lymphocytes in bone marrow transplantation. N Engl J Med. 2004; 232: Es. 3 - Letter 1. Bianchi AG, Rossi AV. Immunologic effect of donor lymphocytes [Letter]. N Engl J Med. 2004; 232: Es. 4 - Capitoli di libri 1. Bianchi AG, Rossi AV. Immunologic effect of donor lymphocytes. In: Caplan RS, Vigna AB, editors. Immunology. Milano: MacGraw- Hill; 2002; p Es. 5 - Abstract congressi (non più di 6 autori) 1. Bianchi AG, Rossi AV. Immunologic effect of donor lymphocytes in bone marrow transplantation [Abstract]. Haematologica. 2002; 19: (Suppl. 1): S178. Ringraziamenti Riguarda persone e/o gruppi che, pur non avendo dignità di AA., meritano comunque di essere citati per il loro apporto alla realizzazione dell articolo. Edizioni Internazionali Srl Divisione EDIMES EDIZIONI MEDICO SCIENTIFICHE - PAVIA Via Riviera, Pavia Tel r.a. Fax edint.edimes@tin.it

4 3 Editoriale GIORGIO LAMBERTENGHI DELILIERS Università degli Studi di Milano U.O. Ematologia 1 - Centro Trapianti di Midollo Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico, Mangiagalli e Regina Elena Seminari di Ematologia Oncologica propone in questo numero le principali acquisizioni che in quest ultimo decennio hanno modificato la storia naturale delle sindromi mielodisplastiche, malattie che nonostante la loro eterogeneità clinica hanno in comune la clonalità staminale, l emopoiesi inefficace e la predisposizione all evoluzione leucemica. Le anomalie morfologiche sia periferiche che midollari rappresentano il segno precoce di un disordine complesso che richiede una più precisa definizione diagnostica e prognostica. Oggi questo è possibile grazie all introduzione di strumenti come la citofluorimetria, la citogenetica e la biologia molecolare, che hanno portato al riconoscimento di specifiche entità cliniche (come la sindrome 5q-), alla valutazione del rischio evolutivo basata su nuovi parametri e alla modificazione dei criteri di eligibilità al trapianto di cellule staminali. Ma l approccio medico verso queste malattie è sostanzialmente cambiato grazie anche a farmaci, come la 5-azacitidina, che agiscono bloccando gli enzimi implicati nella metilazione del DNA, responsabile del silenziamento di geni che intervengono in molti processi fisiologici, ed agli analoghi della talidomide (in particolare la lenalidomide) in grado di inibire la secrezione di citochine proinfiammatorie, responsabili della neo-angiogenesi e dell eccesso di apoptosi. La loro efficacia è ormai dimostrata da studi internazionali randomizzati che hanno evidenziato un significativo prolungamento della sopravvivenza e un ritardo della progressione verso la leucemia mieloide acuta. Ma la scelta della strategia terapeutica più opportuna non può prescindere da altri obiettivi come la valutazione della qualità di vita offerta dai nuovi farmaci, l utilizzazione di fattori di crescita in grado di stimolare l eritropoiesi e la megacariocitopoiesi normale residua, e la possibilità di ridurre i rischi legati al sovraccarico di ferro secondario alle ricorrenti emotrasfusioni.

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6 5 Il percorso diagnostico GIAN MATTEO RIGOLIN, GIANLUIGI CASTOLDI, FRANCESCO CAVAZZINI, ANTONIO CUNEO Ematologia, Azienda Ospedaliero Universitaria, Arcispedale S. Anna, Ferrara Gian Matteo Rigolin n INTRODUZIONE Le sindromi mielodisplastiche (SMD) sono un gruppo eterogeneo di neoplasie emopoietiche caratterizzate da emopoiesi clonale ed inefficace, alterazioni morfologiche displastiche a carico delle principali filiere emopoietiche, citopenia periferica, progressiva insufficienza midollare ed un aumentato rischio di progressione in leucemia acuta mieloide (LAM) (1). La sopravvivenza dei pazienti affetti da SMD varia da alcuni mesi a diversi anni per cui risulta di primaria importanza avere a disposizione un sistema classificativo e di valutazione prognostica che permettano di predire la probabilità di sopravvivenza e di evoluzione in LAM allo scopo di definire il più corretto approccio terapeutico (2). n SISTEMI CLASSIFICATIVI E PROGNOSTICI Diversi sistemi classificativi e prognostici sono stati elaborati al fine di predire la sopravvivenza ed il rischio di trasformazione in LAM dopo la diagnosi di SMD. Parole chiave: sindromi mielodisplastiche, diagnosi, prognosi. Indirizzo per la corrispondenza Prof. Antonio Cuneo Ematologia, Azienda Ospedaliero Universitaria Arcispedale S. Anna Corso Giovecca, Ferrara cut@unife.it Il primo sistema classificativo fu proposto dal gruppo Franco Americano Britannico (FAB) nel 1982 e si basava sulla determinazione della percentuale di blasti midollari e la presenza di caratteristiche morfologiche di displasia a livello midollare e del sangue periferico (Tabella 1) (3). La classificazione FAB, che è stata utilizzata per circa 2 decadi, ha fornito anche importanti informazioni prognostiche ma non permetteva di predire in modo preciso la sopravvivenza o la probabilità di trasformazione in LAM nei singoli pazienti. Nel 1999, allo scopo di meglio rispondere a queste esigenze prognostiche e prendendo in considerazione anche nuovi parametri biologici quali l esame del cariotipo, è stato proposto un sistema prognostico a punteggio (International Prognostic Scoring System - IPSS) (Tabella 2-3) che ha fornito in modo prospettico una valutazione della probabilità di sopravvivenza e del rischio di trasformazione in LAM. Esso si basa sulla valutazione di 3 parametri: il numero di citopenie all esame emocromocitometrico, la percentuale di blasti midollari e l analisi citogenetica, che permettono di identificare 4 diversi gruppi prognostici: Low, intermediate-1, intermediate-2 e high con sopravvivenze e probabilità di evoluzione in LAM completamente differenti (4). Nel 2001, l organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha proposto una revisione dei criteri diagnostici FAB (5, 6). Tra le principali novità di questa classificazione vi sono: 1) la riduzione della percentuale di blasti per la diagnosi di LAM dal 30 al 20% e la conseguente eliminazione della categoria AREB-t e la esclusione della LMMC dai disordini mielodi-

