High Frequency of PIK3CA mutations in Adenoid Cystic Carcinoma of the Breast

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1 High Frequency of PIK3CA mutations in Adenoid Cystic Carcinoma of the Breast P. Cossu Rocca 1, S. Orrù 2, A. Manca 3, V. Marras 3, A. Piana 4, M.G. Uras 5, S. Ena 4, S. Serra 5, M.R. Muroni 5, M.R. De Miglio 5 1. Anatomia Patologica, Ospedale Giovanni Paolo II, ASL2, Olbia 2. Anatomia Patologica, Ospedale Oncologico, ASL8, Cagliari 3. Anatomia Patologica, AOU, Sassari 4. Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Sassari 5. Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università di Sassari

2 Premesse (1) Il carcinoma adenoido-cistico (ACC) è un raro istotipo di neoplasia mammaria con incidenza inferiore allo 0.1%. L ACC mammario è morfologicamente analogo alle più comuni varianti ad insorgenza nelle ghiandole salivari, e si caratterizza per la proliferazione di due popolazioni cellulari, luminali e mioepiteliali/basali, di piccole dimensioni, aggregate in strutture tubulari, cribriformi o solide. Dal punto di vista biofenotipico, l ACC è annoverato nella categoria dei Triple Negative, per quanto se ne distingua per la minore aggressività clinica. Data la scarsa incidenza, la caratterizzazione geneticomolecolare dell ACC è ancora limitata.

3 Premesse (2) Le mutazioni di PIK3CA sono comunemente riportate nei fenotipi neoplastici ER+/PR+, meno frequentemente nelle varianti triple negative, dove sembrano invece prevalere le mutazioni a carico di AKT. Mutazioni di PIK3CA sono state riconosciute in una piccola quota di ACC delle ghiandole salivari, mentre a tutt oggi è descritto un unico caso in letteratura di ACC mammario con mutazione di PIK3CA, caratterizzato da comportamento biologico aggressivo, con documentate metastasi renali. Il primo scopo del nostro studio è stato quello di identificare la presenza e valutare la frequenza di tali mutazioni in una piccola serie di ACC della mammella.

4 Premesse (3) La presenza di mutazioni di PIK3CA è stata frequentemente rilevata nei carcinomi squamosi dell orofaringe HPV correlati; peraltro, mutazioni di PIK3CA sono state identificate in circa il 30% dei casi di carcinoma squamoso e adenocarcinoma della cervice uterina, associate a prognosi sfavorevole. La presenza di acidi nucleici di HPV è stata inoltre dimostrata in varianti di ACC ad insorgenza nel distretto testa collo, specificamente nel tratto naso-sinusale, e nei rarissimi ACC descritti nella cervice uterina. Ulteriore scopo del nostro studio è stato quello di verificare la presenza di HPV DNA e di analizzare l espressione del marker p16 INK4a nei medesimi campioni di ACC della mammella.

5 Materiali e Metodi (1) Da 5 casi di ACC sono stati selezionati blocchetti in paraffina rappresentativi della neoplasia, da cui sono state eseguite sezioni seriate consecutive per le indagini immunoistochimiche (IHC) e genetico-molecolari. Le indagini IHC sono state eseguite con i seguenti anticorpi: ER, PR, Ki67, Her2 (HercepTest DakoCytomation Kit), EGFR (DakoCytomation-EGFRPharmDx Kit), CK5/6, CK/7, CK14, p63, pakt, PTEN e p16 INK4a (CINTec Histology Kit). L identificazione di HPV DNA è stata eseguita con la metodica di ibridazione inversa INNO-LiPA HPV Genotyping Extra, specifica per 28 genotipi virali.

