SCREENING IMMUNOLOGICO DELLA INFEZIONE TUBERCOLARE
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- Elisabetta Cocco
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1 SCREENING IMMUNOLOGICO DELLA INFEZIONE TUBERCOLARE DANIELA CAMPISI S.C. MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA A.O. OSPEDALE NIGUARDA MILANO daniela.campisi@ospedaleniguarda.it VARESE 09 NOVEMBRE 2011
2 TUBERCOLOSI I PERSONAGGI Robert Koch Medico e Batteriologo tedesco nel XIX secolo scoprì il bacillo agente eziologico della Tubercolosi. Vinse il premio Nobel nel 1905 Carlo Forlanini titolare della cattedra di Patologia Speciale Medica dell Università di Pavia nel XIX secolo esegue il primo pneumotorace artificiale terapeutico collassoterapia Accettato a livello internazionale nel 1913 Clemens von Pirquet medico austriaco nel 1907 sviluppò la prima prova diagnostica della tubercolosi reazione allergica dopo applicazione di una goccia di tubercolina su una scarificazione praticata sulla cute di soggetti che erano stati esposti al bacillo di Koch
3 MTB prolifera nello spazio extracellulare e vengono reclutate cellule infiammatorie Ingestione da parte dei macrofagi alveolari inattivi PATOGENESI Esposizione a M.tuberculosis (inalazione di aerosol infetti)
4 INFEZIONE LATENTE E MALATTIA INFEZIONE le cellule T controllano l infezione, che rimane subclinica nel 95% dei casi Infezione latente: MTB controllato dal sistema immunitario per tutto il resto della vita (tuttavia i micobatteri rimangono vitali) TB attiva e sintomatica: I soggetti possono trasmettere la malattia ad altri
5 L INFEZIONE I micobatteri rimangono vitali a livello intracellulare nei macrofagi alveolari, dove si replicano. La produzione di nuovi bacilli, insieme a detriti cellulari e batterici inducono fattori chemiotattici dell ospite e richiamano macrofagi e linfociti circolanti Infiltrazione di Granulociti neutrofili (sostituiti da) Monociti macrofagi T linfociti
6 LA RISPOSTA CELLULO-MEDIATA Un ruolo centrale è rivestito dai linfociti T helper che producono IFN gamma e IL (2, 4, 5, 6, 10 e 12). Le citochine attivano i macrofagi rendendoli in grado di contrastare i micobatteri e limitare l infezione primaria. I macrofagi attivati possono fagocitare e uccidere i micobatteri. I linfociti T citotossici possono lisare cellule fagocitiche contenenti micobatteri in replicazione, permettendo così la fagocitosi e l uccisione dei micobatteri da parte delle cellule fagocitiche attive
7 Classic Model of the Pathogenesis of TB Primary TB Healthy Host Infection contained in the Lung and/or Lymph Nodes Progressive Pulmonary Disease Extrapulmonary TB Latent TB Infection (LTBI) 90% remain well 10% reactivate Factors Hematologic malignancy Steroids Anti TNF ageing Reactivation or Post-Primary TB Comorbidity avert or occult Pulmonary in 85% Extrapulmonary in 15%
8 T Cells produce IFN-γ in response to TB infection
9 TUBERCOLOSI PRIMARIA - SECONDARIA E DIAGNOSI DI INFEZIONE LATENTE La prima infezione conferisce immunità acquisita nei confronti di M. Tuberculosis nell organismo rimangono batteri vitali ma in una specie di letargo metabolico anche per decenni Il persistente controllo dell infezione avviene ad opera delle cellule immunocompetenti, macrofagi attivati e linfociti T CD4 / CD8 della memoria TUBERCOLOSI : malattia manifesta sia clinicamente che batteriologicamente polmonare e/o extra-polmonare INFEZIONE TUBERCOLARE LATENTE : subclinica senza segni batteriologici o radiologici di malattia ( solitamente soggetti con intradermoreazione positiva che possono essere contatti di soggetti con tubercolosi ) Nel caso in cui il complesso primario non venga completamente sterilizzato si può osservare una riattivazione anche a distanza di tempo tubercolosi secondaria Moltiplicazione batterica Formazioni di lesioni granulomatose Micobatteri in circolo Diffusione dell infezione in altre sedi polmonari e extrapolmonari