7 6 Seminari di Ematologia Oncologica Sangue periferico (SP) e midollo (MO) AR ARSA AREB AREB-t LMMC Blasti Sangue Periferico (%) <1 <1 <5 >5 <5 Midollo Osseo (%) <5 < Morfologia Diseritropoiesi ± ± Disgranulopoiesi ± ± + + ± Dismegacariocitopoiesi ± + + ± Conta monocitaria N N N N >1x10 9 /l Reticolociti Eritrociti TABELLA 1 - Classificazione FAB. DDDDD DDDDD Leucociti N/D N/D D D/A Piastrine N/D N/D DDD Morfologia MO Cellularità N/A A A A A Diseritropoiesi Disgranulopoiesi ± ± Dismegacariocitopoiesi ± ± Sideroblasti ad anello (% Ebl totali) <3% >15% ± ± ± Evoluzione in leucemia 15% 15% 30-60% 100% 40% AR: Anemia refrattaria; ARSA: AR con sideroblasti ad anello; AREB: AR con eccesso di blasti; AREB-t: AREB in trasformazione leucemica; LMMC: Leucemia mielomonocitica cronica. N: normale; A: Aumentato; D: Diminuito. Parametro Score Numero di citopenie Cariotipo* Good Intermediate Poor - Blasti midollari < Citopenie: Hb <10 g/dl, plt <100x10 9 /L, conteggio assoluto dei neutrofili <1.8x10 9 /L. Cariotipo: Good = normale, Y, del(5q), del(20q), Poor = complesso ( 3 anomalie), anomalie del cromosoma 7, Intermediate = altre anomalie. TABELLA 2 - Sistema prognostico IPSS. Categoria IPSS Sopravvivenza Tempo mediano Morti per LAM mediana (anni) di evoluzione in LAM (anni) Low (score 0) % Intermediate 1 (score ) % Intermediate 2 (score ) % High (>=2.5) % TABELLA 3 - Gruppi di rischio IPSS: sopravvivenza e probabilità di evoluzione in LAM.

8 Il percorso diagnostico 7 splastici ed il suo inserimento in una nuova categoria di neoplasie mieloidi denominata disordini mielodisplastici mieloproliferativi; 2) la suddivisione dei pazienti con AREB nelle due forme AREB-1 con percentuale di blasti midollari tra il 5 ed il 9% e AREB-2 con percentuale di blasti midollari tra il 10 ed il 19%; 3) l introduzione di una subentità, la sindrome del 5 q-, con blasti midollari < 5% e con la presenza di una delezione isolata del braccio lungo del cromosoma 5 (7); 4) l introduzione di una nuova sub-entità, vale a dire la citopenia refrattaria con displasia multilineare con e senza sideroblasti ad anello (CRDM e CRDM-SA), mentre l anemia refrattaria e l anemia refrattaria con sideroblasti ad anello sono stati definiti come quadri in cui la displasia interessa la sola filiera eritroide; 5) l identificazione di una categoria di SMD non classificabili (SMD-NC) per i pazienti che non soddisfacevano i criteri delle altre entità. Questa nuova classificazione presenta importanti implicazioni cliniche in quanto ad esempio prende atto del fatto che i pazienti con displasia unilineare hanno una prognosi più favorevole rispetto a quelli con displasia multilineare (8, 9) e rispondono meglio al trattamento con eritropoietina (10-12). Patologia Sangue periferico Midollo Citopenia refrattaria con displasia Citopenia unilineare o bilineare* Displasia unilineare; >=10% delle cellule unifilare (CRDU) Assenza o rari blasti <1% della linea interessata Anemia refrattaria (AR) Blasti <5% Neutropenia refrattaria (RN) Piastrinopenia refrattaria (RT) Anemia refrattaria con sideroblasti Anemia Solo displasia eritroide ad anello (ARSA) Assenza di blasti Blasti <5% Sideroblasti ad anello >=15% Citopenia refrattaria con displasia Citopenie Displasia >10% delle cellule in 2 o più multifilare Assenza o rari blasti <1% linee mieloidi Assenza di corpi di Auer Assenza di corpi di Auer Monociti <1x10 9 /L Sideroblasti ad anello +/-15% Anemia refrattaria con eccesso Citopenie Displasia unilineare o multilineare di blasti - 1 (AREB-1) Blasti <5% Blasti 5-9% Assenza di corpi di Auer Assenza di corpi di Auer Monociti <1x10 9 /L Anemia refrattaria con eccesso Citopenie Displasia unilineare o multilineare di blasti - 2 (AREB-2) Blasti 5-19% Blasti 10-19% Corpi di Auer +/-# Corpi di Auer +/-** Monociti <1x10 9 /L SMD non classificabili (SMD-NC) Citopenie Displasia non equivoca in <10% delle Assenza o rari blasti <1% cellule in una o più linee mieloidi Assenza di corpi di Auer Blasti <5% SMD associate a del(5q) isolata Anemia Megacariociti con nucleo ipolobulato Assenza o rari blasti <1% normali o aumentati Conteggio piastrinico di solito Blasti <5% normale o aumentato Isolata del(5q) Assenza di corpi di Auer *Occasionalmente può essere presente. I casi con pancitopenia vanno classificati tra le SMD-NC. **Se i criteri per la diagnosi sono soddisfatti e sono presenti i corpi di Auer i pazienti dovrebbero essere sempre classificati come AREB-2. Se i blasti midollari sono <5% ma ci sono 2-4% di blasti nel sangue periferico, la diagnosi è AREB-1. Se la percentuale di blasti midollari è <5% ed i blasti nel sangue periferico sono l 1%, la diagnosi è SMD-NC. # I casi con corpi di Auer e blasti <5% nel sangue periferico e <10% nel midollo sono classificati come AREB-2. TABELLA 4 - Classificazione OMS 2008.

9 8 Seminari di Ematologia Oncologica Parametro Score Categoria OMS AR, ARSA, 5q- CRDM, CRDM-SA AREB-1 AREB-2 Cariotipo* Favorevole Intermedio Sfavorevole Richiesta trasfusionale di GRC** no Regulare Cariotipo: Favorevole = normale, Y, del(5q), del(20q), Sfavorevole= complesso ( 3 anomalie), anomalie del cromosoma 7, Intermedio = altre anomalie. **Richiesta trasfusionale di GRC = 1 trasfusione di GRC ogni 8 settimane in 4 mesi. TABELLA 5 - Parametri utilizzati nel sistema prognostico basato sulla classificazione OMS (WPSS) (15). Categoria WPSS TABELLA 6 - WPSS: sopravvivenza e probabilità di progressione in LAM. (15) Probabilità cumulative di progressione in LAM Sopravvivenza mediana Mesi 2 anni 5 anni Very low (score 0) Low (score 1) Intermediate (score 2) High (score 3 e 4) Very high (score 5 e 6) Nel 2008 la classificazione OMS è stata rivista (13, 14) e tra le modificazioni più significative (Tabella 4) vi sono l inglobamento della CRDM con e senza sideroblasti ad anello in una unica singola entità ed il riconoscimento di 3 distinte subentità con displasia unilineare: l anemia refrattaria (AR), la neutropenia refrattaria (NR) e la trombocitopenia refrattaria (TR). Al fine di enfatizzare il significato prognostico dell incremento della percentuale di blasti nel sangue periferico è stato inoltre deciso di includere i casi con 2-4% di blasti nel sangue periferico e meno del 5% di blasti a livello midollare nel gruppo AREB-1 mentre i pazienti con 5-19% di blasti nel sangue periferico e blasti midollari tra il 10-19% sono stati classificati come AREB-2. Nella classificazione 2008 della OMS è stata inoltre introdotta una entità provvisoria allo scopo di enfatizzare un quadro di SMD con caratteristiche peculiari che viene osservato principalmente nell infanzia e definito Citopenia refrattaria dell infanzia. Questi pazienti mostrano una percentuale di blasti nel sangue periferico inferiore al 2% e nel midollo inferiore al 5%, citopenie persistenti associate a displasia in almeno 2 filiere con un quadro midollare generalmente ipoplastico. In assenza di anomalie citogenetiche queste forme non sono facilmente differenziabili dall anemia aplastica, dalle sindromi congenite con insufficienza midollare e talora anche dalle CRDM come definite nell adulto. Le SMD dell infanzia con percentuali di blasti tra il 2-19% nel sangue periferico e 5-19% nel midollo vanno invece classificate come le forme dell adulto. Infine, recentemente è stato introdotto un nuovo sistema prognostico dinamico che basandosi sulla classificazione OMS e valutando l analisi citogenetica e la richiesta di supporto trasfusionale (Tabella 5) permette di classificare i pazienti in 5 distinti gruppi di rischio che predicono in modo accurato, in ogni momento durante il decorso della malattia, la probabilità di sopravvivenza e di progressione in LAM (Tabella 6: WHO classificationbased prognostic scoring system - WPSS) (15). n DIAGNOSI Sangue periferico e midollo Il percorso che porta a formulare una diagnosi di SMD si avvale di numerosi strumenti quali l emo-