6 Materiali e Metodi (2) L analisi mutazionale per il gene PIK3CA è stata eseguita mediante sequenziamento genico sugli esoni 9 e 20 codificanti, rispettivamente, per helical domain e kinase domain, che rappresentano le aree più frequentemente mutate. Primers disegnati per l amplificazione degli esoni 9 e 20: PIK3CA-Ex9F=5 GATTGGTTCTTTCCTGTCTCTG3, PIK3CA-Ex9R=5 CCACAAATATCAATTTACAACCATTG3, PIK3CA-Ex9F-NESTED= 5 TTGCTTTTTCTGTAAATCATCTGTG3, PIK3CA-Ex9R-NESTED= 5 TATGGTAAAAACATGCTGAG3 ; PIK3CA-Ex20F=5 TGACATTTGAGCAAAGACCTG3, PIK3CA-Ex20R=5 GGATTGTGCAATTCCTATGC3, PIK3CA-Ex20F-HEMINESTED= 5 TTACTTATAGGTTTCAGGAG3 Primers disegnati per il sequenziamento genico: PIK3CA-Ex9F-Seq=5 TAAATCATCTGTGAATCCAGAG3 ; PIK3CA-Ex20R-Seq=5 CCTATGCAATCGGTCTTTGC3

7 Risultati (1) Caratteristiche clinico patologiche L età d insorgenza era compresa tra 32 e 75 anni (m: 54); le dimensioni variavano da 14 a 60 mm (m: 27mm); lo stadio era T1c,N0 (2 casi); T1c,NX; T2,N0; T3,N1a. L IHC ha confermato il fenotipo Triple Negative ; Ki-67 era variabile da <1% al 30%. EGFR CK5/6 CK14 p63 L immunofenotipo si è dimostrato: EGFR+ (80%), CK5/6+ (80%), CK7+ (100%), CK14+ (100%), p63+ (80%).

8 Risultati (2) Assetto mutazionale di PIK3CA Il sequenziamento dell esone 9 del gene PIK3CA ha rilevato la mutazione E545A in tutti i 5 casi analizzati. Il codone GAG che codifica per Acido Glutammico è sostituito da GCG che codifica per Alanina. Specificamente, 4 casi presentano la mutazione in omozigosi e 1 caso in eterozigosi. In tutti i casi si è osservata attivazione della via PI3K/AKT/mTOR, evidenziata dall iperespressione IHC di AKT fosforilata (ser473). L IHC per PTEN, positiva nel 100% dei casi, appare indicativa per assenza di delezione genica. p-akt PTEN

9 Risultati (3) Ibridazione inversa per HPV La presenza di HPV DNA è stata dimostrata in 4 dei 5 casi (80%) di ACC analizzati. Specificamente, i 4 casi erano caratterizzati rispettivamente dalla presenza di ceppi HPV52 (High Risk), HPV6 (Low Risk), HPV6/31 (Low and High Risk), HPV+ non identificabile. Immunoistochimica per p16 L espressione di p16 INK4a è stata dimostrata in 4 dei 5 ACC, con specifica immunoreattività nucleo-citoplasmatica; la percentuale di cellule positive era variabile dal 20 al 60%, con intensità di colorazione da moderata a forte. L immunoreattività per p16 INK4a era rilevabile anche nell unico caso HPV-negativo, mentre uno dei 4 tumori HPV-positivi evidenziava negatività per p16 INK4a.

10 p16 INK4a

11 Discussione (1) I nostri risultati dimostrano, per la prima volta, che le mutazioni del gene PIK3CA sono particolarmente frequenti negli ACC della mammella. In particolare, la mutazione E545A possiede significato attivante in quanto interrompe l interazione inibitoria tra PIK3CA e il dominio SH2 N- terminale della subunità regolatoria p85. Tale mutazione rappresenta quindi un potenziale indicatore predittivo di risposta alle terapie molecolari nel trattamento di queste forme. Seppure con i limiti della casistica, i nostri dati non confermano la correlazione con il comportamento biologico aggressivo di tali neoplasie, come riportato nell unica esperienza precedentemente pubblicata.

12 Discussione (2) La presenza di acidi nucleici di HPV nel carcinoma mammario, determinata con varie metodologie e riportata con estrema variabilità di risultati, rappresenta ancora un problema controverso. Nella nostra limitata esperienza, gli ACC hanno dimostrato la presenza di HPV-DNA, sia a basso rischio che ad alto rischio, nell 80% dei casi. Recenti studi in vitro hanno dimostrato una stretta correlazione tra l effetto trasformante dell HPV e l iperespressione del gene PIK3CA, con attivazione della pathway PI3K/AKT. Questo dato, insieme alla già riportata compresenza di mutazioni di PIK3CA e HPV nei carcinomi di alcuni distretti, potrebbe suggerire un ruolo sinergico di questi fattori negli eventi della trasformazione e della progressione neoplastica.

