Marcatori di differenziazione mioepiteliale nelle neoplasie delle ghiandole salivari

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1 Pathologica (2001) 93: Springer-Verlag 2001 ARTICOLO ORIGINALE F. Scarpellini G. Marucci M.P. Foschini Marcatori di differenziazione mioepiteliale nelle neoplasie delle ghiandole salivari Myoepithelial markers in salivary gland tumors M.P. Foschini ( ) G. Marucci Anatomia Patologica, Dipartimento di Oncologia, Università di Bologna, Ospedale Bellaria, Via Altura 3, I Bologna, Italia mariapia.foschini@ausl.bologna.it Tel.: Fax: F. Scarpinelli Anatomia Patologica, Ospedale Civile Bufalini, Cesena, Italia Riassunto Molte neoplasie delle ghiandole salivari presentano una differenziazione mioepiteliale, che non è sempre di semplice identificazione nei preparati di routine. Recentemente sono stati identificati nuovi marcatori di cellule mioepiteliali, quali calponina (CALP), caldesmone (CALD) e miosina a catene pesanti (MCP). Scopo del presente lavoro è di indagare se l impiego combinato di questi tre marcatori e di actina muscolo liscio (AML) può essere utile per evidenziare la componente mioepiteliale nelle neoplasie benigne e maligne delle ghiandole salivari. Sono stati studiati, con metodica immunocitochimica, mediante sieri anti-calp, -CALD, -MCP e -AML, 23 casi di neoplasie delle ghiandole salivari, così suddivise: adenoma pleomorfo (n=8), adenoma a cellule basali (n=3), mioepitelioma a cellule plasmocitoidi (n=2), carcinoma epimioepiteliale (n=6), carcinoma adenoido-cistico (n=4). In tutti i casi, almeno uno dei quattro marcatori studiati è risultato positivo. CALP e AML sono risultati i marcatori più frequentemente espressi. La positività era sempre localizzata nelle cellule mioepiteliali che costituivano lo strato esterno delle strutture ghiandolari e tubulari. Nelle neoplasie meno differenziate, le colorazioni immunoistochimiche hanno evidenziato rudimentali strutture ghiandolari. AML e CALP erano positive anche nei due casi di mioepitelioma a cellule plasmocitoidi. In conclusione, l impiego di più marcatori di cellula mioepiteliale è utile per evidenziare la differenziazione mioepiteliale e anche per una corretta diagnosi differenziale con altre forme neoplastiche. In particolare l uso combinato di AML e CALP permette un approccio ottimale per l identificazione della differenziazione mioepiteliale. Parole chiave Mioepitelio Actina muscolo liscio Calponina Caldesmone Miosina a catene pesanti Ghiandola salivare Key words Myoepithelial cells Smooth muscle actin Calponin Caldesmon Heavy chain myosin Salivary gland Introduzione Le cellule mioepiteliali hanno caratteristiche morfofunzionali in comune fra le cellule muscolari lisce e le cellule epiteliali. Esse formano lo strato esterno di dotti e acini delle ghiandole salivari, della mammella e delle ghiandole sudoripare, dove facilitano la secrezione ghiandolare e producono la membrana basale [1]. Tali cellule solitamente hanno nucleo allungato e citoplasma chiaro per accumulo di acqua, glicogeno o lipidi. Con le normali colorazioni routinarie con ematossilina-eosina si riconoscono con qualche difficoltà [2], pertanto solo tecniche ultrastrutturali e immunoistochimiche hanno consentito di evidenziare meglio e di studiare le cellule mioepiteliali. Le cellule mioepiteliali esprimono citocheratine e filamenti contrattili. Tra i vari filamenti di citocheratine quelli più espressi nel mioepitelio sono le citocheratine 4, 6, 13, 14 e 16 [3, 4]. La citocheratina 14, una proteina di 50 kda, è presente nel mioepitelio e nelle cellule basali delle ghiandole salivari, ma non negli elementi epiteliali [5, 6]. Le cellule mioepiteliali sono inoltre intensamente positive alla marcatra con siero anti-alpha-actina muscolo liscio (AML)