10 Il percorso diagnostico 9 cromo, l aspirato midollare, la biopsia ossea, l analisi citogenetica a cui più recentemente si sono aggiunte valutazioni di tipo citofluorimetrico e di biologia molecolare che integrandosi concorrono ad una sempre più precisa definizione diagnostica e prognostica di questi disordini. L emocromo è il primo e più semplice esame di laboratorio che permette di far sospettare un quadro di SMD. Il tipico paziente che giunge all osservazione del medico è un soggetto anziano con una età media di circa anni che presenta una o più citopenie, più frequentemente una anemia spesso di tipo macrocitico con bassi livelli di reticolociti, talora associata a neutropenia e/o piastrinopenia. Alcuni pazienti possono però presentare sintomi diversi quali sanguinamenti o sintomi legati ad una infezione o ad una patologia autoimmune (1). La diagnosi di SMD va pertanto distinta da altre cause di citopenia (Tabella 7). L esame al microscopio ottico dello striscio di sangue periferico, con determinazione della formula differenziale su almeno 200 elementi leucocitari, può dare informazioni molto utili per una diagnosi differenziale e nel caso delle SMD può mostrare accanto alla frequente macrocitosi la presenza di elementi blastici e di altre caratteristiche morfologiche cellulari di displasia quali neutrofili ipogranulati o ipolobati, piastrine giganti o ipogranulari, corpi di Pappenheim (16). Al fine di poter rilevare e valutare questi aspetti è tuttavia necessario che il preparato citologico sia adeguatamente allestito e colorato con colorazioni tipo May Grumwald Giemsa o similari (17). Il conteggio della percentuale di blasti mediante citometria a flusso non è invece raccomandato in sostituzione della determinazione visiva in quanto non tutte le cellule blastiche esprimono il CD34 e la diluizione del campione o artefatti legati alla sua manipolazione possono dare origine a risultati talora confondenti. L esame di un preparato citologico di aspirato midollare adeguatamente allestito rappresenta la più importante indagine diagnostica in un paziente con sospetta SMD (17). Accanto alla colorazione di May Grumwald Giemsa o similari deve sempre essere allestita anche una colorazione per la determinazione del ferro (reazione di Perls) per enumerare i cosiddetti sideroblasti ad anello. Per un accurato conteggio differenziale devono essere valutate almeno 500 cellule nucleate midollari. Devono Carenza di vit. B12 e folati Infezioni virali (HBV, HCV, CMV, Parvovirus B19, HIV, ecc.) Sostanze tossiche (antibiotici, chemioterapici, piombo, benzene) Anemia dell anziano non altrimenti spiegata Splenomegalia Patologie autoimmuni Anemia aplastica Leucemia acuta Mieloftisi Mielofibrosi - EPN Hairy Cell Leukemia Large Granular Lymphocyte Leukemia TABELLA 7 - Possibili diagnosi differenziali. Filiera Nucleare Citoplasmatica Eritroide Multinuclearità, carioressi, mitosi anomale, Vacuoli, difetti di emoglobinizzazione, megalobastosi sideroblasti ad anello Granulocitaria Forme pseudo-pelger, ipersegmentazione, Ipogranulazione, corpi di Dohle, vacuolizzazioni, nuclei ad anello, forme giganti, clumping difetti di mieloperossidasi cromatinico, granulociti binucleati Megacariocitaria Micromegacariociti, forme mononucleate, Asincronia nucleo/citoplasmatica, piastrine megacariociti con nuclei dispersi giganti, piastrine ipogranulate o granulate Monocitaria Ipersegmentazione, nuclei con forme Aumentata basofilia citoplasmatica, granulazioni bizzarre prominenti TABELLA 8 - Caratteristiche morfologiche di displasia (18).

11 10 Seminari di Ematologia Oncologica essere inoltre considerate la cellularità midollare, il rapporto mielo-eritroide e la percentuale di blasti. Se il rapporto mielo-eritroide è 1 a 1 o minore, dovrebbero essere contate 500 cellule non eritroidi escludendo i linfociti, le plasmacellule e le mastcellule. Nel caso di rapporto mielo-eritroide pari a 1 od inferiore la percentuale di blasti viene valutata sulla componente non eritroide. Il midollo è generalmente iper- o normocellulato anche se in alcuni casi può essere ipocellulato. Per una diagnosi di SMD almeno il 10% delle cellule di una data filiera deve mostrare una chiara displasia (Tabella 8). Poiché il sistema di classificazione si basa, oltre che sulla valutazione delle alterazioni displastiche, anche sulla determinazione della percentuale delle cellule blastiche, il loro preciso riconoscimento è di primaria importanza per l attribuzione dei singoli casi alle diverse subentità, che come visto rivestono un rilevante significato prognostico (Figure 1 e 2). La determinazione della percentuale di blasti ha un ruolo importante nella discriminazione tra SMD e LAM. I mieloblasti sono riconosciuti sulla base di diverse caratteristiche nucleari tra cui l elevato rapporto nucleo-citoplasmatico, la presenza di nucleoli facilmente identificabili e la fine cromatina nucleare. La forma del nucleo può essere variabile. Il citoplasma è basofilo e in esso possono essere riconoscibili o meno granuli o corpi di Auer mentre la zona del Golgi non è evidente. L eccezione a questa regola è data dalla LAM con t(8;21) dove i blasti possono presentare una piccola distinta zona di Golgi con o senza corpi di FIGURA 1 - Displasia eritroide: (A) vaculizzazione citoplasmatiche, (B) ponti intercitoplasmatici. In (C) sideroblasti ad anello.

