INDUZIONE DI EMOGLOBINA FETALE IN CELLULE ERITROIDI ISOLATE DA PAZIENTI AFFETTI DA -TALASSEMIA

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI FERRARA Facoltà di Farmacia Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare Corso di laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche INDUZIONE DI EMOGLOBINA FETALE IN CELLULE ERITROIDI ISOLATE DA PAZIENTI AFFETTI DA -TALASSEMIA I Relatore Prof. Roberto Gambari Laureanda Stefania Spedo II Relatore D.ssa Nicoletta Bianchi Anno Accademico

2 INDICE INTRODUZIONE Il differenziamento eritroide: aspetti generali 4 1.a. Il processo dell emopoiesi..4 1.b. L eritropoiesi nell uomo.6 2. Modulazione temporale dell espressione di globine umane durante lo sviluppo Principali patologie a carico del sistema emopoietico Il fenotipo HPFH (High Persistance of Fetal Hemoglobin) ed il gene per le -globine umane Approccio terapeutico per la cura della β-talassemia: la riattivazione di geni globinici endogeni Sistemi di colture cellulari in vitro nello studio dell attività di molecole da impiegare come possibili agenti eritro-differenzianti a. Colture cellulari impiegate in saggi preliminari di un numero elevato di composti, per testarne le potenzialità eritro-differenzianti b. Colture di precursori eritroidi isolati da sangue di precursori normali.31 6.c. Coltura cellulare di precursori eritroidi, isolati da pazienti affetti da -talassemia La Rapamicina: una molecola in grado di controllare la crescita cellulare e modulare l espressione genica.36 7.a. Cenni storici e struttura chimica della Rapamicina b. Sintesi della Rapamicina c. Meccanismo d azione della Rapamicina d. Attività antiproliferativa della Rapamicina e. Effetto eritrodifferenziante della Rapamicina, una molecola che presenta potenziale attività di induttore di emoglobina fetale Real-time quantitative RT-PCR per l analisi dell espressione dei geni globinici...62 SCOPO

3 MATERIALI E METODI Coltura di precursori eritroidi isolati da pazienti affetti da -talassemia Preparazione della Rapamicina Estrazione dell mrna totale derivante da precursori eritroidi Saggio dell RNA a. Quantificazione dell RNA allo spettrofotometro b. Elettroforesi su gel d agarosio Reazione di retro-trascrizione per la produzione del templato di cdna dall RNA di precursori eritroidi indotti e non dalla somministrazione di Rapamicina Real-time quantitative PCR per la quantificazione dei geni globinici Analisi HPLC (High Performance Liquid Chromatography) per la quantificazione delle globine in colture di precursori eritroidi isolati dal sangue di donatori che presentano -talassemia..77 RISULTATI Dati relativi ai pazienti analizzati Colture di precursori eritroidi da sangue di pazienti affetti da -talassemia Quantificazione del contenuto sia di HbF, che di Hb totale/cellula nelle colture di precursori eritroidi trattate con Rapamicina Quantificazione dell espressione dei geni globinici utilizzando la tecnica della Real-time quantitative PCR Considerazioni globali sull aumento di HbF e di mrna specifico per le γ-globine 91 DISCUSSIONE BIBLIOGRAFIA

4 INTRODUZIONE 1. Il differenziamento eritroide: aspetti generali. 1.a. Il processo dell emopoiesi. Le cellule ematiche hanno una durata di vita limitata nel sangue circolante e vengono continuamente rinnovate mediante il processo dell emopoiesi nel midollo osseo. Durante la vita intrauterina i primi precursori delle cellule ematiche sono riconoscibili nel sacco vitellino; al secondo mese di gestazione inizia l emopoiesi epatica che insieme a quella splenica è preponderante fino al sesto-settimo mese. Successivamente, il midollo osseo diviene il principale organo emopoietico, la cui attività riguarda all inizio principalmente le ossa piatte e lunghe, per divenire a carico delle vertebre, dello sterno, delle costole e delle creste iliache. Il tessuto emopoietico rappresenta in condizioni fisiologiche il 4-6% del peso corporeo di un individuo (1). Tutte le cellule circolanti nel sangue derivano da un numero limitato di cellule staminali pluripotenti di origine mesodermica, che rappresentano meno dello 0,01% delle cellule nucleate del midollo osseo e sono le uniche in grado di autoreplicarsi e ad avere la potenzialità di crescere e differenziarsi lungo le linee granulocitaria (neutrofili, eosinofili, basofili), monocitica, eritroide, megacariocitica e linfoide, come schematizzato in Fig.1. Alcune delle cellule staminali si dividono dando origine ad una progenie che perde la capacità di differenziarsi lungo le differenti vie e orienta il proprio sviluppo verso una specifica linea emopoietica. Queste cellule progenitrici chiamate committed (cioè destinate alla differenziazione secondo una sola linea differenziativa) continuano a proliferare e a differenziarsi in precursori morfologicamente identificabili, che vanno incontro ad un ulteriore maturazione acquisendo nel contempo funzioni altamente specializzate e perdendo la capacità di proliferare (2). Così, per effetto di stimoli non ancora del tutto chiariti le cellule staminali prendono la via del differenziamento verso la produzione di cellule progenitrici dei linfociti o di cellule staminali mieloidi pluripotenti. Queste ultime a seguito di successive divisioni cellulari danno origine a cellule che possono differenziare ulteriormente producendo: 4

5 1)mieloblasti da cui hanno origine i granulociti, 2) eritroblasti da cui derivano i reticolociti e quindi gli eritrociti, 3) megacariociti da cui si formano, infine, le piastrine (3) (Fig.1). Il passaggio delle cellule mature delle tre filiere emopoietiche nel circolo sanguigno risponde a stimoli poco noti e avviene mediante un processo attivo, che comporta la formazione temporanea di pori nella membrana delle cellule endoteliali (1). mieloidi linfoidi cellula staminale totipotente progenitore multipotente progenitore committed eritrociti megacariociti neutrofili basofili eosinofili piastrine macrofagi cellule B cellule T cellule NK cellule dendritiche cellule mature Fig. 1. Rappresentazione schematica del processo dell eritropoiesi nell uomo. L eritropoiesi ha inizio dalla cellula staminale totipotente che differenzia dando origine ai progenitori multipotenti (BFU-E). Da questi derivano poi le cellule committed sempre più differenziate dalle quali origineranno le cellule mature del sangue. Alla base del differenziamento c'è una particolare programmazione dell'attività genica, responsabile della conservazione di questa "specializzazione", che mantiene repressa la sintesi di geni, che non sono specifici di quel determinato tipo cellulare, ed invece attivata la sintesi di altri geni. Il nucleo non è il solo responsabile di questa programmazione, infatti, le cellule dei vari tessuti in un organismo hanno tutte DNA identico. La diversa regolazione dell'attività genica che si attua nei vari tipi cellulari dipende da segnali chimici che giungono al nucleo dal citoplasma, oppure, sempre 5