2 F. Scarpellini et al.: Marcatori mioepiteliali 663 [6, 7]. Tuttavia, anche i miofibroblasti possono esprimere AML [8], rendendo così difficoltoso identificare correttamente le cellule mioepiteliali nelle sezioni colorate con AML. Si sono cercati anche altri marcatori delle cellule mioepiteliali, quali la proteina S100 e la proteina acida gliofibrillare (GFAP). La proteina S100, viene considerata un marcatore tipico delle cellule mioepiteliali [9]. La GFAP non è una proteina specifica del mioepitelio, in quanto è presente negli elementi epiteliali sia acinari che duttali [10]. Recentemente, sono state riconosciute due proteine che regolano la contrazione del muscolo liscio, la calponina (CALP) e il caldesmone (CALD) e una componente strutturale dei filamenti spessi dell apparato contrattile del muscolo liscio: la miosina a catene pesanti (MCP). Queste ultime proteine sono presenti nelle cellule mioepiteliali normali [11] e sono utili per differenziare le cellule mioepiteliali dalle cellule epiteliali [12] e dai miofibroblasti che talora circondano le strutture ghiandolari [8]. Tuttavia, malgrado l ausilio di questi anticorpi, l identificazione del mioepitelio resta talora problematica, soprattutto nelle neoplasie dove, in alcuni casi, la differenziazione mioepiteliale è apprezzabile solo all esame ultrastrutturale. Scopo del presente lavoro è studiare neoplasie delle ghiandole salivari a componente mioepiteliale mediante anticorpi anti-calp, -CALD, -MCP e -AML per capire se queste colorazioni possano essere d ausilio diagnostico. Materiali e metodi I casi studiati sono stati selezionati dall archivio della Sezione di Anatomia, Istologia e Citologia Patologica M. Malpighi del Dipartimento di Oncologia dell Ospedale Bellaria, Università di Bologna. I tessuti sono stati fissati in formalina tamponata e inclusi in paraffina secondo metodica di routine. Da blocchetti selezionati sono state allestite sezioni seriate di 3 mm di spessore, colorate con ematossilina-eosina e sottoposte ad immunoistochimica con il sistema avidina-biotina-perossidasi su sezioni precedentemente trattate con poli-l-lysine (Sigma p-1524) [13]. Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi: anti-aml, anti-calp, anti-cald e anti-mcp. L utilizzo dell anticorpo anti-mcp ha previsto lo smascheramento antigenico secondo la seguente metodica: le sezioni vengono poste in tampone citrato per 6 min in pentola a pressione e quindi raffreddate in acqua corrente prima di iniziare la metodica immunoistochimica. Un elenco degli anticorpi utilizzati, la loro provenienza, il clone e la diluizione sono riportati nella Tabella 1. In ogni caso, la parete muscolare dei vasi è stata considerata come controllo positivo interno. È stata eseguita una valutazione semiquantitativa del numero di cellule mioepiteliali positive, attribuendo a ciascun caso un punteggio nel seguente modo: +++, > 75% delle cellule positive; ++, tra 75% e 25% delle cellule positive; +, < 25% delle cellule positive; +/, rare cellule positive. Inoltre, è stata valutata la distribuzione delle cellule positive con i marcatori in studio. Risultati Sono stati studiati 23 casi così distribuiti: adenoma pleomorfo (8 casi), adenoma monomorfo (3 casi), mioepitelioma a cellule plasmocitoidi (2 casi), carcinoma epi-mioepiteliale (6 casi), carcinoma adenoidocistico (4 casi). I dati clinici, riguardanti età e sesso dei pazienti e la sede della neoplasia sono riassunti nella Tabella 2; i risultati Tabella 1 Anticorpi utilizzati in immunoistochimica Nome M/P Ditta Clone Diluizione Actina muscolo liscio M DAKO 1A4 1:100 Calponina M BIOGENEX CALP 1:800 Caldesmone M BIOGENEX h-cd 1:800 Miosina catene pesanti M BIOGENEX SMMS-1 1:300 M, monoclonale; P, policlonale Tabella 2 Dati clinici dei pazienti Neoplasia Sesso (n) Età (anni) Sede (n) Adenoma pleomorfo F (4) \ M (4) (media 54) Parotide (6) Palato (1) Labbro (1) Adenoma a cellule basali F (3) (media 65) Parotide (3) Mioepitelioma M (2) (media 51) Palato (1) Parotide (1) Carcinoma epi-mioepiteliale F (3) \ M (3) (media 69) Parotide (5) Metastasi cerebrale (1) a Carcinoma adenoidocistico F (1) \ M (3) (media 54) Palato (3) Sottomandibolare (1) M, maschi; F, femmine a La neoplasia primitiva non è stata inclusa nel presente studio in quanto, essendo stata asportata presso un altro ospedale, non erano disponibili sezioni per immunoistochimica