12 Il percorso diagnostico 11 FIGURA 2 - A. Blasto granulato a sinistra e blasto agranulato a destra. B. Elementi pseudo-pelger e clumping cromatinico nel sangue periferico. Auer, ma in assenza di altre caratteristiche del promielocito. Recentemente l International Working Group on Morphology of Myelodysplastic Syndrome (IWGM- SMD) ha revisionato una serie di midolli di SMD e ha formulato alcune raccomandazioni riguardanti l identificazione ed il conteggio dei blasti anche alla luce del fatto che l OMS non ha emanato raccomandazioni specifiche su questo aspetto e che la valutazione dei blasti midollari non è uniforme nella comune pratica clinica (19). L IWGM-SMD ha raccomandato che i mieloblasti siano inoltre classificati come granulati e non granulati. I blasti agranulati corrispondono ai blasti tipo I della classificazione FAB. I blasti granulati sono cellule che hanno le caratteristiche nucleari dei blasti ma hanno anche granulazioni citoplasmatiche: questi blasti includono i blasti tipo II della classificazione FAB ed i blasti tipo III come definiti da Goasguen (20). I blasti granulati devono essere differenziati dai promielociti. I normali promielociti presentano un nucleo in posizione centrale od eccentrica con cromatina fine od intermedia. Il nucleolo è generalmente ben riconoscibile e prominente. L IWGM- SMD ritiene che la principale caratteristica che permette di distinguere il promielocita sia la presenza di una zona di Golgi ben visibile. Altre caratteristiche del citoplasma comprendono granuli azzurrofili uniformemente dispersi, e nella maggior parte dei casi un citoplasma basofilo. I promielociti displastici presentano le caratteristiche del promielocito tra cui un nucleo ovale, o rotondo o indentato spesso in posizione eccentrica, una zona del Golgi visibile ed il nucleo con cromatina fine o grossolana ed un nucleolo ben visibile. Le anomalie che invece definiscono un promielocito come displastico sono una ridotta o irregolare basofilia citoplasmatica, una zona del Golgi poco sviluppata, una ipergranularità, una ipogranularità e una irregolare distribuzione dei granuli. Nelle SMD è utile pertanto individuare le seguenti categorie: promielociti normali, blasti granulati e non granulati e promielociti displastici (Tabella 9). La percentuale dei mieloblasti va determinata facendo un conteggio differenziale di almeno 500 cellule nucleate, con il totale che includa almeno 100 cellule non eritroidi per aumentare la precisione. La valutazione di questi numeri per la determinazione della percentuale di blasti è di particolare importanza soprattutto quando le cellule eritroidi superano il 50% e nei casi in cui il conteggio dei blasti è ai limiti per l attribuzione ad una diversa categoria di SMD con diverso impatto prognostico. Recentemente, in considerazione dell importante ruolo prognostico che riveste il riconoscimento delle ARSA rispetto alle altre forme di SMD con sideroblasti non ARSA e considerando alcune incertezze nella definizione di sideroblasti ad anello, l IWGM-SMD dopo aver rivisto numerosi casi di anemia sideroblastica ha inoltre definito dei precisi criteri per il riconoscimento dei sideroblasti ad anello (19). I sideroblasti ad anello devono rispondere ai seguenti criteri: avere almeno 5 granuli a distribuzione perinucleare, i granuli possono sia circondare l intero nucleo, sia essere localizzati in porzioni dell area perinucleare o coprire almeno un terzo del nucleo. Il Working Group ha inoltre definito 3 tipi di sideroblasti: tipo 1 (meno di 5 granuli di ferro nel citoplasma), tipo 2 (5 o più granuli di ferro, ma non in una distribuzione perinucleare), tipo 3 o sideroblasti ad anello (5 o più granuli in posizio-

13 12 Seminari di Ematologia Oncologica Aspetti cellulari Blasto non Blasto Promielocito Promielocito granulato granulato normale Displastico Nucleo Centrale di forma Centrale di forma Ovale, rotondo, Ovale, rotondo, variabile variabile indentato indentato Centrale od eccentrico in posizione eccentrica Cromatina fine fine Fine od intermedia Fine o grossolana Nucleolo Ben riconoscibile Ben visibile Zona Golgi Non evidente Non evidente Ben visibile Presente ma poco sviluppata Granuli Non visibili Presenti Azzurrofili irregolare presenza (talora corpi di Auer) uniformemente e distribuzione dispersi Citoplasma basofilo basofilo basofilo Basofilia ridotta ed irregolare TABELLA 9 - Principali criteri morfologici per la definizione dei blasti e dei promielociti. ne perinucleare, che circondano il nucleo o interessano almeno un terzo della circonferenza nucleare). Nel conteggio dei sideroblasti ad anello, occorre valutare almeno 100 precursori eritroidi nei vari stadi maturativi. La percentuale di sideroblasti ad anello ai fini della classificazione rimane il 15% come per la classificazione FAB e OMS. Analisi citogenetica L analisi citogenetica midollare è una indagine essenziale che è indicata non solo a scopo diagnostico per individuare le caratteristiche anomalie cromosomiche ma anche per l importante ruolo nella definizione della prognosi. Per consenso si ritiene che debbano essere analizzate almeno metafasi midollari. Il cariotipo deve essere riportato secondo le linee guida ISCN (21). Sulla base di queste linee guida si definisce clone la presenza di 2 cellule midollari che mostrano una anomalia strutturale od acquisizione di materiale cromosomico o di almeno 3 cellule midollari che presentino la stessa perdita di materiale cromosomico. Un cariotipo complesso è invece definito dalla presenza di almeno 3 lesioni citogenetiche clonali indipendenti in almeno 2 cellule. Durante il follow-up, il cariotipo dovrebbe essere ripetuto in caso di progressione ad almeno 6-12 mesi di distanza Nei casi dubbi (per esempio in caso di ridotto numero di metafasi) viene raccomandata, per l eventuale dimostrazione di una anomalia clonale, l indagine FISH in interfase (17) che includa almeno le sonde per studiare le seguenti regioni cromosomiche: 5q31, CEP7, 7q31, CEP8, 20q, CEPY, e p53. In caso di presenza di piccole percentuali di positività l analisi dovrebbe essere ripetuta. L utilizzo di una tecnica più sensibile quale la FISH permette inoltre di riscontrare anomalie citogenetiche in casi in cui, all analisi citogenetica convenzionale, il cariotipo risulti normale per i limiti tecnici di questa tecnica d indagine (lesioni citogenetiche occulte, piccoli cloni, monitoraggio malattia minima residua) (22). Il limite principale della FISH è che essa può tuttavia rilevare solo le lesioni genetiche per le quali vengono testate specifiche sonde di interesse. In casi selezionati, in mancanza di materiale midollare l indagine FISH può essere eseguita su cellule di sangue periferico pur considerando che un risultato negativo non esclude la presenza di anomalie citogenetiche. Alterazioni cromosomiche sono dimostrabili nel 40-70% dei pazienti con SMD di tipo clonale mentre l incidenza delle anomalie cromosomiche nelle forme secondarie si aggira attorno al 90% (23-26). Le delezioni cromosomiche sono le anomalie più frequentemente osservate, ma anche le perdite o le acquisizioni di interi cromosomi; le traslocazioni sono osservate con minore frequenza (Tabella 10). Nei pazienti con SMD secondarie a trattamenti