6 mediati dal citoplasma, anche da cellule circostanti o dall'ambiente esterno alla cellula. Segnali chimici analoghi sono prodotti anche nel corso della vita della cellula eucariotica, i cui complessi cicli vitali sono programmati da molecole specifiche sintetizzate in particolari momenti e che inducono il nucleo a iniziare una nuova fase di attività. Le interazioni nucleo-citoplasma sono quindi alla base sia del differenziamento, sia della normale attività di una cellula nel corso del suo ciclo vitale. Il mantenimento di questo stato differenziato è il risultato di un continuo dialogo tra ogni cellula ed il resto dell'organismo, mediato da sostanze chimiche capaci di svolgere un'azione regolatrice anche a distanza. Infatti, si può dimostrare come sia possibile ripristinare lo stato di totipotenza di un nucleo di una cellula differenziata, inserendolo in un citoplasma di una cellula embrionale, quindi privandolo dell'ambiente in grado di sollecitarlo verso un ruolo definito (3). I primi stadi dell emopoiesi risentono del controllo da parte di una serie di fattori di crescita, le cosiddette citochine, sintetizzate e secrete da svariate cellule midollari, stromali e del sistema immunitario, che regolano, in un complesso sistema di cooperazione, il differenziamento e la proliferazione delle cellule progenitrici. Tra queste citochine troviamo ad esempio il fattore di crescita per le cellule staminali (SCF, stem cell factor), l interleuchina-3 e il fattore stimolante le colonie granulocitomacrofagiche (GM-CSF). Altri fattori di crescita come l eritropoietina (EPO), la trombopoietina (TPO), il fattore stimolante colonie macrofagiche (M-CSF) e il fattore stimolante colonie granulocitarie (G-CSF), agiscono principalmente su progenitori cellulari più maturi, già orientati verso un unica linea di differenziazione. Questi fattori di crescita hanno in comune la caratteristica di legarsi a recettori proteici dotati di attività tirosin-chinasica, e sono quindi in grado di promuovere risposte complesse coinvolgenti la fosforilazione di proteine bersaglio (1). 1.b. L eritropoiesi nell uomo. L eritropoiesi è il processo attraverso il quale a partire da cellule staminali pluripotenti vengono prodotti gli eritrociti. L eritropoiesi ha inizio con la differenziazione della cellula staminale, che porta alla comparsa dei primi progenitori eritroidi. Gli stimoli che regolano queste fasi iniziali sono in gran parte oscuri. E noto che l IL-3 e il GM-CSF 6

7 possono incrementare la formazione dei progenitori eritroidi e che sono importanti le interazioni con le cellule endoteliali, fibroblastiche e macrofagiche del microambiente emopoietico (1). Per completare l intero processo è richiesta la presenza di fattori ematopoietici di crescita (HGFs), comprendenti molecole ad azione sia stimolatoria, tra cui le interleuchine, che inibitoria, come molecole prodotte da una vasta gamma di cellule. Altri fattori importanti di cui è richiesta la presenza sono, infatti: l eritropoietina, la vitamina B 12, l acido folico, la disponibilità di ferro e la presenza di alcuni oligo-elementi come il rame, il cobalto e il nichel. Le cellule precursori degli eritrociti, quando si dividono, diventano sempre più sensibili all eritropoietina, ormone polipeptidico prodotto dal rene e dal fegato in risposta allo stimolo ipossico inviato dai globuli rossi, che ne stimolano la produzione provocando la divisione cellulare fino alla completa maturazione dei precursori. Un adeguato apporto di vitamina B 12 e acido folico, indispensabili per la sintesi del DNA, è fondamentale per una corretta differenziazione e maturazione delle cellule staminali. La cellula eritroide più immatura, derivante dalla cellula staminale pluripotente, e che puo essere isolata dal midollo osseo e/o dal sangue periferico è la cosiddetta BFU-E (erythroid burst forming unit=unità eritroide formante grappoli), tali cellule possono essere anche facilmente coltivate in vitro. Dopo giorni di coltura la cellula BFU-E dà origine ad una grossa colonia di precursori eritroidi già riconoscibili. La BFU-E risponde ad alte dosi di eritropoietina, che a sua volta agisce sinergicamente con altri fattori di crescita. La CFU-E (erythroid colony forming unit=unità eritroide che forma colonie), cellula più matura, è molto sensibile all eritropoietina e produce un più piccolo clone cellulare dopo 4-7 giorni di coltura. L eritropoietina probabilmente interagisce con recettori specifici sulla membrana di cellule progenitrici (committed) destinate a differenziare in senso eritroide, inducendole a differenziarsi in pronormoblasti, i precursori eritroidi più precoci e riconoscibili all esame del midollo osseo. Normalmente il passaggio da proeritroblasto a eritroblasto più maturo richiede tre o quattro divisioni cellulari, che hanno luogo in un periodo superiore ai quattro giorni. Durante questo tempo il nucleo diviene più piccolo e una quantità sempre maggiore di emoglobina viene sintetizzata nel citoplasma. Dopo l ultima divisione cellulare il nucleo picnotico viene estromesso dall eritroblasto e si forma così il reticolocita che rimane nel midollo per due o tre giorni e viene poi 7

