OGM-LAZIO Studio sperimentale sull analisi quantitativa di mais Geneticamente Modificato PROGETTI DI RICERCA NAZIONALI - REPARTO OGM & MICO

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1 DIFMIC Requisiti merceologici e sanitari di controllo: difettosità e micotossine nel mais Convenzione tra la AgriRete Service e l Istituto Superiore di Sanità (ISS) Finanziamento: ,00 Lo scopo del progetto è la realizzazione di una rete di monitoraggio della qualità merceologica e sanitaria delle quattro maggiori specie cerealicole (frumento duro, frumento tenero, orzo e mais) a livello nazionale L ISS effettuerà per il progetto le seguenti attività: Coordinamento delle attività scientifiche del progetto attraverso riunioni con i partecipanti al progetto; Formazione del personale addetto alle operazioni di campionamento nelle aziende interessate allo studio Coordinamento delle attività di campionamento Analisi delle micotossine emergenti Elaborazione statistica dei dati ottenuti e valutazione della correlazione tra difettosità e micotossine Divulgazione dei risultati acquisiti: I risultati attesi in termini quantitativi e qualitativi sono i seguenti: Monitoraggio qualitativo di oltre 1,5 milioni di tonnellate di cereali; Installazione di 44 nuove apparecchiature NIR/NIT presso i centri partecipanti; Messa in rete di 6 apparecchiature NIR /NIT già installate presso i centri partecipanti; Dotazione di kit per l analisi rapida in entrata delle micotossine in 29 centri; Analisi di circa 500 campioni di mais in due anni per le principali micotossine (aflatossine, fumonisine, ocratossine, deossinivalenolo) Correlazione tra difettosità e contaminazione da micotossine OGM-LAZIO Studio sperimentale sull analisi quantitativa di mais Geneticamente Modificato (GM) nelle coltivazioni di mais - metodologia di campionamento per le coltivazioni in pieno campo ( ) Convenzione tra la Regione Lazio e l Istituto Superiore di Sanità (ISS) Finanziamento: ,00 Lo scopo del progetto è quello di fornire agli organi della Regione Lazio preposti al controllo della presenza di piante di mais transgeniche, di un piano di campionamento dotato delle necessarie caratteristiche di rappresentatività, accuratezza e fattibilità. Il piano di campionamento sarà definito in base ai criteri scientifici descritti nell allegato tecnico. Al fine di disporre di un opportuno piano di campionamento per la determinazione quantitativa di piante GM in campi di mais, si propone di realizzare un campionamento intensivo in grado di stimare la concentrazione reale di piante GM nel campo. Sui campioni prelevati, sarà effettuata l analisi qualitativa di screening e l analisi quantitativa evento specifica con tecniche di real time PCR. Successivamente, attraverso l utilizzo di simulazioni basate su criteri statistici, sarà effettuata una comparazione tra piani di campionamento più ridotti ed il campionamento intensivo, al fine di individuare il piano di prelievo finale. Tale piano sarà utilizzato dall ARSIAL, Ente preposto alla realizzazione dei piani di monitoraggio OGM nella Regione Lazio L accordo di collaborazione tra l ISS e la Regione Lazio per la messa a punto e la validazione della metodologia di campionamento, è in grado di realizzare le seguenti ricadute: Fornire uno strumento operativo idoneo agli organismi deputati alla realizzazione della vigilanza sul territorio (ARSIAL); Ampliare le conoscenze sulla distribuzione di piante GM su campo; Verificare ed ottimizzare le metodologie statistiche attualmente utilizzate dall ISS per l elaborazione di dati; 1