14 Il percorso diagnostico 13 Aberrazioni non bilanciate (acquisizione o perdita di materiale cromosomico) Anomalie strutturali (traslocazioni reciproche bilanciate, inversioni, inserzioni) ^del(5q) - monosomia % Traslocazioni bilanciate 6% ^del(7q) - monosomia % ^t(3;21)(q26;q21) ^Monosomia 17/17p- 1-7% ^inv(3)(q21;q26) ^der/del(11q) 3% ^t(11;16)(q23;p13.3) ^del(12p) 2-6% ^t(1;3)(p36.3;q21.1) ^del(13q)/ -13 2% ^t(2;11)(p21;q23) ^iso17q 1-3% ^t(6;9)(p23;q34) ^del(9q) 0,5-1% ^t(12p) ^idic(x)(q13) 0,5-1% Trisomia % Del20q 4-14% Monosomia Y 3-10% Trisomia % Trisomia 21 2% ^Anomalie complesse (> di 3 cromosomi) 10-20% ^Anomalie cromosomiche ricorrenti considerate come evidenza presuntive per una diagnosi di SMD in presenza di una persistente citopenia in assenza di una definitiva diagnosi morfologica di SMD. TABELLA 10 - Anomalie citogenetiche. chemioterapici includenti alchilanti il cariotipo risulta nella maggior parte dei casi complesso con anomalie che interessano nel 90% dei casi i cromosomi 5 e 7 (Monosomia del 7, 7q-, monosomia del 5, e 5q-). Nel caso di trattamento con inibitori delle topoisomerasi si osservano spesso alterazioni a carico del cromosoma 11q23 (25). In questi pazienti si possono inoltre osservare traslocazioni non bilanciate che invece sono rare nelle forme primitive. Il riscontro di una lesione citogenetica può rivestire anche un ruolo diagnostico. Non esistono lesioni citogenetiche patognomoniche delle SMD essendo molte delle lesioni riscontrabili anche ad esempio nelle LAM specialmente dell anziano (23). Alcune anomalie ricorrenti sono state recentemente riconosciute come evidenza presuntiva per una diagnosi di SMD in presenza di una citopenia persistente in assenza di una diagnosi morfologica definitiva (14). Altre anomalie citogenetiche quali del(20q), +8, non sono invece considerate specifiche essendo state riportate in pazienti con anemia aplastica o altre sindromi citopeniche che rispondono bene alla terapia immunosoppressiva e/o non mostrano evidenza morfologica di SMD in un lungo follow-up (27-29). La perdita del cromosoma Y nelle cellule emopoietiche sarebbe invece un fenomeno associato all invecchiamento (30). Pertanto non è ancor chiaro se queste anomalie sono necessariamente indicative di SMD quando le caratteristiche morfologiche non sono conclusive. La valutazione del cariotipo alla diagnosi è stata inserita in molti sistemi prognostici (IPSS, WPSS) e riveste anche importanza per la risposta al trattamento con nuovi farmaci biologici quali ad esempio la lenalidomide nella sindrome del 5q- (31) o di pazienti che ricevono trattamenti intensivi (32). In particolare nell IPSS, sulla base del tipo e del numero di anomalie sono stati identificati tre gruppi citogenetici a diversa prognosi e rischio di progressione in LAM. Il riscontro di un cariotipo normale, la perdita del cromosoma Y, ed una delezione isolata del 5q o del 20q configurano un gruppo di pazienti a basso rischio mentre la presenza di un cariotipo complesso o il riscontro di anomalie coinvolgenti il cromosoma 7 identificano un gruppo di pazienti ad alto rischio. Tutte le altre anomalie vengono considerate a rischio intermedio (4). Questi stessi criteri come visto in precedenza sono stati utilizzati anche nel sistema prognostico basato sulla classificazione OMS (WPSS) (15). Sindrome del 5q Nella classificazione della OMS è stata introdotta una nuova entità denominata sindrome del 5q-

15 14 Seminari di Ematologia Oncologica FIGURA 3 - Megacariociti monolobati in corso di sindrome del 5q-. caratterizzata da una percentuale di blasti midollari <5%, assenza di corpi di Auer, piastrinosi, tipica displasia megacariocitaria (megacariociti ipomonolobati, Figura 3), anemia macrocitica, e la presenza di una isolata delezione del braccio lungo del cromosoma 5 (7). Questi pazienti sono prevalentemente donne e presentano un basso rischio di progressione in LAM (10%) e quindi una prognosi più favorevole delle altre forme di SMD (33). È oggi di fondamentale importanza riconoscere questa forma di SMD poiché recentemente è stato dimostrato che la lenalidomide è in grado di determinate una indipendenza trasfusionale nei due terzi di questi pazienti con molte risposte citogenetiche e talora anche remissioni citogenetiche complete (31). È da sottolineare come anche altre forme di SMD con una del5q isolata od in associazione ad altre anomalie possono rispondere al trattamento con lenalidomide (34). Sulla base di questi risultati la lenalidomide è stata approvata dalla US Food and Drug Administration per il trattamento delle SMD trasfusioni dipendenti con rischio basso ed intermedio- 1 e delezione del 5q con o senza anomalie citogenetiche aggiuntive. Analisi molecolare e mutazioni puntiformi Le indagini di tipo molecolare rivestono attualmente un ruolo ancora in via di definizione nell inquadramento diagnostico delle SMD. Molte delle recenti acquisizioni in campo molecolare hanno consentito di chiarire alcuni importanti aspetti nella fisiopatologia di queste forme (35). Tra le metodiche molecolari che oggi vengono utilizzate nel campo dell oncoematologia vi è lo studio dei profili di espressione genica (GEP) con i microarray. Per quanto attiene alle SMD lo studio dei GEP ha evidenziato come una principale caratteristica delle cellule staminali nelle SMD sia una upregolazione degli interferon stimulated genes (ISG) quali IFIT1, IFIT4 e IFITM1 che si ritiene possano avere un ruolo nella fisiopatologia della malattia ed in particolare nel contribuire al quadro di citopenia periferica (36). Caratteristici profili di espressione genica sono stati osservati nei pazienti con ARSA (upregolazione di geni correlati ai mitocondri tra cui quelli coinvolti nella sintesi dell eme quali ALAS2) e con sindrome del 5q- nei quali si è osservata una upregolazione di geni istonici del cluster di geni HIST1 sul cromosoma 66p21 e di geni correlati al citoscheletro actinico ed una downregolazione di geni assegnati alla commonly deleted region (CDR) sulla regione 5q tra i quali SPARC e RPS14 (37). Nel complesso tuttavia l accuratezza diagnostica ottenuta con l uso dei GEP si aggira attorno al 50% (38). La valutazione dei GEP pertanto, pur molto promettente, necessita di ulteriori studi per meglio definirne l impatto diagnostico e prognostico. Recentemente è stato poi dimostrato con una tecnica di RNA silencing che la perdita parziale della funzione di RPS14 (ribosomal subunit protein RPS14) potrebbe avere un ruolo nella patogenesi della sindrome del 5q- e di forme congenite di insufficienza midollare (39). In certe condizioni cliniche l analisi mutazionale può invece rivestire un ruolo diagnostico. Un esempio è rappresentato dallo studio delle mutazioni di JAK2, ed in particolare della mutazione V617F, nelle SMD con caratteristiche mieloproliferative quali ad esempio la ARSA con trombocitosi (ARSA-T) (40-42) e in alcuni pazienti con del5q (43). Altre anomalie possono essere riscontrate nelle SMD ma il loro impatto diagnostico appare attualmente meno significativo e più legato ad una evoluzione prognostica sfavorevole (Tabella 11). Un ulteriore aspetto che sta emergendo è inoltre legato alla dimostrazione in alcuni pazienti della presenza di una disomia uniparentale e di microdelezioni mediante SNP (single nucleotide poli-