8 rilasciato in circolo dove rimane per altre 24 ore prima di assumere l aspetto morfologico tipico dell eritrocita maturo (con la perdita di mitocondri e dei ribosomi). Una caratteristica dei precursori eritroidi (dal peritroblasto al reticolocita) è che queste cellule possiedono un recettore di superficie specifico per il complesso ferrotransferrina, grazie al quale possono incorporare ferro a sufficienza per la sintesi dell emoglobina (2). L eritrocita non è una cellula in senso stretto in quanto priva di organelli cellulari, ma ha caratteristiche tali da essere in grado di trasportare grandi quantità di gas, ossigeno e CO 2, mediante la sintesi dell emoglobina, proteina avente funzione di trasporto di queste molecole, e presenta, inoltre, un favorevole rapporto superficie/volume avendo un diametro di circa 8 m ed uno spessore massimo di 2 m in modo da rendere più semplice la diffusione dei gas all interno e all esterno di questa cellula (4). 2. Modulazione temporale dell espressione di globine umane durante lo sviluppo. L emoglobina rappresenta la proteina più importante tra i costituenti dei globuli rossi, la cui funzione biologica è quella di trasportare l ossigeno dai polmoni ai tessuti attraverso il circolo sanguigno. Ha una struttura globulare costituita da quattro catene polipeptidiche e quattro gruppi prostetici eme. Delle quattro catene globiniche due sono catene di tipo alfa (zeta ed alfa), mentre le altre due sono di tipo beta (epsilon, gamma, beta e delta); nell adulto è prevalente l HbA (97%), formata da due catene α di 141 residui e da due catene β di 146 aminoacidi, che si associano tra loro a formare una struttura tetraedrica. Il 2-3% è rappresentato dall HbA 2, costituita da due catene e da due catene e meno dell1% è rappresentato dall HbF (emoglobina fetale) costituita da due catene e due catene. Quanto descritto è stato riportato con maggiori dettagli in Fig.2. Durante lo sviluppo dei proeritroblasti si ha un notevole incremento a carico della trascrizione dei geni per le catene globiniche. Le catene α e β dell HbA contengono diversi segmenti ad α-elica separati tra loro da ripiegamenti cosiddetti a -foglietto; le interazioni tra le due catene α e le due catene β 8

9 sono localizzate in prevalenza a livello di residui idrofobici, ma esistono anche interazioni ioniche che coinvolgono i residui carbossi-terminali delle quattro subunità. La sintesi di ciascuna di queste subunità è diretta da un gene corrispondente ed ereditato da ciascun genitore. Fig. 2. Differenti tipi di emoglobina nell uomo. Le tre emoglobine embrionali vengono prodotte nei primi mesi di gravidanza, al termine dei quali vengono sostituite dall emoglobina fetale, che a sua volta è sostituita dalle emoglobine adulte nei primi mesi di vita. (Figura tratta dal CD informativo The Thal World, per gentile concessione di Università degli studi di Ferrara e azienda USL Ferrara). In ogni catena polipeptidica costituente l emoglobina, posizionato all interno di una tasca idrofobica, si trova il gruppo eme, che in tale posizione stabilisce dei legami idrofobici con l interno ed eteropolari con la superficie della molecola. Il gruppo eme è costituito da una complessa struttura organica ad anello, la protoporfirina, alla quale è legato in posizione centrale un atomo di ferro nello stato di ossidazione ferroso (Fe 2+ ). L atomo di ferro presenta sei legami di coordinazione, quattro dei quali sono posizionati nel piano della porfirina ed impiegati all interno del piano, mentre gli altri due sono 9

10 perpendicolari al piano ed associano l eme al polipeptide stabilendo un contatto con l azoto imidazolico di due residui di istidina in posizione frontale rispetto all eme stesso. L equilibrio che si viene a formare tra l eme e la parte proteica è influenzato dalla presenza di ossigeno; infatti, essendo l ossigeno elettronegativo, tende a legare l atomo di ferro rompendo uno dei due legami di coordinazione con l istidina. Ne consegue che nell ossiemoglobina il ferro è legato ad una sola molecola di istidina della catena polipeptidica e ad una molecola di ossigeno, mantenendo costante la sua valenza allo stato ferroso. La struttura quaternaria dell emoglobina è responsabile della sua affinità per l ossigeno, che diventa maggiore per le diverse subunità, man mano che l ossigeno si lega ai gruppi prostetici: il legame della prima molecola di ossigeno favorisce i legami di nuove molecole di ossigeno alle altre subunità. Il movimento delle catene proteiche sono essenziali per la cattura ed il rilascio di ossigeno, permettendo al gruppo eme di assumere uno stato rilassato che favorisce il legame dell ossigeno alla subunità adiacente. Durante le varie fasi di sviluppo di un individuo sono identificabili diverse forme di emoglobina riassunte in Fig.2. È possibile, infatti, distinguere la produzione di tre emoglobine embrionali nei primi mesi di gravidanza (Hb Gower1 ζ 2 ε 2, Hb Gower2 α 2 ε 2 e Hb Portland ζ 2 γ 2 ), un emoglobina fetale (HbF α G 2 γ 2 e α A 2 γ 2 ) la cui produzione continua anche dopo la nascita andando a costituire per i primi sei mesi di vita il 5% di tutta l emoglobina. Rispetto all emoglobina di tipo adulto, l HbF presenta un affinità maggiore per l ossigeno: questo permette un efficiente trasferimento di ossigeno dal sangue materno a quello fetale attraverso la placenta. La differente espressione nel tempo, dal concepimento alla vita adulta, delle diverse catene globiniche nell uomo è rappresentata in Fig.3 ed è dipendente dall attivazione e dallo spegnimento di differenti geni globinici, attraverso processi di metilazione e demetilazione, che ne caratterizzano lo switch (5, 6, 7, 8). Durante il periodo embrionale sono attivi i geni responsabili della sintesi delle Hb Gower e Hb Portland, la cui espressione diminuisce progressivamente dopo le due prime settimane di gestazione. L espressione del gene ζ diminuisce man mano che aumenta l espressione del gene per la globina α, mentre le globine ε sono sostituite dalle globine γ dopo sei settimane dal concepimento. Le globine a partire dalla ventiquattresima settimana da concepimento, 10

11 durante la fase fetale, raggiungono i livelli massimi presenti nell adulto. Dopo la nascita, la sintesi delle globine γ diminuisce sempre più, fino ad essere completamente sostituita dalle globine β intorno al quarto anno d età. In realtà una piccola percentuale di HbF viene espressa ancora durante la vita adulta ed i suoi livelli possono variare anche di dieci volte sotto l influenza di fattori quali l età, il sesso o peculiarità genomiche, ad esempio mutazioni puntiformi nelle sequenze di DNA all interno del cluster β o nei geni ad esso correlati. catene globiniche prima della nascita nascita dopo la nascita Fig. 3. Espressione nel tempo e nei diversi tessuti dei differenti tipi di catene globiniche umane. Le catene globiniche umane sono espresse in percentuale di emoglobina sul totale (figura tratta da: Olivieri NF. The β Thalassemias. Medical Progress, 341, , 1999). Il clusters genico per le globine ε, γ, δ e β si trova sul cromosoma 11, mentre quello per le globine ζ e α si trovano sul cromosoma 16, essi sono riportati in Fig.4. Nel cromosoma 11 sono rappresentati anche gli pseudo-geni ψβ 2 e ψβ 1, mentre nel cromosoma 16 è presente lo pseudo-gene ψα 1. Per le catene di tipo γ va specificata l esistenza di due tipi diversi di globine che differiscono tra loro per la sostituzione di una glicina con un alanina in posizione 136 della catena peptidica e sono rispettivamente denominate catene G γ e A γ. 11