10 FATTORI GENETICI NELL UOMO INFLUENZANO LA SUCETTIBILITA ALL INVEZIONE MALATTIA TUBERCOLARE Numerosi studi dimostrano l associazione di Antigeni HLA con la suscettibilità alla malattia a seconda delle diverse etnie I geni coinvolti nella maggiore o minore suscettibilità sono diversamente distribuiti a seconda delle regioni geografiche In Nord Europa bassa endemia di alleli correlati I geni coinvolti nella difesa contro le infezioni evolvono molto più rapidamente di altri nel genoma umano probabilmente in seguito alla pressione esercitata dai contatti continui con agenti e patogeni Nelle regioni Asiatiche e in particolare in India Ag HLA-DR2 e DQ1 In Canada HLA-B8 in Egitto HLA-A2 e B5 in Grecia B27 Nelle popolazioni di colore del Nord America prevalgono HLA-B5 B15 e DR5 I geni VDR (Vitamine D Receptor) e MBP (Mannose-Binding Protein) sono associati alla suscettibilità o resistenza a TB polmonare perché essi influenzano la risposta cellulomediata Il gene NRAMP1 associato a una proteina macrofagica rinominato SCL11A1 è uno dei più noti e studiato esso controlla la disponibilità di ioni ferro che rendono la cellula maggiormente permissiva all infezione sia in soggetti HIV POSITIVI e in soggetti HIV negativi
11 DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DI INFEZIONE LATENTE TEST CUTANEO ( TST ) CON PPD : intradermoreazione in vivo comparsa di infiltrato e lettura dopo 48/72 ore misurazione dell alone con cut off variabile per gruppi specifici QUANTIFERON-TB Gold : test in vitro misura, con tecnica ELISA, la quantità di Interferone gamma ( IFN ) rilasciato dai linfociti T in risposta a stimolazione con antigeni tubercolari ESAT-6 e CFP-10 specifici per MTB e assenti nel BCG T-SPOT - TB : test in vitro misura il numero di linfociti T che producono Interferone gamma con tecnica Elispot
12 Latent TB and TST TUBERCULIN SKIN TEST Iniezione intradermica di 0,1 di derivato tubercolinico proteico purificato (PPD) sulla superficie volare dell avambraccio metodo di Mantoux Inserted Properly Needle Too Shallow Needle Too Deep
13 The Tuberculin Skin Test: Major Limitations
14 TST & IGRAs - IFN-γ release: rationale
15 TEST IGRA Interferon Gamma Release Assays DAL 2001 a oggi (1) IGRA approvato FDA con specificità tuttavia < a TST misurava la quantità di gamma interferone rilasciato in risposta a PPD Un nuovo IGRA misura la risposta a peptidi sintetici proteine specifiche di M. Tuberculosis Early Secretory Antigenic Target-6 ESAT-6, Culture Filtrate Protein 10 CFP-10 (assenti nei ceppi BCG) esse sono presenti in tutti i ceppi di M.Tuberculosis Tuttavia ESAT-6 e CFP-10 sono presenti anche in M.Kansaii, M. szulgai e M. marinum si possono avere risposte falsamente positive 2005 nuovo Quantiferon - TB Gold (QFT-GT) 2 IGRA approvato FDA : aliquote separate di sangue vengono incubate con controllo e due combinazioni diverse di ESAT-6 e CFP-10, viene calcolata la differenza tra la concentrazione di gamma interferon del campione stimolato con Ag e la concentrazione del CN quindi esclusione di falsi