16 Il percorso diagnostico 15 Mutazione Frequenza approssimativa RUNX1/LAM1 2-25% (in fase di SMD avanzata) N-RAS 10-45% TP % JAK-2 5% FLT3 (FMS-like 5% (spesso come ITD - tyrosine kinase 3) internal tandem duplication) MLL 5% PTPN11 rara (nelle forme di SMD degli adulti) TABELLA 11 - Distribuzione della frequenza delle mutazioni puntiformi. morphisms) microarray analysis che potrebbe permettere di individuare, ad esempio, quei pazienti con cariotipo normale e supposta prognosi favorevole che invece avranno una evoluzione più rapidamente progressiva (44). Recentemente, dati di grande significato hanno documentato come oltre alle sindromi mieloproliferative, altre neoplasie mieloidi, e tra queste le mielodisplasie, possano recare mutazioni del gene TET2 come momento patogenetico precoce (45). Esame istologico del midollo L esame istologico del midollo è oggi raccomandato in tutti i casi di sospetta SMD poiché fornisce informazioni importanti relativamente a diversi aspetti quali la cellularità globale, la percentuale di blasti CD34+, la presenza di ALIP (abnormally localized immature myeloid precursors), la fibrosi midollare, l aumentata angiogenesi. Per una adeguata valutazione diagnostica il campione di biopsia ossea è generalmente ottenuto dalla spina iliaca postero superiore e deve essere di lunghezza adeguata (1,5 cm). Il campione deve quindi essere adeguatamente decalcificato, ed incluso. Le colorazioni raccomandate sono l ematossilina ed eosina, il Giemsa, il blu di Prussia, la naftol AS- D cloroacetato esterasi (CAE), e l impregnazione argentica di Gomori (17). Per valutare correttamente la cellularità è importante effettuare una correzione per l età come proposto da Tuzuner and Bennett (46, 47). Nei casi di sospetta SMD è inoltre sempre raccomandata una valutazione di tipo immunoistochimico che utilizzi come pannello minimo di marcatori il CD34, un marcatore megacariocitario e la triptasi (un antigene correlato alle mastcellule). In casi specifici possono poi essere utilizzati altri marcatori quali il CD3, CD20, CD25, CD117 (17). Per la valutazione della percentuale di blasti l approccio migliore è contare le cellule progenitrici CD34 positive (48). La valutazione della percentuale di blasti utilizzando il CD34 può risultare difficoltosa nei casi in cui i blasti siano CD34 negativi e nei pazienti con aumentata densità microvascolare poiché le cellule endoteliali esprimono il CD34. In questi casi la valutazione concomitante del CD117, della mieloperossidasi e del lisozima può fornire utili informazioni. La valutazione istologica del midollo consente inoltre di determinare la presenza degli ALIP che rivestono un importante valore dal punto di vista diagnostico e prognostico (49). Una SMD ALIP positiva presenta almeno 3 aggregati (più di 5 precursori mieloidi) o cluster (da 3 a 5 precursori mieloidi) nelle sezioni tissutali. Il CD34 si è dimostrato utile anche per il riconoscimento degli ALIP, termine che per una maggior precisione oggi si tende a sostituire con accumulazioni multifocali di cellule progenitrici CD34+ poiché talora questi aggregati possono essere osservati in vicinanza di vasi o superfici endosteali il che differisce rispetto alla classica definizione di ALIP (non vicinanza a vasi e superfici endosteali) (17). I marcatori megacariocitari sono utili per un più agevole riconoscimento dei megacariociti talora visibili in aggregati o cluster e delle loro anomalie morfologiche e di distribuzione (50). Un ulteriore aspetto che può essere valutato con la biopsia ossea è la presenza di fibrosi midollare (51). La diagnosi nelle forme con fibrosi midollare non è agevole in quanto l aspirato midollare risulta ipocellulato e non adeguato per la valutazione della morfologia e della percentuale di blasti. Le forme di SMD con fibrosi devono essere distinte da altre neoplasie mieloidi con mielofibrosi quali la panmielosi acuta con mielofibrosi e la leucemia acuta megacariocitica. Per la mancanza di criteri universalmente accettati le forme di SMD con mielofibrosi non sono state incluse nella classificazione 2008 della OMS nella quale è stato invece raccomandato di subclas-

17 16 Seminari di Ematologia Oncologica sificare questi pazienti secondo le linee guida per le SMD seguite dal termine con mielofibrosi (14). Recentemente è stato dimostrato che la presenza all esame istologico di fibrosi midollare identifica un distinto gruppo di pazienti con displasia multifilare, elevata richiesta trasfusionale con prognosi sfavorevole (62). La valutazione di questo parametro rappresenta pertanto un fattore prognostico indipendente da considerare nella strategia terapeutica di questi pazienti. Sempre gli stessi autori hanno inoltre dimostrato che la percentuale di cluster di cellule CD34+ all esame istologico è un fattore prognostico indipendente che predice l evoluzione in LAM (52). Distinzione dalla LAM quando vi è contaminazione di sangue periferico (CD34-IIC). Diagnosi di SMD ipoplastiche e distinzione dalle LAM (CD34-IIC). Distinzione dalla Anemia aplastica. Valutazione degli ALIP/Accumulazioni multifocali di cellule progenitrici CD34+ (CD34-IIC). Anomala aggregazione e morfologia dei megacariociti (IIC: CD31, CD42, or CD62). Dimostrazione della fibrosi midollare (impregnazione argentica di Gomori). Dimostrazione di aumentata angiogenesi (CD34-IIC). Diagnosi di una concomitante neoplasia mieloide. Diagnosi di SMD-NC e di MS-SMD. Dimostrazione di marcatori citogenetici con la -FISH quando non è disponibile il cariotipo #. IIC, immunoistochimica ; MS-SMD, mastocitosi sistemica associata alle SMD. #Da non considerarsi allo stato attuale uno standard nella valutazione delle SMD. TABELLA 12 - Ruolo della istologia midollare e valutazioni raccomandate (17). Mielodisplasie ipoplastiche Nelle SMD il midollo è generalmente normo o ipercellulato. Tuttavia fino al 20% delle SMD può presentare un midollo ipocellulato (53). Le mielodisplasie ipoplastiche sono maggiormente frequenti nelle donne e si osservano con una frequenza correlata all età simile a quella delle SMD primitive. È sempre necessario escludere una precedente esposizione a sostanze tossiche o chemioterapici poiché un quadro ipoplastico midollare può essere frequentemente osservato nelle SMD/LAM secondarie a chemioterapia. La diagnosi di SMD ipoplastica può talora essere particolarmente insidiosa ed il quadro può non essere facilmente distinguibile da casi di LAM ipoplastica o di anemia aplastica, cosa che invece riveste grande importanza per le ovvie implica- Marcatore Pannello minimo CD34 CD31 or CD42 or CD62 Triptasi Tipo cellulare Blasti, progenitori, cellule endoteliali Megacariociti Mast cell, basofili, progenitori mieloidi Pannello esteso a seconda della linea cellulare da analizzare CD117 Progenitori, mast cell CD3 Cellule T CD20 Cellule B CD25 Subset di cellule T e B, mast cell atipiche CD38 Plasmacellule CD15* Monociti, granulociti CD68, CD68R* Monociti, macrofagi, cellule mieloidi Lisozima* Monociti, macrofagi 2D7, BB1 Basofili In rari casi, i blasti sono CD34 negativi e il CD117 può essere utilizzato in alternativa. La triptasi è generalmente negativa o mostra solo una debole positività nei blasti. *I marcatori monocitari e macrofagici possono essere utili per discriminare i monociti immaturi ed i blasti (LMMC vs. LAM). In altri casi non sono raccomandati. TABELLA 13 - Marcatori immunoistochimici raccomandati (17).