12 A Locus Control Region 2 G A cromosoma 11 (p15.5) HS-Region 1 B cromosoma 16 (p13.3) Fig. 4. Organizzazione dei clusters dei geni per le globine di tipo β (A) e dei geni per le globine α (B), posizionati rispettivamente sul cromosoma 11 e sul cromosoma 16. (Figura tratta dal CD informativo The Thal World, per gentile concessione di Università degli studi di Ferrara e azienda USL Ferrara). I geni β-globinici umani (ε, γ G, γ A, δ e β) sono raggruppati in un dominio di 70 kb sul cromosoma 11. L espressione dei geni β-globinici è regolata da una regione, di circa 25 kb, contenente una serie di siti ipersensibili alla DNasi I (5 HS), riconosciuti da quattro fattori eritrospecifici (5 HS1-4), e uno riconosciuto da un fattore ubiquitario (5 HS5); tale regione è collocata tra 6 e 18 kb a monte del gene per le ε-globine ed è chiamata Locus Control Region (LCR). La sequenza LCR è indispensabile per l attivazione della trascrizione, infatti è stato dimostrato come la delezione di questa regione inibisca l espressione di tutte le proteine codificate dai geni contenuti nel cromosoma 11 provocando la -talassemia (9, 10). L LCR svolge due ruoli importanti: 1) costituisce una regione cromosomica aperta, ovvero più accessibile ai fattori di regolazione, e 2) contiene delle porzioni ad attività fortemente enhancer, responsabili dell elevata espressione genica, differenziata temporalmente durante lo sviluppo embrio-fetale dei diversi geni globinici (11). Ciascun promotore dei singoli geni β-globinici sembra agire in sinergismo con l LCR per controllarne l espressione nel tempo, determinando il lo spegnimento progressivo di alcune catene a favore di altre (12). 12

13 La sequenza LCR è stata parzialmente mappata ed è stata evidenziata una regione in particolare: la regione 5 HS2 che contiene due siti di legame per il fattore nucleare NF- E2 (Nuclear Factor E2), sovrapposti al sito di legame per la proteina AP-1 (Activator Protein 1) (13, 14). E stato dimostrato che questa regione di 46 bp è necessaria e sufficiente per l attivazione dell espressione di un gene reporter -globinico posto sotto il suo controllo trascrizionale (13). Per la completa attività del sito 5 HS2 è, inoltre, necessario che si verifichi l interazione di alcuni fattori trascrizionali con i loro siti di legame localizzati all interno di tale regione. Tra i fattori trascrizionali identificati ricordo GATA-1 (erythroid cell- and megakaryocyte-specific trancription factor 1) (15), TAL-1 (T-cell acute leukemia 1) (16) CBF-1 (C-promoter binding factor 1) (17), USF (Upstream stimulatory Factor) (18), e YY1 (ying-yang 1) (19). Numerosi studi suggericono che altre proteine possano essere implicate nel meccanismo di regolazione genica come l istone-acetil-transferasi (HATs), CREB binding protein (CBP) e p300, importanti co-attivatori per la trans-attivazione dei geni globinici che mediano l attività enhancer dell LCR (20). Sembra che il meccanismo molecolare con cui l LCR possa dirigere l espressione globinica sia la formazione di loop di DNA dovuti proprio all interazione di complessi multipli DNA-proteina coi singoli promotori per le diverse globine del cluster secondo un modello schematizzato in Fig.5. Attivatori 13

14 Repressori Regione codificante Coattivatori promotore Fattori basali Fig. 5. Esempio di una struttura a loop. Nella figura sono schematizzate le regioni interessate dal legame di fattori trascrizionali, che a loro volta interagiscono grazie alla formazione di una struttura a loop con quelli riconosciuti in regioni più distali, regolando l espressione genica a livello delle regioni promotrici dei singoli geni globinici. (Figura tratta dal sito informativo 3. Principali patologie a carico del sistema emopoietico. Le patologie del sistema ematopoietico che colpiscono l uomo sono suddivise in due categorie principali entrambe dovute ad alterazioni ereditarie. Il primo gruppo è costituito da quelle patologie in cui le catene globiniche prodotte sono caratterizzate da variazioni a livello della sequenza aminoacidica, tra queste l anemia falciforme. Il secondo gruppo è caratterizzato, invece, da una minore od assente produzione di catene globiniche (sindromi talassemiche). Le sindromi talassemiche presentano dunque un disturbo a livello quantitativo e non qualitativo delle catene polipeptidiche; in base al tipo di catena colpita dal difetto genico si parlerà di -talassemia, -talassemia e -talassemia. Queste patologie rappresentano 14

15 uno dei disordini genetici più diffusi nel mondo e risultano particolarmente colpite le popolazioni del bacino del Mediterraneo, dell Africa, dell India e dell Oriente (Fig.6A). In Italia prevalgono nettamente le forme di -talassemia, che risulta endemica nel delta padano, in Puglia, Campania, Calabria, Sicilia e Sardegna (Fig.6B). A B Fig. 6. Aree geografiche maggiormente colpite dalla talassemia. Nella figura sono rappresentate le zone endemiche dell Italia (A) e del mondo (B), nelle quali la talassemia è stata maggiormente riscontrata. Gli studi genetici hanno dimostrato come le mutazioni responsabili dell insorgenza delle sindromi talassemiche siano originate casualmente in varie popolazioni e che un criterio di selezione naturale, basato verosimilmente sulla maggior resistenza 15