positivi tramite cut off del Nil che deve essere < 0,7 UI / ml 2007 Quantiferon - TB Gold in tube: 1 provetta TB contiene una combinazione di 14 peptidi che coprono l intera sequenza aminoacidica di ESAT-6 e CFP-10 e una parte della sequenza TB7.7 2 provetta Nil contiene solo eparina Controllo Negativo 3 provetta MIT ( Mitogeno )contiene eparina destrosio e fitoemagglutinina verifica l immunocompetenza del soggetto Dopo un incubazione a 37 C di ore nel plasma separato viene misurata la concentrazione di gamma interferon con metodica ELISA Test Nil compreso tra 0.7 e 0.8 e una risposta TB > del 25-50% del Nil viene interpretata come positivo piuttosto che indeterminato Test Nil compreso tra 0.7 e 0.8 e una risposta TB < 25% del Nil viene interpretata come Indeterminata
16 TEST IGRA Interferon Gamma Release Assays DAL 2001 a oggi (2) 2008 T-SPOT diventa il 4 IGRA approvato FDA : le cellule mononucleate del sangue periferico (Peripheral Blood Mononuclear Cells ) PBMC vengono incubate con sostanze controllo e con due combinazioni di peptidi ( intera sequenza di ESAT-6 e di CFP-10 ) il principio del metodo è ELISpot che misura il > numero di cellule secernenti gamma interefrone - spot- in ciascun pozzetto di reazione dopo stimolazione antigenica specifica, rispetto alla media della risposta nel pozzetto controllo ( Nil ) Una risposta borderline è considerata quella con 5,6,7 spot (N.B: la maggior parte degli studi non statunitensi che hanno utilizzato T-SPOT per lo screening non hanno usato il cut off indicato da FDA ) Sia QFT TB Goold che T-SPOT sono approvati come test di identificazione in vitro di infezione da M. Tuberculosis ( compresa l infezione da malattia attiva ) se utilizzati congiuntamente a una valutazione del rischio a indagini radiologiche e altre valutazioni mediche e diagnostiche Ciascuno dei test QFT-TB Gold, T-Spot e TST misura aspetti diversi della risposta immune e utilizza antigeni e criteri interpretativi differenti i risultati dei test possono non essere intercambiabili. Test differenti = risultati differenti
17 Interferon Gamma Release Assays (IGRAs) QuantiFERON-TB Gold In-Tube T-Spot.TB by (AUS) by (UK)
18 Comparison of Methods QuantiFERON-TB Gold In-Tube T-Spot.TB DAY 1 Collect blood in QuantiFERON tubes. Incubate tubes at 37 C for hours. Collect blood in specialized CPT tube. Separate lymphocytes by centrifugation. Collect PBMC. Centrifuge PBMC. Wash PBMC in pre-warmed media. Centrifuge PBMC. Wash PBMC in pre-warmed media. Centrifuge PBMC. Stain cells. Count viable cells in haemocytometer. Adjust concentration of PBMC. Dispense PBMC and antigens. T-Cell Xtend reagent option DAY 2 Centrifuge QuantiFERON tubes. Harvest plasma (automated / batched). ELISA. Read plate. Obtain results using QuantiFERON Software. Incubate at 37 C with C0 2 for hours. ELISA. Dry plate. Count spots. Analyze results.
19 Interpretation of IGRA Results T-Spot.TB cut-off > 6 spots according to manufacturer (Europe) >8spots according to FDA (USA) Antigens: ESAT-6, CFP-10 Antigens: ESAT-6, CFP-10, TB 7.7 QFT-IT cut-off > 0,35 IU/mL according to manufacturer >0,35IU/mLconfirmed by FDA
20 Interpretation of IGRA Results
21 Mitogen Control & Indeterminate Results for QFT Mitogen Control: Indication of the immune status of the person being tested. Controls for correct blood handling and storage before incubation. Indeterminate Result (no response to Mitogen): Is meaningful It does not indicate necessarily just a failed test.