3 664 F. Scarpellini et al.: Marcatori mioepiteliali Tabella 3 Risultati immunoistochimici ottenuti nelle neoplasie benigne Neoplasia No. caso CALP CALD MCP AML Adenoma pleomorfo Adenoma a cellule basali Mioepitelioma CALP, calponina; CALD, caldesmone; MCP, miosina a catene pesanti; AML, actina muscolo liscio Tabella 4 Risultati immunoistochimici ottenuti nelle neoplasie maligne Neoplasia No. caso CALP CALD MCP AML Carcinoma epi-mioepiteliale Carcinoma epi-mioepiteliale a cellule chiare Carcinoma epi-mioepiteliale solido Carcinoma epi-mioepiteliale solido, metastasi cerebrale Carcinoma adenoidocistico CALP, calponina; CALD, caldesmone; MCP, miosina a catene pesanti; AML, actina muscolo liscio delle colorazioni immunoistochimiche sono riassunti nelle Tabelle 3 e 4. Adenoma pleomorfo (8 casi). In tre casi la neoplasia aveva aspetto classico, caratterizzato da strutture ghiandolari, bordate da doppio stato di cellule e da cellule allungate o stellariformi, immerse in stroma mixoide o simil-cartilagineo. In un caso, lo stroma mixoide era particolarmente abbondante; in quattro casi, si trattava di forma cellulata. La positività immunoistochimica per i marcatori utilizzati era prevalentemente localizzata nelle cellule che formano lo strato esterno (non luminale) delle strutture ghiandolari (Fig. 1). I marcatori più rappresentati erano CALP e AML, presenti in 7 casi. Solo rare cellule allungate, localizzate nello stroma mixoide sono risultate positive con CALP (2 casi), CALD, MCP e AML (1 caso). Adenoma a cellule basali (3 casi). Due casi presentavano aspetto tubulare, caratterizzato da strutture ghiandolari bordate da uno strato interno di cellule a citoplasma eosinofilo che borda i lumi ghiandolari (cellule luminali) e da uno strato di cellule esterne (cellule non luminali). Il terzo caso presentava aspetto trabecolare, caratterizzato da cellule analoghe a quelle osservate nei due casi precedenti, ma organizzate in strutture trabecolari. AML, CALP e MCP sono risultati positivi nelle cellule non luminali, con una distribuzione e un intensità della positività maggiore rispetto a quella vista nell adenoma pleomorfo. Mioepitelioma a cellule plasmocitoidi (2 casi). Entrambi i casi erano costituiti da cellule con aspetto plasmocitoide, caratterizzate da citoplasma ampio ed eosinofilo e nucleo eccentrico. In un caso, sono risultati focalmente positivi al-

4 F. Scarpellini et al.: Marcatori mioepiteliali 665 Fig. 1 Adenoma pleomorfo. L anticorpo anti-calp è risultato positivo nelle cellule che formano lo strato esterno (non luminale) delle strutture ghiandolari. Le cellule allungate stromali sono in gran parte negative A cuni nidi di cellule per AML e CALP, negativi per CALD e MCP. Nell altro caso, tutti i marcatori studiati sono risultati positivi, con una più marcata e diffusa espressione di AML e CALP (Fig. 2). B Fig. 3 Carcinoma epi-mioepiteliale, metastasi cerebrale. La neoplasia era costituita da nidi di cellule a citoplasma chiaro. Sono presenti ampie aree di necrosi (A). L anticorpo anti-mcp è risultato positivo in alcune cellule neoplastiche (B) A B Fig. 2 Mioepitelioma con cellule ad aspetto plasmocitoide (A). L anticorpo anti-calp ha evidenziato una positività diffusa (B) Carcinoma epi-mioepiteliale (6 casi). In due casi, la neoplasia aveva un aspetto istologico classico, caratterizzato da strutture tubulari ben riconoscibili, circondate da uno strato di cellule luminali a citoplasma eosinofilo e da uno strato di cellule esterne, con citoplasma chiaro. In un caso, la neoplasia era costituita prevalentemente da ampi lembi di cellule chiare. In tre casi (uno dei quali era metastatico all encefalo), la neoplasia era costituita da ampi lembi di cellule poligonali o fusate, a citoplasma talora chiaro e talora eosinofilo, con ampie aree di necrosi (Fig. 3). In due casi, si è osservata positività per tutti i marcatori. AML e CALP sono risultati i marcatori più frequentemente espressi (rispettivamente, in 6 e 5 casi). Nei casi nei quali la componente tubulare era ben evidente, la positività era prevalentemente localizzata alle cellule chiare che costituivano lo strato esterno dei tubuli. Nei restanti casi, la positività tendeva comunque a delineare strutture tubulari (Fig. 4). Carcinoma adenoido-cistico (4 casi). Tutti i casi in esame avevano un architettura prevalentemente di tipo cribriforme. All indagine immunoistochimica, le cellule risultate positive sono quelle periferiche ai dotti e ai nidi epite-