2 OGM-SAMPLING Convenzione per l esecuzione della ricerca finalizzata 2009 ( ) Convenzione tra l Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e Toscana (IZS) e l Istituto Superiore di Sanità (ISS), finanziamento concesso dal Ministero della Salute bando giovani ricercatori 2009 Finanziamento: ,00 Responsabile Scientifico: dr.ssa Barbara De Santis Lo scopo del progetto è l implementazione della normativa europea in materia di tracciabilità ed etichettatura degli alimenti e mangimi. L Unità Operativa MICO provvederà all armonizzazione e allo studio di fattibilità delle procedure di campionamento descritte nella Raccomandazione CE 787/2004, anche a confronto con il Reg. 152/2009 CE ed applicabilità delle stesse per il controllo ufficiale; sviluppo di procedure analitiche e di un sistema di accreditamento a scopo flessibile per migliorare l efficacia e l efficienza del controllo analitico. Ci si pone l obbiettivo di definire una strategia di campionamento basata sul rischio lungo la filiera di produzione-trasformazione anche in relazione alle prevalenze osservate nei paesi d origine e alle quantità di prodotto importate annualmente in Italia; sviluppo di procedure analitiche efficaci ed efficienti in termini di numero di specie vegetali analizzate, numero di eventi GM rilevati e quantificati, riduzione di costi e tempi di esecuzione di analisi; linee guida per l applicazione del campo di accreditamento flessibile; sviluppo di una banca dati per archiviare tutte le informazioni. AUTISMO Ricerca Finalizzata Giovani Ricercatori Anno 2009: The relationship among food, mycotoxins, gastrointestinal disorders and autism: a multidisciplinary approach for the molecular investigation. ( ) Ministero della Salute bando giovani ricercatori 2009 Finanziamento: ,00 Lo studio di pone lo scopo di stabilire potenziali correlazioni tra la presenza di micotossine nella dieta e parametri clinici riscontrati in bambini affetti da autismo. Il progetto si sviluppa attraverso lo svolgimento di attività di 5 WP. Il WP ISS si occupa della validazione in house di metodi di analisi per la ricerca delle micotossine, della analisi quali/quantitativa di micotossine in campioni biologici e della analisi statistiche per correlare dati provenienti da WP1-2-3 e determinare la correlazione tra stato clinico dei pazienti e presenza di micotossine nei campioni biologici. Si mira all ottenimento di elementi conoscitivi utili per stabilire eventuali correlazioni tra parametri clinici di bambini autistici e presenza di micotossine nella dieta e nei fluidi biologici degli stessi. CELIACI - Progetto micotossine: Valutazione dell esposizione da micotossine in soggetti affetti da celiachia ( ) Convenzione tra l Associazione Italiana Celiachia (AIC) e l Istituto superiore di Sanità (ISS) Finanziamento: ,00 Lo studio si prefigge di predisporre una base conoscitiva ed informativa sull effettiva esposizione alle micotossine attraverso la dieta in soggetti affetti da morbo celiaco. In particolare, saranno definiti modelli di dieta ad hoc sulla base dei quali si effettuerà sia una valutazione dei consumi alimentari dei prodotti costituenti i modelli di dieta stessa, sia una campionatura di prodotti alimentari destinati ai celiaci e non, in siti di campionamento predeterminati e rappresentativi del territorio nazionale (centri ingrosso, punti vendita). Su tali campioni sarà effettuata l indagine conoscitiva relativamente alla contaminazione da aflatossine, ocratossina A, fumonisina e zearalenone. Al fine di completare il quadro conoscitivo di assunzione sarà impiegata, inoltre, una metodologia parallela ( duplicate diet ) su un numero ristretto di soggetti celiaci volontari (numero base di 2

3 partenza 30) e di corrispondenti gruppi di controllo, ai quali saranno prelevate porzioni dei tre pasti principali e di altri prodotti eventualmente consumati per die. Lo studio della duplicate diet sarà effettuato per due settimane e ripetuto due volte all anno. Infine, al fine di stabilire una correlazione lineare tra l esposizione cosi come valutata secondo quanto sopradescritto e la esposizione calcolata secondo approcci indiretti (biomarcatori), saranno prelevati campioni di fluidi biologici (latte materno, siero, urine) di mamme celiache e di un corrispondente gruppo di controllo, in allattamento, su cui effettuare l analisi delle