22 CONCORDANZA TRA I TEST E RIPRODUCIBILITA Varia ampiamente essendo influenzata da fattori quali : prevalenza di infezione proporzione di infezioni confermate microbiologicamente stime di esposizione recente o remota età ( Osservazione: in età avanzata TST potrebbe essere più sensibile degli IGRA ) etnia pregressa vaccinazione con BCG un recente TST patologie concomitanti comprese altre infezioni da Micobatteri non tubercolari condizioni di immunosoppressione inclusa l infezione da HIV Studi longitudinali hanno rivelato considerevoli fluttuazioni nel rilascio di Interferon gamma in singoli pazienti : limiti della precisione? O effettive fluttuazioni? Nuova infezione? Conversione /Reversione? Problema dei valori di cut off IFN Da un valore >0.50 UI/ml a < 0.20 True Reversion ( Pai et Al ) Dati Sud Africani suggeriscono che un incremento del valore da < 0.35 UI/ml a > di 0.70 UI/ml True Conversion
23 ACCURATEZZA SPECIFICITA E SENSIBILITA DEI TEST QFT T-Spot Un limite della valutazione è la mancanza di un GOLD STANDARD per confermare la diagnosi di LTBI ( infezione latente ) e di Tubercolosi attiva con esami colturali negativi RICORDANDO CHE: L accuratezza è una misura della % di risultati di un test che sono effettivamente corretti e tiene conto della specificità ( % di veri negativi che risultano negativi al test ) e della sensibilità ( la proporzione di veri positivi che risultano positivi al test ) Le valutazioni di accuratezza sono molto difficoltose le stime delle performance dei test possono variare a seconda delle popolazioni oggetto di studio, in conseguenza alle differenze di prevalenza dell infezione da M. tuberculosis e di Micobatteri non tubercolari di malnutrizione e immunosoppressione Essendo TST e IGRA test indiretti le valutazioni di sensibilità dei test attraverso le loro performance tra gli individui affetti da tubercolosi attiva confermata da esami colturali potrebbero non essere affidabili nella LTBI Le differenze immunologiche che favoriscono la progressione dell infezione a malattia possono influenzare i test immunologici Un trattamento può alterare la risposta immunologica e il risultato del test Gli studi pubblicati utilizzano spesso criteri, cut off diversi da quelli FDA e anche misure diverse del diametro dell infiltrato I valori di sensibilità e specificità stimate hanno un ampia variabilità Nelle popolazioni a bassa probabilità di infezione la specificità del QFT TB può raggiungere il 99% vs quella del 85% di TST e del 88% di T-Spot la specificità di IGRA può anche essere sovrapponibile confrontando soggetti vaccinati BCG e soggetti non vaccinati ( BCG utilizzato in popolazioni con aumentato rischio di infezione )
24 Summary of National Guidelines Around the World General testing approach Countries TST must be replaced by IGRA Either TST or IGRA can be used Two-step approach: TST first, followed by IGRA (either to improve specificity or sensitivity) Germany,Swiss, Denmark( BCG-vaccinated contacts/adults) USA France Australia (refugees) Japan (QFT preferred in all groups except in children <5 y) Denmark (child contacts) UK, Canada, Italy, Spain, Australia, Slovakia, Germany[contacts], Swiss[contacts], Netherlands[contacts, immigrants], Norway, Korea[contacts] Madhu Pai
25 Meta-Analysis Key findings: IGRA and TST Sensitivity and Specificity SPECIFICITY QFT: 5 published studies involving 513 subjects 4 tested QFT positive Specificity (509/513) 99.2% T-Spot.TB*: 3 published studies involving 255 subjects 35 tested T-Spot.TB positive Specificity (220/255) 86.3% TST All Studies 59.0% * Manufacturer spots cut-off Diel R, Loddenkemper R and Nienhaus A Chest, 2009