16 all infezione da parte dei parassiti malarici delle forme eterozigoti, abbia giocato un ruolo importante nell affermarsi di questa patologia in certe aree geografiche. Alcune mutazioni genetiche che determinano l insorgenza della talassemia possono essere: la sostituzione di un codone codificante per un aminoacido con un codone di terminazione, determinando un interruzione prematura della trascrizione; l alterazione del quadro di lettura del codice genetico; un difetto a livello della maturazione o del trasporto dell mrna dal nucleo al citoplasma, per cui il trascritto può essere degradato all interno del nucleo oppure, se la mutazione interessa regioni interne ad introni localizzate lontano dal normale punto di separazione introne-esone, possono formarsi nuovi siti di splicing, causando la produzione di mrna sia normali che alterati. Infine, ricordiamo le delezioni geniche, le principali delle quali sono riportate in Fig.7. ε G A 5 3 Talassemia Talassemia Hb Lepore Talassemia Talassemia HPFH Talassemia Fig. 7. Delezioni geniche responsabili del fenotipo talassemico. Questo tipo di delezioni possono interessare un area genica più o meno vasta. In alcuni casi possono, invece, provocare la riattivazione dei geni globinici di tipo gamma (come nel fenotipo HPFH). Le emoglobine Lepore prendono origine da un crossing-over non omologo fra i geni e adiacenti. Tale evento genera una subunità globinica formata all estremo N-terminale da un tratto di catena e all estremo C-terminale da un tratto di catena. 16

17 Le α-talassemie sono più frequenti in Asia, in alcune regioni del bacino del Mediterraneo ed in Africa, ed è molto rara tra le razze bianche. Essendo i geni codificanti per l globina quattro, due per ciascun cromosoma 16 in un individuo diploide, sulla base del numero di geni interessati dall alterazione si distingueranno diverse varianti di -talassemie. Tuttavia, la maggior parte delle -talassemie sono dovute alla delezione di geni -globinici che possono essere di diversa entità, dando quindi origine a quadri clinici di diversa gravità. La mancanza di tutti e quattro i geni α porta all insorgere di una patologia detta idrope fetale, caratterizzata da morte intrauterina del feto o sopravvivenza di poche ore del feto nato a termine. In questa patologia diffusa soprattutto in Asia, si ha la sintesi di emoglobine anomale: Hb Bart (80%), costituita dall unione di quattro catene, Hb Portland, costituita dall unione di due catene ζ e due (20%). La malattia da HbH deriva invece dalla trasmissione di uno solo dei quattro geni dell -globina, con conseguente grave riduzione della sintesi di questa catena. L emoglobina formata è in prevalenza di tipo HbH e deriva dall unione di quattro catene. Siccome i tetrametri formati dalle catene sono relativamente solubili, la morte intramidollare degli eritroblasti è ridotta, mentre si assiste alla formazione di precipitati emoglobinici in circolo (corpi di Heinz). I pazienti in genere hanno un aspettativa di vita normale, anche se possono andare incontro ad aggravamenti dell anemia in caso di infezioni. La -talassemia minor deriva dalla delezione di due dei quattro geni globinici ed è una condizione in genere clinicamente silente. Le + -talassemie, causate non da una delezione, sono di solito prodotte da mutazioni che comportano la ridotta espressione dei geni. La β-talassemia viene classificata in due categorie a seconda del grado di mancanza di globine β: β 0 -talassemia, quando vi è la totale assenza di sintesi di β-globine; β + - talassemia, caratterizzata da una ridotta sintesi di β-globine negli omozigoti. Esperimenti di sequenziamento dei geni per le globine β hanno permesso di evidenziare più di 38 diverse mutazioni causanti la malattia, molte delle quali rappresentate da mutazioni puntiformi. Le più comuni alterazioni, riportate in Fig.8, riguardano: a) la regione promotrice del processo di trascrizione, le mutazioni in questa regione si traducono in una ridotta trascrizione genica, responsabile dell insorgere di una β + - talassemia; b) regioni esoniche, dove la modificazione di un singolo nucleotide può 17

18 portare alla formazione di un codone detto di stop, che interrompe prematuramente la traduzione dell mrna globinico, generando frammenti non funzionanti di β-globina e provocando una β 0 -talassemia; c) regioni nelle quali le mutazioni possono determinare un alterato splicing del trascritto primario, che viene degradato all interno del nucleo, portando ad una β 0 -talassemia. Possono verificarsi anche mutazioni all interno di introni e localizzate lontano dal normale punto di separazione introne-esone, ma generanti nuovi punti di splicing. Nel caso in cui questi presentino anche i canonici siti di splicing, si può avere la produzione di sia di mrna corretti, che di mrna alterati; questa modificazione determina l insorgenza di una forma di β + -talassemia. Fig. 8. Rappresentazione schematica del gene per la β globina. Nella figura sono anche indicati i principali siti nei quali sono state localizzate le mutazioni responsabili di β-talassemie. Il soggetto affetto da β-talassemia si trova in uno stato di anemia cronica dovuta, oltre che alla mancata o ridotta sintesi di β-globine, anche al fatto che le catene α, che sono normalmente prodotte, non trovando un equivalente concentrazione di catene β alle quali associarsi risultando in eccesso e legandosi tra loro per formare aggregati 18

19 insolubili. Questi complessi precipitano all interno dei precursori eritroidi intramidollari danneggiandoli. Si verifica così un eritropoiesi inefficace. Non tutte le catene α in eccesso precipitano, molte si associano alle catene γ originando molecole di HbF, e alleviando la gravità della malattia nel paziente. La talassemia major o morbo di Cooley, nella quale la malattia trova piena espressione clinica, è sostenuta raramente da uno stato di omozigosi per il gene malato, molto più frequentemente si tratta di una doppia eterozigoti per due mutazioni diverse, ereditate ciascuna da uno dei due genitori. Si distinguono almeno tre categorie genotipiche: le forme 0 / 0, le forme 0 / + e le forme + / +. Ovviamente nel primo tipo l HbA e l HbA2 sono praticamente assenti e la quasi totalità dell emoglobina è rappresentata dall HbF, mentre negli altri due tipi vi è sempre un aliquota, in genere variabile tra il 15% e il 25% di HbA e HbA 2. Il soggetto affetto da morbo di Cooley presenta già dai primi mesi di vita pallore, ittero, epatosplenomegalia. Si associano spesso sintomi sistemici quali anoressia, decadimento delle condizioni generali e febbricola. Caratteristiche sono le alterazioni ossee dovute all espansione midollare, che si manifestano con la tipica facies microcitemica determinata dagli zigomi sporgenti, dal naso con radice piuttosto infossata e dal cranio rotondo e ingrossato. L allargamento delle ossa craniche conferisce il tipico aspetto del cranio a spazzola. La sopravvivenza dei soggetti affetti da -talassemia major è limitata; nei casi più gravi non si arriva all età adulta. Le forme di talassemia intermedia, caratterizzate da doppia eterozigosi hanno espressione clinica meno spiccata ed esordio tardivo. I soggetti affetti da questa patologia possono mostrare un anemia di grado variabile che può comparire anche tardivamente. Lo sviluppo psicosomatico è regolare anche se alcuni soggetti possono mostrare ritardo dello sviluppo nella sfera sessuale. E sempre presente una splenomegalia che è in genere progressiva, tuttavia i soggetti affetti possono sopravvivere fino ad un età avanzata. Nelle forme di eterozigosi o di talassemia minor, gli individui presentano un quadro clinico con o senza anemia e la patologia è totalmente silente (1). 4. Il fenotipo HPFH (High Persistance of Fetal Hemoglobin) ed il gene per le -globine umane. 19