micotossine. In tal modo si acquisiranno informazioni sull esposizione sia della mamma che del bambino. MICOPRINCEM - Micotossine principali ed emergenti nei cereali ( ) Progetto Definizione e validazione di metodiche analitiche utili per la determinazione di micotossine nei cereali - Piano Nazionale Cerealicolo - finanziato dal Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali. Finanziamento: ,00 Gli obiettivi che l U.O. ISS-MIC si pone nell ambito del progetto sono: Definizione e validazione di piani di campionamento per le micotossine Definizione e validazione di metodiche analitiche cromatografiche per la ricerca e determinazione delle micotossine emergenti nel mais, orzo e frumento Valutazione comparativa di test rapidi per la determinazione delle micotossine nei cereali Creazione di un database di raccolta dei dati prodotti dalle varie UU.OO facenti parte del progetto. La legislazione europea in materia di campionamento presenta ancora delle lacune relative alle misure di controllo da attuare nelle fasi del raccolto e post-raccolto. Lo studio che la UO intende fare porterà alla definizione di piani di campionamento ad hoc da proporre a specifici settori della filiera cerealicolo. Dalla valutazione comparativa emergerà un campionamento ideale in termini di fattibilità, affidabilità e costi associati. La rilevanza sanitaria delle micotossine maggiori oggi è ben nota, mentre, ad oggi, non è caratterizzato il rischio da micotossine emergenti quali gli alcaloidi dell ergot, la beauvericina, le enniatine, la moniliformina e la fusaproliferina per le quali è necessario acquisire informazioni a livello nazionale più attendibili e circostanziate. Il censimento sulla presenza delle micotossine emergenti oggetto di studio del progetto fornirà dati preziosi anche in vista delle richieste fatte in tal senso dalla DG SANCO della UE. Dal punto di vista analitico, la UO si propone di colmare la mancanza di metodi validati per le micotossine emergenti con la produzione di protocolli di metodi analitici validati che permettano l analisi sia delle micotossine emergenti che delle masse mycotoxins. Si darà la precedenza, ove possibile a protocolli che prevedranno analisi multimicotossina con vantaggi sia economici che di tempo. Allo stesso tempo si proporranno kit immunoenzimatici volti all analisi di micotossine emergenti che attualmente non sono disponibili in commercio. I possibili ostacoli che potrebbero essere incontrati sono principalmente da ascrivere sia ad una possibile mancata conformità ai parametri di validazione dei metodi cromatografici e/o dei metodi rapidi e di screening per la determinazione delle micotossine emergenti. In questo caso saranno attivate le azioni correttive per migliorare la efficienza dei metodi stessi attraverso un analisi delle possibili cause ed una attuazione di una serie di cambiamenti quali le miscele di estrazione, le grandezze dei campioni (sample intake), la quantità di micotossina caricata su colonna di immunoaffinità o su piastra enzimatica. Il piano di sfruttamento dei risultati prevedrà sia il trasferimento dei risultati a tutti gli operatori della filiera agro-alimentare sia alle Autorità Competenti ed alla DG SANCO della UE. La disponibilità di dati trasferibili è di fondamentale importanza per poter fondare su basi attendibili considerazioni attinenti la valutazione del rischio e la gestione del rischio da parte degli organi preposti. 3