18 Il percorso diagnostico 17 zioni prognostiche e terapeutiche. Le SMD e le LAM ipoplastiche nel complesso sono una evenienza minoritaria ma tuttavia non rara rappresentando circa il 10-15% di tutte le neoplasie mieloidi (54). Sia le SMD che le LAM ipoplastiche si associano a citopenia periferica, suggerendo così una diagnosi clinica di anemia aplastica acquisita. In aggiunta, se il midollo è poco cellulato (<20%) può essere difficile distinguere questi disordini utilizzando i soli criteri morfologici applicati agli strisci di aspirato midollare e valutando la percentuale di blasti ed il grado di displasia. In tali casi si rendono pertanto necessarie l esecuzione della terapia ossea e indagini aggiuntive (Tabella 14). È stata invocata nel passato in alcuni casi di questi una patogenesi autoimmune, ma più recentemente si è dimostrato che questi meccanismi possono giocare un ruolo in varie forme di SMD, in particolare in presenza della trisomia 8, attraverso l espansione oligoclonale di elementi CD8 o NK. Recentemente sono state proposte delle linee guida allo scopo di permettere una più precisa diagnosi e distinzione delle forme di SMD ipoplastica, LAM ipoplastica ed anemia aplastica (56). Tra le raccomandazioni proposte, di rilievo è la correzione della cellularità per l età del paziente che comporta una diagnosi di ipoplasia nel 2.2% della LAM e nel 7% della SMD (46). Vengono inoltre raccomandati il conteggio di almeno 100 cellule nel sangue periferico e di 500 nel midollo al fine di aumentare l affidabilità della determinazione della percentuale di blasti. All esame istologico la diagnosi di SMD viene favorita dalla presenza di megacariociti in una struttura architettonica midollare disorganizzata, di fibrosi reticolinica e di ALIP che caratterizzano le forme più aggressive. Studi addizionali che possono essere di utilità nella diagnostica differenziale sono la citogenetica convenzionale, la FISH in interfase su cellule di sangue periferico e su sezioni di tessuto al fine di ricercare anomalie citogenetiche, uno studio citofluorimetrico che valuti non solo la percentuale di blasti e l anomala maturazione ma anche eventuali cloni EPN (Emoglobinuria Parossistica Notturna) (57). Anche per le SMD ipoplastiche come per quelle con mielofibrosi non esistono criteri classificativi Raccomandazioni maggiori Esame dello striscio di sangue periferico: contare almeno 100 cellule Valutare la displasia granulocitaria Valutare la presenza di blasti Aspirato midollare: Conteggio differenziale su 500 cellule Esaminare la displasia eritroide, granulocitaria e megacariocitaria Effettuare colorazione per il ferro per i sideroblasti ad anello Biopsia osetomidollare Valutare la cellularità (corretta per l età) Valutare la presenza di ALIP (con CD34, 117, mieloperossidasi) Effettuare valutazione reticolina Studi ulteriori Citogenetica standard e FISH in interfase Citometria a flusso screening per cloni EPN con metodiche citofluorimetriche e molecolari sensibili TABELLA 14 - Indagini diagnostiche suggerite per la diagnosi di SMD ipoplastica, LAM ipoplastica e anemia aplastica (56). universalmente accettati. Pertanto queste forme non sono state incluse nella classificazione 2008 della OMS nella quale è stato invece raccomandato di subclassificare questi pazienti secondo le linee guida per le SMD seguite dal termine ipoplastiche (14). Criteri minimi per la diagnosi di SMD Nella maggior parte dei pazienti la diagnosi risulta evidente sulla base dei criteri della classificazione FAB/OMS. Talora tuttavia la diagnosi può risultare non agevole in casi con una o più citopenie di lieve entità, senza incremento dei blasti del sangue periferico e midollare, con modeste note displastiche, senza anomalie citogenetiche. Per questi casi sono stati recentemente individuati dei criteri minimi per definire il ruolo diagnostico dell analisi citogenetica e citofluorimetrica nella diagnosi di SMD (17). Questi criteri si basano su 2 prerequisiti indispensabili (entrambi devono essere presenti), e almeno uno su 3 criteri addizionali legati alle SMD, e di diversi co-criteri (Tabella 15). Le cause di mielodisplasia secondaria e le anomalie diseritropoietiche congenite dovrebbero