5 666 Fig. 4 Carcinoma epi-mioepiteliale della ghiandola parotide. L anticorpo anti-calp evidenzia rudimentali strutture tubulari liali neoplastici. La massima espressione si è ottenuta con AML; CALP e MCP sono risultate focalmente espresse. CALD era presente in rare cellule in due soli casi. In tutti i 23 casi studiati, almeno uno dei quattro marcatori di cellula mioepiteliale era espresso. In particolare, in 22 casi si è osservata positività per AML. Il caso negativo era positivo con CALP. Gli stessi marcatori in nessun caso sono risultati positivi nelle cellule luminali delle strutture ghiandolari. Discussione Il ruolo del mioepitelio e il suo rapporto con l istogenesi dei tumori misti delle ghiandole salivari è, da sempre, un argomento molto dibattuto. Già Azzopardi ipotizzava un origine da cellule mioepiteliali modificate [14]. Studi più recenti, prevalentemente basati su dati ultrastrutturali, suggeriscono che la maggior componente cellulare, negli adenomi pleomorfi, sia rappresentata da cellule mioepiteliali neoplastiche [15-17]. Tuttavia, spesso le cellule neoplastiche mancano delle caratteristiche immunofenotipiche e ultrastrutturali delle cellule mioepiteliali normali; pertanto, resta difficile stabilire l origine mioepiteliale nei diversi tipi cellulari [12]. Nel presente lavoro, sono stati studiati 23 casi di neoplasie benigne e maligne delle ghiandole salivari con differenziazione mioepiteliale, mediante anticorpi anti-calp, -CALD, -MCP e -AML, che riconoscono filamenti contrattili, presenti sia nelle cellule muscolari lisce che nelle cellule mioepiteliali. In tutti i casi, almeno uno dei marcatori è risultato positivo. I due marcatori più frequentemente espressi sono risultati CALP e AML. In particolare, AML ha permesso di evidenziare la componente mioepiteliale in 22 casi. Nel restante caso, era positiva la CALP. Pertanto, l uso combinato di questi due marcatori permette un approccio ottimale sotto il profilo della sensibilità e specificità per l identificazione della differenziazione mioepiteliale. F. Scarpellini et al.: Marcatori mioepiteliali Non si è riscontrata nessuna relazione tra espressione dei diversi marcatori e benignità o malignità della lesione, oppure con il grado di differenziamento. La positività era generalmente localizzata nelle cellule che costituivano lo strato esterno (non luminale) delle strutture ghiandolari. Questa distribuzione era particolarmente evidente negli adenomi pleomorfi, adenomi a cellule basali, carcinoma adenoidocistico e nei casi di carcinoma epi-mioepiteliale con architettura tubulare. Nei casi di carcinoma epi-mioepiteliale costituiti da aggregati cellulari solidi, la positività con marcatori di cellula mioepiteliale ha comunque contribuito ad evidenziare rudimentali strutture ghiandolari. Solamente nei due casi di mioepitelioma puro la positività era diffusa e non evidenziava alcuna organizzazione architetturale. Questi dati confermano che le neoplasie in esame presentano una differenziazione in senso mioepiteliale. Inoltre, si precisa che si tratta di un mioepitelio modificato, che solo in parte presenta le caratteristiche fenotipiche delle cellule mioepiteliali normali. Risultati analoghi sono stati ottenuti da Savera e coll. [12] che hanno analizzato l espressione di AML, CALP e MCP su 65 adenomi pleomorfi. Nessuno degli anticorpi utilizzati ha evidenziato le cellule epiteliali dello strato luminale. AML e MCP erano essenzialmente limitate alle cellule localizzate alla periferia delle strutture ghiandolari. Inoltre, una positività all anticorpo anti-calp è stata riscontrata anche nel 60% delle cellule stromali. Gli Autori concludono che l espressione di queste proteine, specifiche della differenziazione muscolare liscia, è associata a differenziazione morfologica nel mioepitelio neoplastico. I mioepiteliomi ad aspetto plasmocitoide delle ghiandole salivari presentano un espressione non uniforme né costante di AML [7]. Questo ha portato alcuni Autori a dubitare della reale natura mioepiteliale di tali neoplasie [18]. Entrambi i casi qui studiati