4 USMAF - Attività e modalità pratiche di campionamento e di analisi di alimenti e materiali a contatto con alimenti nell ambito dei controlli ufficiali eseguiti dagli USMAF ( ) Convenzione tra Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio e Toscana e l Istituto Superiore di Sanità Progetto finanziato dal IZS Lazio e Toscana Finanziamento: ,00 Il progetto si pone come obbiettivo di realizzare uno strumento informatico divulgativo (DVD) recante la descrizione delle modalità con cui deve essere effettuato il campionamento nell ambito delle attività di controllo ufficiale a carico degli Uffici di Sanità Marittima, Aerea e di Frontiera (USMAF). Le attività previste riguardano l effettuazione in punti di entrata distribuiti sul territorio nazionale (porti ed aeroporti) di riprese filmate delle procedure di campionamento da per il controllo dei contaminanti nelle derrate alimentare importate. Si otterrà uno strumento divulgativo da utilizzare nei corsi di formazione per il personale degli USMAF. UNIONE SEMINATIVI - Rete Qualità Seminativi ( ) Convenzione tra l Unione Seminativi e l Istituto Superiore di Sanità Progetto finanziato dal Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali Finanziamento: ,00 Responsabile Scientifico: dr.ssa Barbara de Santis Nell ambito della collaborazione con l UNIONE SEMINATIVI, l ISS, referente scientifico per lo sviluppo e l attuazione delle azioni previste dal progetto, eseguirà le proprie attività secondo le annualità di seguito presentate: I anno: Acquisizione di informazioni sullo stato di contaminazione dei cereali relativamente alle micotossine. Lo studio dovrà necessariamente essere caratterizzato da procedure di campionamento e di analisi armonizzate, al fine di consentire una interpretazione univoca dei dati ottenuti. La raccolta dei campioni riguarderà alcuni siti situati nell ambito del network (sicuramente quelli nel quale si attiva il modello del sistema qualità), dislocati in varie località sul territorio nazionale. II anno: a) Correlazione dei dati ottenuti nel primo anno con quelli derivanti da campionamenti utilizzati per la valutazione di altri parametri qualitativi; b) Valutazione dei criteri di rendimento dei metodi di screening e confronto con metodi di conferma. III anno: a) Organizzazione di uno studio interlaboratorio di validazione/proficiency testing per la valutazione delle micotossine nei campioni oggetto dello studio, sia con metodi di screening che con metodi di conferma. b) Confronto tra kit ELISA e rapidi per la ricerca delle micotossine nei campioni oggetto dello studio, finalizzati alla acquisizione di informazioni relative al rendimento dei kit presi in considerazione in termini di precisione, accuratezza, sensibilità, cross-reattività e selettività. Queste informazioni saranno particolarmente utili per gli operatori che necessitano di risposte che siano allo stesso tempo veloci, ma anche affidabili, in modo tale da poter essere utilizzate in situ, in tempi reali e lungo tutta la filiera. Le aziende che saranno prese in considerazione saranno quelle che possono vantare prodotti di acquisita esperienza, affidabilità e costi contenuti. 4

5 FREERAY Valutazione della rappresentatività della procedura di campionamento di una massa in transito effettuato con l apparecchiatura denominata P1CK1 ( Convenzione tra la Freeray S.r.l. e l Istituto Superiore di Sanità Progetto finanziato dalla Freeray Srl Finanziamento: ,00 Responsabile Scientifico: dr.ssa Carlo Brera L obbiettivo è lo svolgimento di un protocollo di prova che consenta di verificare, in modo scientifico, se i campioni ottenuti con il prelevatore automatico, denominato P1CK1, sono rappresentativi della massa campionata relativamente alla contaminazione da micotossine. Saranno installati campionatori automatici in aziende private (molini, mangimifici, ecc.) e strutture pubbliche (USMAF, PIF, ecc) al fine di stabilire la comparabilità di campionamenti effettuati in automatico con quelli effettuati manualmente secondo la normativa vigente sulle micotossine. Il progetto è teso a valutare se i risultati forniti sono ripetibili. A tale scopo verranno effettuate più prove di campionamento che saranno condotte presso aziende private e strutture pubbliche sia su granaglie che su farine. BIOMIC - Valutazione dei fattori responsabili della contaminazione da micotossine nella granella di mais e frumento tenero derivanti da agricoltura biologica ( ) Progetto finanziato