19 18 Seminari di Ematologia Oncologica (A) Prerequisiti 1. Citopenia costante in una o più delle seguenti filiere: eritroide (Hb <11 g/dl); neutrofila (ANC <1500 µl) o megacariocitica (piastrine <100,000 µl). 2. Esclusione di tutti gli altri disordini emopoietici e non come causa primaria della citopenia/displasia. (B) criteri decisivi correlati alla SMD 1. Displasia in almeno il 10% di tutte le cellule delle seguenti filiere nello striscio midollo: eritroide; neutrofila; o megacariocitica o >15% di sideroblasti ad anello % di cellule blastiche nello striscio midollare. 3. Anomalie cromosomiche tipiche (mediante citogenetica convenzionale o FISH) #. (C) Co-criteri (per i pazienti che soddisfano i criteri A ma non quelli B, e che mostrano caratteristiche cliniche tipiche quali ad esempio una anemia macrocitica trasfusione-dipendente) Anomalo fenotipo delle cellule midollari chiaramente indicativo per una popolazione cellulare monoclonale eritroide e/o mieloide, determinata mediante citometria a flusso. Chiara evidenza molecolare di una popolazione cellulare monoclonale nel HUMARA assay, gene chip profiling, o analisi di mutazioni puntiformi (ad esempio mutazioni di RAS). Marcata riduzione della formazione di colonie (± formazione di cluster) dei progenitori midollari e/o circolanti (CFU-assay). *La diagnosi può essere formulata quando entrambi i prerequisiti ed almeno un criterio decisivo sono soddisfatti. Se nessun criterio decisivo è soddisfatto, ma è molto probabile che il paziente sia affetto da una neoplasia mieloide clonale, i co-criteri devono essere applicati e possono aiutare nel raggiungimento della diagnosi di SMD o di una condizione definita fortemente sospetta di SMD. Dal momento che possono esserci più pazienti con coesistenti neoplasie midollari, è importante definire che in alcuni casi una SMD può essere diagnosticata anche in presenza di un altra patologia possibile causa di citopenia. # Le alterazioni cromosomiche tipiche sono quelle ricorrenti nelle SMD. Se il cariotipo anomalo è il solo criterio decisivo, la condizione dovrebbe essere considerata come fortemente sospetta di SMD. I co-criteri non devono essere intesi come standard nella diagnostica di base delle SMD in tutti i centri. Se non disponibili, i casi dubbi devono essere monitorati ed i test ripetuti per porre diagnosi di SMD nel follow-up. TABELLA 15 - Criteri diagnostici minimi (17)*. (A) Definizione Citopenia in una o più delle seguenti filiere (per più di 6 mesi): eritroide (Hb <11 g/dl); neutrofila (<1500 µl); piastrinica (<100,000 µl) Esclusa una SMD (vedi B e C ) Escluse tutte le altre possibili cause di citopenia (vedi B e C ) (B) indagini iniziali richieste per la diagnosi di CIIS Anamnesi dettagliata (farmaci, tossici, mutageni, ecc.) Attento esame clinico comprendente indagini radiologiche ed ecografia splenica Emocromo con conteggio differenziale al microscopio e completa valutazione biochimica clinica Biopsia osteomidollare ed immunoistochimica Aspirato midollare e colorazione per il ferro. Citometria a flusso midollare e sangue periferico Analisi cromosomica con FISH (pannello standard minimo: 5q31, CEP7, 7q31, CEP8, 20q,CEPY, p53) Analisi molecolare se appropriata (ad esempio riarrangiamenti del T cell receptor-neutropenia) Esclusione di infezioni virali (HCV, HIV, CMV, EBV, altre) (C) indagini raccomandate nel follow-up Emocromo con formula e biochimica clinica ad intervalli di 1-6 mesi In caso di evidente sospetto di SMD: esame midollare TABELLA 16 - Citopenia idiopatica di incerto (indeterminato) significato (CIIS) (17). essere preventivamente escluse. Nei casi in cui un paziente con caratteristiche cliniche e di laboratorio coerenti con una SMD abbia caratteristiche morfologiche non conclusive, una diagnosi di SMD presuntiva può essere effettuata se è presente una anomalia cromosomica specifica (Tabella 16). Se è presente solo una displasia unilineare midollare in assenza di anomalie ricorrenti e di un aumento dei blasti nel sangue periferico e nel midollo, con meno del 15% di sideroblasti ad anello, per porre diagnosi di SMD è raccomandato un periodo di osservazione di 6 mesi e la ripetizione dell aspirato midollare (14). Nel caso sia presente una citopenia che coinvolga una o più filiere mieloidi (eritrociti, neutrofili, piastrine) che sia costante ( 6 mesi), ma non vengano soddisfatti i criteri minimi per la diagnosi di SMD e non si possano individuare altre condizioni patologiche ematologiche e non, è stata proposta una denominazione del quadro come citopenia idiopatica di incerto significato (CIIS) (17). Questi pazienti devono essere attentamente monitorati ed i test diagnostici eventualmente ripe-

20 Il percorso diagnostico 19 tuti per poter porre diagnosi di SMD nel follow-up. Sebbene questa entità appaia giustificabile dal punto di vista clinico-laboratoristico tuttavia non è stata inserita nella classificazione OMS ma viene utilizzata per descrivere quei pazienti che non soddisfano i criteri minimi per la diagnosi di SMD (14). Citofluorimetria Numerose recenti pubblicazioni hanno evidenziato l utilità dello studio citofluorimetrico nella fase diagnostica e nella definizione della prognosi (58-65). Nella fase diagnostica la valutazione citofluorimetrica di una sospetta SMD è di aiuto nella valutazione dei blasti CD34+ (60), dei monociti, della componente mieloide maturante (62, 63) e della componente eritroide (64). Lo studio citofluorimetrico può fornire indicazioni di tipo quantitativo e qualitativo. Dal punto di vista quantitativo è possibile definire la percentuale di blasti che nella maggior parte dei casi esprimono il CD34 e quindi concorrere ad un più preciso inquadramento diagnostico soprattutto nei pazienti con campioni midollari morfologici subottimali. Dal punto di vista qualitativo è possibile invece riconoscere anomalie fenotipiche maturative che, pur non essendo specifiche per le SMD, è stato dimostrato che correlano con il grado di displasia valutato all esame morfologico e pertanto possono essere di aiuto a differenziare le SMD da quadri di tipo reattivo o da altre neoplasie mieloidi clonali (66). Tuttavia è da sottolineare che la diagnosi finale di SMD attualmente deve comunque basarsi ancora su criteri di laboratorio più consistenti quali l esame di preparati citologici midollari e di sangue periferico, l esame istologico del midollo, la citogenetica o la FISH (17) (Tabella 17). Lo studio citofluorimetrico può però dare informazioni utili a fini diagnostici nei casi in cui la valutazione morfologica e citogenetica non siano conclusive. In tal senso la valutazione citofluorimetrica è stata inserita tra i co criteri minimi in un recente report della Consensus Conference allo scopo di porre diagnosi di SMD nei casi in cui non siano presenti una significativa displasia od un incremento dei blasti (17). Questi pazienti devono essere attentamente monitorati nel tempo per poter confermare il quadro di SMD. Recenti studi hanno poi dimostrato che la citofluorimetria può rivestire anche un ruolo nella definizione della prognosi nelle SMD, in quanto i risultati citofluorimetrici correlano con i sistemi prognostici attualmente utilizzati (60, 63, 64, 67, 68). È stata poi anche dimostrata una correlazione tra uno score immunofenotipico e la prognosi in pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali (65). Nel complesso il principale svantaggio della valutazione citofluorimetrica è dato dal fatto che essa si basa su protocolli e tecniche non perfettamente standardizzate e che mancano studi multicentrici prospettici (66). Infine la citofluorimetria può inoltre essere usata per escludere una diagnosi di EPN o per individuare la presenza di cloni EPN nell ambito di un quadro di SMD (57). CD34+ progenitori mieloidi Incremento assoluto e relativo delle cellule CD34+ Espressione del CD15 e/o CD11b (i basofili immaturi possono coesprimere il CD34 CD11b) Mancata espressione del CD13, CD33, o HLA-DR Espressione di antigeni linfoidi: CD5, CD7, CD19, o CD56 Ridotta espressione del CD45 Anomala espressione del CD34 (aumentata o ridotta) Anomala ridotta espressione del CD38 CD34+ progenitori B cellulari (CD34+/CD10+) Riduzione assoluta e relativa (rispetto a tutte le cellule CD34+) delle cellule CD34+/CD10+ Cellule maturanti mielodi (neutrofili) Ipogranularità evidenziata dal ridotto Side Scatter Anomalo pattern di espressione degli antigeni mieloidi Asincrona maturazione Mancata espressione del CD13 o CD33 Espressione del CD34 Espressione di antigeni linfoidi Ridotta espressione del CD45 Monociti Anomalie nel pattern di espressione di HLA-DR, CD11b, CD13, CD14, CD33 Mancata espressione di CD13, CD14, CD16, o CD33 Espressione del CD34 Espressione di antigeni linfoidi ad eccezione del CD4 Precursori eritroidi Anomala espressione del CD45 Espressione del CD34 Anomala espressione del CD71, CD117, o CD235a TABELLA 17 - Anomalie fenotipiche ricorrenti determinate mediante citometria a flusso (17).