20 La sintesi di emoglobina fetale è normalmente ridotta all 1-2% dell emoglobina totale nell adulto, poiché è limitata progressivamente ad una sottopopolazione eritrocitaria detta F-cells, che nell 85% degli individui adulti sani raggiunge un valore variabile dallo 0,3% al 4,4% (21). In alcuni soggetti affetti da β-talassemia e che presentano un anormale espressione dei geni per le γ-globine questo fenomeno determina un incremento nel livello di HbF, tale livello può raggiungere valori medi che vanno da un 2,5% ad un 20%. Questa condizioneviene definita HPFH (High Persistance of Fetal Hemoglobin), nella quale l incremento di HbF può raggiungere anche livelli superiori al 30% (22). La condizione fenotipica HPFH si manifesta con un espressione dei geni per le γ-globine attivi durante lo sviluppo fetale, che continua nell adulto, quando l espressione dovrebbe invece essere repressa. I pazienti che manifestano un fenotipo HPFH presentano un miglioramento del quadro clinico, grazie alla riattivazione dei geni per le γ-globine, dove gli aumentati livelli di HbF sono in grado di supplire, almeno in parte, alla carenza di HbA nelle sindromi talassemiche. Pertanto, oggetto di indagine è l identificazione e la caratterizzazione di composti naturali, chimici od altri tipi di molecole, capaci di indurre il differenziamento eritroide e la produzione di emoglobine embrio-fetali, nel tentativo di riattivare i geni endogeni per le γ-globine. Le alterazioni geniche che portano ad incrementati livelli di HbF sono a tutt oggi oggetto di studio, tuttavia sono state individuate due tipologie. Per il fenotipo HPFH di tipo deletion sono state proposte tre cause: 1) la delezione di sequenze regolative nel cluster genico per le β-globine, implicate nella modulazione sia positiva che negativa, che produce un fenotipo derivante dalla funzione delle sequenze regolative restanti; 2) una delezione che giustappone elementi enhancers in 3 e normalmente localizzati a valle del gene β, in prossimità dei geni γ, incrementandone l espressione; 3) una delezione che determina la continuità tra la regione di controllo del locus LCR ed i geni γ, normalmente in stato quiescente. Nell HPFH non deletion, invece, l intero cluster risulta integro. Sono state descritte mutazioni nelle posizioni -202, -175, -161, -158 e -114 del gene G, e -202, -198, -196, -195, -175, -117 e -114 nel gene A il cui promotore è ampliamente descritto in Fig.9. 20

21 Fig. 9. Rappresentazione del gene per le β-globine e del promotore del gene per le -globine. Nella figura è rappresentato il cluster -globinico compresa la regione LCR ed i cinque geni globinici. Nell espansione è rappresentato il promotore del gene per le -globine con le principali sequenze riconosciute da fattori di regolazione di questo gene. Queste mutazioni riguardano soprattutto regioni regolative a livello di siti di legame per fattori trascrizionali sia ubiquitari, che eritro-specifici e sono riportate in tabella 1. Probabilmente tali mutazioni alterano il legame con le proteine regolative della trascrizione genica, comportando o un aumento l'affinità per fattori transattivanti, o diminuendo l affinità per repressori trascrizionali, oppure una combinazione dei due meccanismi. Le mutazioni alle posizioni -202, -198, -196, -195 sembrano coinvolgere il sito di legame della proteina ubiquitaria Sp1 (23). La mutazione -175 annulla in vitro il legame della proteina Otc-1 (Octamer Binding Factor 1) ed altera il sito di legame di GATA-1 ( erythroid cell and megakaryocyte-specific transcription factor 1) (24). Le mutazioni -117 e -114 ed una delezione di 13 pb in questa regione riguarda un 21

22 complesso di siti per fattori trascrizionali, inclusa la sequenza CCAAT presente in duplice copia, tra questi anche il sito di legame per GATA-1 ed il fattore eritroide specifico NF-E3 (Nuclear Factor Erythroid 3). Le mutazioni -117, -114 e la delezione di 13 pb sembra alterare in vitro il sito di legame di molte proteine: CP1 (poly(c)- binding protein-1), CDP (CCAAT displacement protein), GATA-1 e NF-E3 (25). Tuttavia, i livelli maggiori di HbF sono stati evidenziati in individui -talassemici portanti una mutazione puntiforme in posizione -158 del gene G sia nello stato di omozigosi che in eterozigosi (21). Le principali mutazioni responsabili del fenotipo HPFH sono riportate in tabella 1. Tabella 1. Principali mutazioni responsabili del fenotipo HPFH. HPFH deletion delezione (kb) HPFH Sicilia/Mediterraneo 13,4 HPFH-4 (Italia) 40 HPFH non-deletion mutazione HPFH giapponese G -114 C a T HPFH australiana G -114 C a G HPFH Black G -158 C a T HPFH Black G -161 G a A HPFH Black/Sardegna/Inghilterra G -175 T a C HPFH Black G -202 C a G HPFH Black A delezione da -114 a -102 HPFH Georgia A -114 C a T HPFH Greek A -117 G a A HPFH Black A -175 T a C HPFH brasiliana A -195 C a G HPFH cinese A -196 C a T HPFH inglese A -198 T a C HPFH Black A -202 C a T Il promotore del gene codificante per le -globine è stato ampliamente studiato, e sono state identificate regioni altamente conservate, come la sequenza CCAAT ripetuta due volte e la sequenza ATAAA, che costituiscono il promotore minimo in grado di attivare la trascrizione a bassi livelli delle -globine umane (26). Un altra regione regolativa è la 22