26 Meta-Analysis Key findings: IGRA and TST Sensitivity and Specificity SENSITIVITY QFT: All studies (n=19; 988 patients) 81.0% Developed country studies (n=13; 619 patients ) 84.5% Developing country studies (n=6; 369 patients) 74.3% T-Spot.TB*: All studies (n=17; 837 patients) 87.5% Developed country studies (n=15; 812 patients) 88.5% Developing country studies (n=2; 25 patients) 52.0% Significantly different, P<0.001 TST: All studies (n=25; 1238 patients) 69.9% Developed country studies (n=23; 1184 patients) 71.5% Developing country studies (n=2; 54 patients 35.2% * Manufacturer spots cut-off Diel R, Loddenkemper R and Nienhaus A Chest, 2009
27 LE DOMANDE A CUI RISPONDERE IN FUTURO Gli IGRA sono in grado di predire una futura tubercolosi attiva? Quale il significato dei risultati discordanti? Gli IGRA hanno performance diverse nei bambini in confronto agli adulti (Mitogeno età < 5 anni ), nei soggetti HIV positivi rispetto ai negativi, in soggetti con infezione recente rispetto a soggetti con infezione acquisita anni prima, e in soggetti con infezione latente rispetto a pazienti con infezione attiva? Come spiegare risultati differenti dei test TST QFT T-Spot eseguiti simultaneamente? Potranno essere migliorate sensibilità e specificità dei test IGRA modificando lametodologia e adottando criteri di interpretazione diversi o aggiungendo ulteriori antigeni? Quale il migliore approccio per stabilire i cut off di interpretazione degli IGRA incluse situazioni in cui i valori di Nil sono elevati o i valori di Mitogeno sono bassi? L introduzione del borderline potrebbe migliorare l accuratezza Qual è il significato clinico della conversione/regressione? Come monitorare la qualità degli IGRA ( preanalitica: ritardo dell incubazione oltre le 12 ore > n indeterminati danneggia l interpretazione neg/pos particolarmente importante nei campioni pediatrici)? Esiste correlazione tra conta linfocitaria e produzione di interferone (HIV positivi )? In che modo fattori genetici del microrganismo o dell ospite interferiscono con i test IGRA? Quali effetti può produrre la terapia sui test IGRA?
28 WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO Stop TB Department ) RACOMANDATION 2011 IN LOW AND MIDDLE INCOME COUNTRIES IGRA non devono essere usati in questi paesi per la diagnosi di TB polmonare o extra-polmonare sia in soggetti HIV negativi che HIV positivi per evitare il trattamento non necessario nei falsi positivi data la bassa specificità dei test IGRA e TST in questo contesto IGRA non possono sostituire TST per la diagnosi di infezione latente o attiva nei bambini e nei soggetti HIV positivi ( n CD4 < 200 correla con il decremento di test positi del 27% con T-Spot e del 35 % con TST ) IGRA non possono sostituire TST nello screening dei lavoratori impiegati in assistenza a soggetti con infezione IGRA non possono sotituire TST nello screening dell infezione latente nei contatti sia adulti che pediatrici o in eventi epidemici IGRA e valori predittivi IGRA e TST non possono essere utilizzati per identificare individui a rischio di progressione di TB attiva
