Cara1eris4che della Hb

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Berta Grilli
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1 Emoglobina A (α2β2)

3 Cara1eris4che della Hb Legame Eme-catena polipeptidica dovuto alla coniugazione del Fe con l anello imidazolico della istidina in posizione 58 per α e 63 per β. L eme è una protoporfirina IX complessata ad un singolo atomo di Fe++ Il ferro rimane allo stato ferroso (Fe++) e non si trasforma in ferro ferrico (Fe++ +), cioè non si ossida nel suo legame con l ossigeno. Gli aa della tasca dell eme sono idrofobici per cui impediscono la penetrazione di H 2 O e CO 2 ma solo di O 2 e CO per cui formano un ambiente a bassa costante dielettrica. In questo modo l ossigeno può essere facilmente rilasciato Gli aa esterni sono invece idrofilici per rendere l emoglobina solubile

6 Eritropoiesi (eritropoie4na) Pro- eritroblasto: basofilia per elevata sintesi dell mrna per catene dell Hb Eritroblasto basofilo: inizia la produzione di Hb con riduzione del nucleo e croma4na disposta in blocchi. Eritroblasto policromatofilo: basofilia e acidofilia Eritroblasto ortocroma4co: per l elevata acidofilia il nucleo diventa picno4co e scompare Re4colocita: tracce di mrna disposto a re4colo Eritrocita maturo che rimane in circolo per h Avviene nell adulto nel midollo osseo dello sterno e della cresta iliaca

7 Emoglobina nel corso dello sviluppo α 2 γ 2 α-ζ catene di 141 aa β δ γ ε catene di 146 aa

8 Geni globinici

10 Stru1ura dei geni globinici

12 TATA box

14 Emoglobinopa4e (alterazioni qualita4ve) Sos)tuzioni missenso: HbS (β) pos 6 A>T acido glutammico>valina HbC (β) pos 6 G>A acido glutammico>lisina HbE (β) pos 26 G>A acido glutammico>lisina Hb KORLE (β) pos. 73 C>T acido aspar4co>asparagina METAEMOGLOBINEMIE pos 58 (α) 63 (β) is4dina>4rosina Hb instabili in aa che formano i legami inter e intra catene Hb Constant- Spring (α) T>C STOP>glutamina con catena più lunga di 30 aa Frame- shi6: Hb Cranston(β): inserimento di 2 bp tra Catena più lunga di 11aa Delezioni: Hb Freiburg (β) un aa pos. 23 Hb Gunn- Hill (β) 5 aa pos

18 RFLP- PCR

19 ASO- PCR DOT- BLOT : supporto non marcato (PCR) + oligo marca4 in soluzione REVERSE DOT- BLOT : : supporto non marcato (OLIGO) + PCR marcata in soluzione

20 REPORTER (R) GRUPPO AFFINE (A) An4corpo an4- DIG AVIDINA INDICATORI: fluorocromi - fosfatasi - perossidasi Rilevatori di fluorescenza colorimetrico - chemiluminescenza

23 α- talassemie

25 β- talassemie Morbo di Cooley (Talassemia major) anemia ipocromica microcitemica con splenomegalia e iperplasia midollare emazie con aumento della resistenza osmo4ca per aumento di Fe riduzione del volume globulare Hb bassa sideremia elevata β+ talassemie (Talassemia intermedia) Portatori del tra1o talessimico (Talassemia minor) volume globulare rido1o aumento della resistenza osmo4ca riduzione della HbA1 sideremia aumento della HbA2

26 β Talassemie Sos4tuzioni non senso codone 39 C>T stop (95%) Sos4tuzioni sito di splicing Delezioni intero gene pos 6 del A (2.1%) pos 76 del C (0.7%) β+ Talassemie Variazioni al 5 Variazioni al 3 variazioni alla regione consenso dei siti di splicing creazione di siti criptici dello splicing: introne G>A introne C>G Codone 26

27 exon splicing enhancer (ESE) Motivi classici di splicing

28 Normal exon exon exon 5 ss 3 ss 5 ss 3 ss IVS IVS Splicing Abnormalities 5 ss mutation; exon skipping 3 ss mutation; exon skipping 5 ss mutation; use of cryptic 5 ss 3 ss mutation; use of cryptic 3 ss Activation of cryptic 5 ss Activation of cryptic 5 ss and use of cryptic 3 ss Splicing enhancer mutation Lariat structure branchpoint mutation

32 δβ talassemie e HPFH

35 Perfetto bilanciamento stechiometrico α-globine : β globine : eme 2:2:4 Nelle β-talassemie si ha uno sbilanciamento della sintesi globinica con eccesso delle catene α, le quali precipitano formando inclusi nei precursori eritroidi. Questi corpi danneggiano la membrana per cui si ha la distruzione degli eritroblasti immaturi nel midollo osseo (eritropoiesi inefficace). I pochi eritrociti che sopravvivono e raggiungono il circolo periferico vengono rimossi dalla milza. Questa rappresenta la componente emolitica nelle β-talassemie. I quadri attenuati o aumentati per le β-talassemie sono dovuti a meccanismi che intervengono nell aumentare o diminuire lo sbilanciamento biosintetico la co-ereditarietà di due geni alfa deleti, che attraverso la ridotta produzione di catene α provoca una riduzione dello sbilanciamento biosintetico α/β. la variazione -196 C>T e la variazione -117 G>A nel promotore del gene A γ che aumentano la produzione di catene γ la variazione -158 C>T nel promotore del gene G γ che aumenta la produzione di catene γ

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