23 sequenza CACCC, riconosciuta dal fattore di trascrizione Sp1 e indispensabile per aumentare l espressione del gene per le -globine. E stato infatti dimostrato che delezioni o mutazioni in questa sequenza portano ad una riduzione dell attività del promotore (27). Studi su precursori eritroidi coltivati in vitro hanno permesso di identificare altri fattori implicati nella regolazione dell espressione di questo gene, in particolare sono stati identificati fattori leganti la sequenza CCAAT, quali CP1/NFY (nuclear factor Y), CDP, NF-E3 e GATA-1. Quest ultimo sembra avere funzione repressiva, in quanto è stato osservato che in precursori eritroidi umani embrionali e fetali l interazione GATA-1/promotore non avviene, mentre si instaura nelle cellule adulte in cui la -globina non è normalmente espressa (28). I fattori CP1/NFY e NF-E3 riconoscono invece la stessa sequenza ma sembra che, in cellule esprimenti le - globine, CP1/NFY abbia una maggiore affinità per essa rispetto ad NF-E3 (25). In posizione -280 della regione promotrice del gene A -globinico è stata individuata la sequenza ATGCAAAT, riconosciuta dal fattore di trascrizione Oct-1 (Octamer Binding Factor 1); una mutazione in questa posizione può attivare la trascrizine genica dell HbF e produrre il fenotipo HPFH. Questo dimostra l importanza regolativa della sequenza. (29). La regione promotrice del gene per le -globine umane risulta pertanto estremamente interessante e costituisce un modello sperimentale adatto a studi volti a chiarirne i meccanismi di regolazione e modulazione trascrizionale. Essa rappresenta un importante potenziale target per farmaci in grado di aumentare l espressione di - globine e di conseguenza anche i livelli di HbF, migliorando così il quadro clinico di pazienti affetti da -talassemia. 5. Approccio terapeutico per la cura della β-talassemia: la riattivazione di geni globinici endogeni. 23

24 La terapia più comune per le diverse forme di talassemia prevede la trasfusione di sangue, indispensabile per fornire al paziente un carico di globuli rossi sani ricchi in emoglobina normale perfettamente capace di trasportare ossigeno ai tessuti. Le trasfusioni consentono anche di ridurre l espandersi del midollo osseo e quindi le alterazioni ossee e di limitare l attività della milza. Esistono però degli svantaggi dovuti al perdurare di questo programma terapeutico; infatti, con le trasfusioni sono introdotte nell organismo grandi quantità di ferro, presente nell eme. Questa condizione determina un fenomeno di tossicità per organi e tessuti detto iron overload, che va a danneggiare soprattutto il cuore ed il fegato, ed è la principale causa di morte nei pazienti trattati con cicli trasfusionali. Pertanto nella maggior parte dei casi i pazienti talassemici sono sottoposti anche a una terapia chelante il ferro, utilizzando come farmaco la Deferoxamina (DFO) somministrata per infusione sottocutanea mediante microinfusore al fine di rimuoverne l eccesso. Tale terapia risulta purtroppo difficile e dolorosa da affrontare, e presenta molti effetti collaterali (deficit neurosensoriali delle vie uditive, anomalie retiniche, danni renali e polmonari e, nei bambini, danni metafisari con relative turbe dell accrescimento) tanto da spingere numerosi pazienti ad abbandonarla. Un alternativa è rappresentata dal trapianto di midollo osseo, che permette un alta percentuale di guarigione qualora i pazienti arrivino rapidamente ed in buone condizioni cliniche al trapianto. Per questa strategia è necessario disporre di un donatore di midollo perfettamente compatibile per evitare fenomeni di rigetto. Poiché per impiantare un nuovo midollo è necessario distruggere prima quello del ricevente, vengono impiegati farmaci chemioterapici. Anche i globuli bianchi sono quindi eliminati e il paziente in questa fase è sottoposto ad alti rischi di infezioni. Le cellule del midollo verranno poi reintegrate con la somministrazione per via endovenosa di cellule sane e provenienti da un donatore, che presenta caratteristiche di istocompatibilità simili al paziente. Diversi sono gli approcci sperimentali attualmente in fase di studio. Uno di questi riguarda la terapia genica. Grazie all ingegneria genetica si potrebbe inserire un gene per le β-globine normale in pazienti affetti da talassemia, sostituendo le funzioni del gene malato con quelle del gene sano, opportunamente inserito nei precursori eritroidi del paziente. Il sistema vettore all avanguardia impiegato negli studi di clonaggio è costituito da un vettore lenti-virale in cui vengono silenziati alcuni geni del virus in modo da renderlo non patogeno. I problemi di questa terapia sperimentale riguardano soprattutto l identificazione delle sequenze necessarie per avere 24

25 un espressione elevata e stabile del gene da veicolare e lo sviluppo di vettori più efficaci e sicuri per il suo trasferimento all interno dell'organismo (30, 31, 32). Altri approci nell ambito della terapia genica riguardano l utilizzo di ribozimi per la cura delle emoglobinopatie. I ribozimi sono molecole in grado di legare e degradare uno specifico prodotto genico. Sono stati messi a punto ribozimi specifici per la soppressione degli mrna per le -globine, molto utili nel contrastare la precipitazione dei tetrametri -globinici, che causa gravi danni ai precursori eritroidi nella - talassemia (33). Altre strategie terapeutiche per la cura della talassemia sono in fase di studio. Una strada che lascia sperare a futuri successi è quella di riattivare il gene che codifica per le globine di tipo γ e permettere la produzione di HbF (α 2 γ 2 ), che potrebbe compensare la carenza di emoglobina adulta. Se si potesse controllare lo switch globinico γ-β, agendo su una specie di interruttore molecolare, si assicurerebbe al paziente talassemico una quantità di emoglobina fetale tale da consentirgli condizioni di vita pressoché normali (22, 34). Per incrementare l espressione di -globine è stato considerato anche l utilizzo di virus per il trasferimento in cellule totipotenti ematopoietiche di geni terapeutici privati degli elementi patogeni e contenenti il gene per le -globine umane associato ad alcuni elementi dell LCR. Questi elementi consentono l integrazione e l espressione stabile del transgene presentando un tropismo elettivo per le cellule ematopoietiche. In particolare è stato realizzato un vettore per ottenere un efficace trasferimento genico nelle cellule ematopoietiche umane (35). Come possibile terapia per la talassemia è stato studiato anche l impiego di molecole come gli oligonucleotidi formanti tripla elica di DNA detti TFOs, che sono in grado di alterare l espressione genica sia in vitro che in vivo. Gli esperimenti sono stati rivolti all attivazione dell espressione del gene per le -globine utilizzando TFO diretti contro il promotore di questo stesso gene. I risultati ottenuti in questo senso hanno fornito risultati interessanti, dal momento che uno di questi TFO è stato in grado di aumentare i livelli di emoglobina (29). Anche l attività di acidi peptico nucleici (PNAs) è stata investigata in questo senso, dal momento che queste molecole sono omologhe come struttura sia al DNA, che all RNA, ma presentano una catena peptica al posto dei residui saccaridici. Essi rappresentano un buon sistema per modificare l espressione di un gene ed hanno il vantaggio di essere 25