presentavano una positività per marcatori AML e CALP. Inoltre, in uno dei due casi, tutti i marcatori utilizzati sono risultati diffusamente positivi. Questi dati confermano pertanto la natura mioepiteliale anche delle neoplasie ad aspetto plasmocitoide. Evidenziare il mioepitelio neoplastico è importante, non solo a fini speculativi, ma anche a livello diagnostico, in quanto permette una diagnosi corretta anche quando la neoplasia è poco differenziata. Nella nostra casistica, l utilità diagnostica delle colorazioni immunoistochimiche, che evidenziano la differenziazione mioepiteliale, si è riscontrata in particolare in due casi: nel caso di metastasi cerebrale, è stato possibile confermare la compatibilità con la neoplasia parotidea asportata circa due anni prima; nel caso di carcinoma epi-mioepiteliale a cellule chiare, ha permesso la diagnosi differenziale con gli altri tipi di neoplasie a cellule chiare delle ghiandole salivari. In conclusione, i nostri risultati confermano l espressione di AML, CALP, MCP e in misura minore di CALD, in elementi che circondano cellule epiteliali di adenoma pleomorfo, adenoma a cellule basali, mioepitelioma, carcinoma epi-mioepiteliale, carcinoma adenoido-cistico, confermando

6 F. Scarpellini et al.: Marcatori mioepiteliali 667 la natura mioepiteliale di tali cellule. Tra questi marcatori AML e CALP erano più frequentemente espressi. Pertanto, l uso combinato di questi due marcatori permette un approccio ottimale sotto il profilo di sensibilità e specificità per l identificazione della differenziazione mioepiteliale. Si suggerisce, inoltre, che l applicazione di più marcatori può essere utile per evidenziare la differenziazione mioepiteliale e quindi nella diagnosi differenziale delle varie lesioni neoplastiche delle ghiandole salivari. Summary Salivary gland tumors frequently present myoepithelial cell differentiation that is not always easily identified on routinely stained sections. Recently novel markers of myoepithelium have been studied, such as calponin (CALP), caldesmon (CALD), and smooth muscle myosin heavy chain. These markers, together with smooth muscle actin may be useful tools for identifying myoepithelial cells. We immunohistochemically studied a series of 23 benign and malignant salivary gland tumors using antibodies to these four markers. The tumors were classified as follows: pleomorphic adenoma (n=8), basal cell adenoma (n=3), myoepithelioma with plasmacytoid cells (n=2), epithelial-myoepithelial cell carcinoma (n=6) and adenoid cystic carcinoma (n=4). All tumors were positive for at least one of the four markers. CALP and smooth muscle actin were the markers more frequently expressed. Positivity was mostly located in the myoepithelial cells that constitute the external layer of the glandular or tubular neoplastic structures. In poorly differentiated epithelial myoepithelial carcinomas, composed of solid sheets of neoplastic cells and sometimes of clear cells, immunohistochemical staining for myoepithelial markers evidenced rudimentary glandular structures. CALP and smooth muscle actin were positive in the two cases of myoepithelioma with plasmacytoid cells. In conclusion, the combined staining with four markers helps to disclose myoepithelial cell differentiation and can be a useful tool for the correct histopathological diagnosis of salivary gland tumors. Among the four markers studied, CALP and smooth muscle actin were the most useful to identify myoepithelial cell differentiation. Bibliografia 1. Caselitz J, Schmitt P, Seifert G et al (1988) Basal membrane associated substances in human salivary glands and salivary gland tumours. Pathol Res Pract 183: Flinner RL, Hammond EH (1993) The myoepithelial cell in lesions of the breast: a review. Pathol Ann 28: Dardick I, Parks WR, Little J, Brown DL (1988) Characterization of cytoskeletal proteins in basal cells of human parotid salivary gland ducts. Virchows Archiv [A] 412: Nagle RB, Bocker W, Davis JR et al (1986) Characterization of the breast carcinoma by two monoclonal antibodies distinguishing myoepithelial from luminal epithelial cells. 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