13 Discussione (3) L iperespressione di p16 INK4a è stata identificata nell 80% degli ACC, ma la concomitante presenza di HPV-DNA è stata rilevata solo in 3 dei 5 casi analizzati. L iperespressione di p16 INK4a negli ACC non deve essere esclusivamente considerata come marker surrogato di infezione virale da HPV. In letteratura, l iperespressione di p16 INK4a è stata dimostrata in varianti basal-type di carcinoma mammario, morfologicamente reminiscenti dei carcinomi poco differenziati della cervice uterina HPVcorrelati, pur in assenza di infezione virale. Recentemente, l iperespressione di p16 INK4a è stata descritta in circa il 50% di una serie di tumori Triple Negative non altrimenti specificati, correlata a varianti poco differenziate (G3) con elevato Ki-67.

14 Conclusioni la presenza e l elevata frequenza di mutazioni di PIK3CA negli ACC della mammella può avere significato predittivo per la risposta alle terapie molecolari con inibitori della via di trasduzione del segnale PI3K/AKT; il reale significato della presenza di HPV-DNA negli ACC deve essere ulteriormente valutato mediante studi di ibridazione in situ ed esperimenti in vitro; l iperespressione di p16 INK4a, comunemente correlata con l infezione da HPV, deve essere interpretata anche in relazione ad alterazioni molecolari condivise dalle neoplasie a fenotipo Basal type, Triple Negative, pur in assenza di sicure connotazioni prognostiche almeno per gli ACC.

15 Bibliografia Vranic S, Bender R, Palazzo J, Gatalica Z.A review of adenoid cystic carcinoma of the breast with emphasis on its molecular and genetic characteristics. Hum Pathol Mar;44(3): Ho AS, Kannan K, Roy DM, Morris LG, Ganly I, et al. The mutational landscape of adenoid cystic carcinoma. Nat Genet Jul;45(7): Nichols AC, Palma DA, Chow W, Tan S, Rajakumar C, et al. High frequency of activating PIK3CA mutations in human papillomavirus-positive oropharyngeal cancer. JAMA Otolaryngol Head Neck Surg Jun;139(6): Ueno S, Sudo T, Oka N, Wakahashi S, Yamaguchi S, et al. Absence of human papillomavirus infection and activation of PI3K-AKTpathway in cervical clear cell carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 2013Jul; 23(6): Bishop JA, Ogawa T, Stelow EB, Moskaluk CA, Koch WM, et al. Human papillomavirus-related carcinoma with adenoid cystic-like features: a peculiar variant of head and neck cancer restricted to the sinonasal tract. Am J Surg Pathol Jun;37(6): Vranić S, Bilalović N, Lee LM, Kruslin B, Lilleberg SL, Gatalica Z. PIK3CA and PTEN mutations in adenoid cystic carcinoma of the breast metastatic to kidney. Hum Pathol Sep; 38(9): Henken FE, Banerjee NS, Snijders PJ, Meijer CJ, De-Castro Arce J, et al. PIK3CA-mediated PI3-kinase signalling is essential for HPV-induced transformation in vitro. Mol Cancer Jun 10;10:71. Subhawong AP, Subhawong T, Nassar H, Kouprina N, Begum S, Vang R, Westra WH, Argani P. Most basallike breast carcinomas demonstrate the same Rb-/p16+ immunophenotype as the HPV-related poorly differentiated squamous cell carcinomas which they resemble morphologically. Am J Surg Pathol Feb;33(2): Abou-Bakr AA, Eldweny HI. p16 expression correlates with basal-like triple-negative breast carcinoma. Ecancermedicalscience May 14;7:317. Bogina GS, Lunardi G, Marcolini L, Brunelli M, Bortesi L, Marconi M, Coati F, Valerio M, Guerriero M, Massocco A, Pegoraro MC, Zamboni G. P16 but not retinoblastoma expression is related to clinical outcome in no-special-type triple-negative breast carcinomas. Mod Pathol. 2013, Epub ahead of print.