26 abbastanza resistenti alla degradazione da parte delle nucleasi. I PNAs sono in grado di legare sequenze omopuriniche o omopirimidiniche a livello del doppio filamento di DNA in modo specifico, formando un costrutto a tripla elica [PNA] 2 /DNA con un singolo filamento di DNA e creando una struttura detta D-loop nel sito di legame del PNA. Esperimenti in vitro hanno dimostrato la loro capacità di iniziare il processo di trascrizione ed è stata valutata la possibilità di utilizzare queste molecole per indurre l espressione genica di -globine. Infatti, sono stati disegnati dei PNAs diretti contro la regione 5 promotrice del gene per le -globine ed è poi stata valutata in vitro la modificazione dell espressione di un gene reporter ad esso associato (36). Un altro approccio terapeutico per la cura delle emoglobinopatie si basa su osservazioni sperimentali che dimostrano come i geni globinici non siano repressi in maniera irreversibile nelle cellule differenziate, per cui la loro espressione può essere facilmente riprogrammata in presenza o in assenza di appropriati fattori di regolazione (37). Diversi composti sono stati testati come agenti induttori del differenziamento eritroide; tra questi ampiamente indagata è stata l attività dell idrossiurea (HU). Il meccanismo con cui l HU incrementa l HbF in seguito ad un azione sui precursori eritroidi tardivi non è ancora del tutto chiaro. Le ipotesi sono molteplici: sembrano implicate la alterazioni delle cinetiche cellulari e gli effetti citotossici (34). Oltre ad incrementare i livelli di HbF, l HU produce anche un aumento delle dimensioni cellulari e del contenuto di emoglobina per cellula ed inibisce la proliferazione cellulare. L effetto massimo è stato ottenuto impiegando una concentrazione di 400 M, anche se buoni livelli di induzione sono stati ottenuti a concentrazioni inferiori, da 100 M a 200 M, con le quali la proliferazione cellulare è solo parzialmente inibita. L attività dell HU è stata valutata anche in trials clinici, dove nel 75% dei pazienti trattati con idrossiurea è stato dimostrato un incremento della sintesi di HbF (38). Anche il composto antitumorale cytosine arabinoside (ara-c), già in uso nel trattamento chemioterapico di diverse neoplasie umane come la leucemia acuta, ha dimostrato di avere effetto eritro-differenziante. L incremento di HbF in cellule K562 trattate è stato ottenuto con concentrazioni da 100 a 300 nm, alle quali tuttavia il farmaco presenta una forte tossicità. Alcuni studi hanno dimostrato che il trattamento contemporaneo con ara- C e retinoidi potrebbe mantenere l effetto differenziante dell ara-c a concentrazioni inferiori in modo da diminuirne gli effetti tossici (39). Anche dal punto di vista 26

27 farmacocinetico l impiego di ara-c presenta degli svantaggi; infatti, il tempo di emivita plasmatico della molecola è molto basso (40). Un altro agente induttore del differenziamento eritroide è la 5-azacitidina, un analogo della citosina che a differenza di questa non può essere metilato. Esperimenti condotti sui babbuini trattati con questo composto hanno dimostrato un aumento della sintesi di HbF. Sembra che il fatto che la 5-azacitidina non possa essere metilata sia responsabile della sua attività eritro-differenziante. Infatti, il grado di metilazione della sequenza contenente il dinucleotide CpG è importante nella regolazione dell attività genica e in particolare l ipometilazione è correlata con l espressione genica (41, 42, 43, 44). Sia il gene per le -globine, che quello per le -globine sono ipometilati durante il periodo fetale, mentre nell età adulta il gene risulta metilato. Ciò fa pensare che la metilazione sia uno dei meccanismi coinvolti nella diminuzione dell espressione di questo gene nell adulto (45). Pertanto, l incorporazione della 5-azacitidina nel DNA, una molecola che non può essere metilata, permette l espressione del gene -globinico anche nell adulto. Il composto non ha dimostrato invece effetto sull espressione del gene dal momento che questo è già ipometilato in età adulta. L uso in terapia della 5-azacitidina non è ancora possibile a causa dei suoi numerosi effetti tossici, ma la molecola potrebbe essere modificata in modo da ridurre l effetto citotossico in maniera selettiva, non alterandone le proprietà eritro-differenzianti (46). Il sale ferrico-cloridico del gruppo eme, l emina, ha anch esso potere eritrodifferenziante. Gli studi svolti in questo senso hanno dimostrato che il trattamento con emina produce un aumento specifico della produzione di HbF rispetto all emoglobina adulta nelle cellule K562. Lo stesso effetto si è riscontrato sia in cellule eritroidi isolate da donatori normali, che da pazienti talassemici. I risultati di questi studi indicano che l acquisizione di eme da fonti esogene quali l emina, incrementa la sintesi di HbF nei primi stadi della maturazione cellulare. Ciò fa supporre che, proprio la disponibilità di gruppi eme sia lo step limitante nel processo di sintesi dell emoglobina in questa fase. Sembra, inoltre, che l uptake dell emina sia fisiologicamente regolato da un recettore cellulare ancora poco conosciuto. I livelli di HbF in cellule trattate con questo induttore, sono massimi nei primi stadi della maturazione cellulare, ma si è dimostrato che rimangono più alti rispetto alle cellule non trattate anche nelle fasi successive del differenziamento cellulare. L effetto inducente dell emina può essere notevolmente intensificato dal sinergismo con altri agenti 27