29 RACCOMANDAZIONI GENERALI PER L UTILIZZO DEGLI IGRA MMWR GIUGNO 2010 POSSONO ESSERE UTLIZZATI PER SCOPI DI SORVEGLIANZA SANITARIA O PER IDENTIFICARE SOGGETTI CHE TRARREBBERO BENEFICIO DAL TRATTAMENTO DOVREBBERO ESSERE ESEGUITI E INTERPRETATI SECONDO PROTOCOLLI PRESTABILITI DOVREBBERO ESSERE RIPORTATI SIA L INTERPRETAZIONE QUALITATIVA CHE IL DATO QUANTITATI VO INSIEME A CRITERI DI INTERPRETAZIONE DEL DATO DOVREBBE ESSERE SCRUPOLOSAMENTE TENUTA SOTTO CONTROLLO LA FASE PREANALITICA CONSIDERARE LE CARATTERISTICHE DELLA POLAZIONE DA SCREENARE ANALOGAMENTE AL TST GLI IGRA NON DOVREBBERO ESSERE UTILIZZATI PER TESTARE SOGGETTI CON BASSO RISCHIO DI INFEZIONE O PROGRESSIONE A TUBERCOLOSI ATTIVA ANCHE USANDO UN UN TEST CON SPECIFICITA PROSSIMA AL 99 % QUANDO LA PREVALENZA E < 1% LA PROBABILITA DI RISULTAT FALSAMENTE POSITIVI E MOLTO ELEVATA LA SCELTA DEL TEST PIU ADEGUATO O DELLA COMBINAZIONE DI PIU TEST DOVREBBE ESSERE BASATA SULLE RAGIONI E SUL CONTESTOIN CUI VENGONO ESEGUITI
30 RACCOMANDAZIONI GENERALI PER L UTILIZZO DEGLI IGRA MMWR GIUGNO 2010 II parte 1. IGRA è preferibile ma TST è accettabile : in persone senza fissa dimora o che fanno uso di stupefacienti in soggetti vaccinati BCG per aumentare la specificità e l accettabilità di un trattamento per LTBI 2. TST è preferibile ma un IGRA è accettabile : in bambini di età < 5 anni ( alcuni ricercatori suggeriscono di usarli entrambi ) American Academy of Pediatrics 3. Uso indifferente di uno dei due : screening dei contatti risultati negativi prima di 8 settimane dall esposizione ( ripetizione a 8-10 settimane ) screening di soggetti a rischio di esposizione occupazionale con attenzione particolare a CONVERSIONE-REVERSIONE Conversione di TST = negativo vs positivo infiltrato>= 10 mm entro 2 anni Conversione di IGRA = negativo vs positivo entro 2 anni? non dimostrata associazione tra IGRA e rischio di progressione 4. Utilizzare sia IGRA che TST : in bambini < 5 anni e soggetti HIV positivi con rischio aumentato di infezione, progressione e di esito infausto quando i valori misurati di un primo test sono anomali es. valore di Nil > di quanto normalmente osservato nella popolazione oggetto del test ( > 0.7 UI/ml ) la risposta al Mitogeno del QFT è < 0.5 UI/ml o il numero di spot nel pozzetto stimolato con mitogeno del di T-Spot è < 20 per la ripetizione di un test IGRA è preferibile un secondo campione
31 L esperienza del nostro laboratorio
32 CONCLUSIONI Le conversioni e reversioni esistono wait and see Un risultato Borderline va ripetuto a 1 mese 2 mesi 6 mesi 1 anno Negli esposti il rischio non è pari a zero se TST ha un diametro < 5 mm E possibile avere TST positivo QFT negativo oppure TST negativo e QFT positivo Non è consigliato l uso della quantizzazione degli IGRA per il monitoraggio della terapia Speranza per un futuro vaccino Ricercatori americani dalla Albert Einstein college of Medicine, della Howard Hughes Medical Institute e della Colorado State University hanno pubblicato su Online Nature Medicine i risultati incoraggianti di uno studio effettuato sul topo manipolando il gene ESX-3 correlato con la risposta immunitaria cellulomediata verso M.smegmatis letale per questo animale
33 RINGRAZIAMENTI VIRGINIA MIA FIGLIA CHE A SOLI UNDICI ANNI HA COLLABORATO ALLA REALIZZAZIONE GRAFICA DELLA RELAZIONE
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La via di penetrazione più comune per il M.T. è quella aerogena Goccioline di Pflügge Sospensione nell aria Evaporazione e riduzione a dimensioni di 1-5 μ con bacilli vivi e vitali.possibilità di essere
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