dal Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali. Finanziamento: ,92 Responsabile Scientifico e Coordinatore del Progetto: dr. Carlo Brera Le micotossine appartengono ad una classe di xenobiotici largamente diffusa a livello mondiale come risultante di infestazioni fungine che, in particolari condizioni di temperatura ed umidità, sono in grado di colonizzare pressoché tutte le coltivazioni, con particolare riguardo a quelle cerealicole. Più specificatamente, le micotossine sono contaminanti chimici prodotti dal metabolismo secondario di funghi microscopici filamentosi o muffe, che si sviluppano sulle colture vegetali in zone geografiche caratterizzate sia da clima fresco e temperato che da quello secco ed umido, in grado di influire sulla presenza di specie fungine dominanti. La FAO ha stimato che il 25% delle coltivazioni mondiali sono interessate alla contaminazione da micotossine, comportando un notevole impatto negativo sia sulla sicurezza d uso e sulla disponibilità di un gran numero di derrate alimentari, sia sulle produzioni su campo, sia infine sulle transazioni commerciali; questo anche in considerazione della notevole differenza che si riscontra nelle disposizioni legislative vigenti per i limiti massimi tollerabili nei paesi industrializzati ed in quelli in via di sviluppo, con gradienti che possono a volte essere di qualche ordine di grandezza. Le micotossine sono sostanze con spiccati effetti tossici, essendo caratterizzate da attività genotossica (aflatossina B1), cancerogena (aflatossine, fusariotossine), immunotossica, nefrotossica (ocratossina A) e teratogena (zearalenone). Fatta eccezione per il settore ittico, tutte le classi alimentari sono interessate dalla contaminazione da micotossine, con i cereali che rappresentano la fonte più rilevante di contaminazione, seguita dalla frutta secca ed essiccata, le spezie, i prodotti lattiero-caseari, il cacao, il caffè, i prodotti vitivinicoli ed i prodotti carnei. Per quanto riguarda le micotossine nei prodotti biologici non esistono, né a livello nazionale né a livello comunitario, disposizioni specifiche, in quanto tali prodotti rientrano nella legislazione generale che nel corso degli ultimi anni la Commissione Europea ha emanato per fissare i limiti massimi tollerabili per le diverse micotossine, sia nei cereali ed altri alimenti sia nelle materie prime destinate alla produzione di alimenti per 5

6 animali (settore alimentare: Regolamento CE/1881/2006 e, per le fusariotossine, Regolamento CE/1126/2007) (settore zootecnico: Raccomandazione CE/576/2006). In Italia dopo la campagna cerealicola del 2003, la problematica delle micotossine e quella connessa al loro controllo hanno interessato in modo rilevante tutti gli operatori di filiera con particolare riguardo alla produzione primaria. Tra i cereali, il mais rappresenta di gran lunga la fonte principale di rischio da micotossine, potendo essere interessato da una co-presenza di sostanze come le fumonisine, le aflatossine, l ocratossina A, lo zearalenone, ed il deossinivalenolo. In particolare, la fumonisina è la tossina riscontrata più di frequente nella granella di mais di produzione nazionale, spesso con valori prossimi o superiori ai limiti stabiliti. I fattori che concorrono alla formazione di muffe ed alla potenziale produzione di micotossine sono essenzialmente le condizioni climatiche degli areali di produzione, la suscettibilità varietale e la presenza/assenza di buone pratiche agricole mirate al contenimento dei fattori responsabili dell infezione fungina, come la rotazione delle coltivazioni, l utilizzo di appropriati programmi di irrigazione e concimazione, l epoca di semina e di raccolta, la tipologia di coltivazione, intensiva o estensiva, se convenzionale, integrata o biologica. Allo stato attuale delle conoscenze, la correlazione tra contaminazione da micotossine e tipologia di coltivazione, seppur studiata, non è stata ancora univocamente definita. Alcuni studi hanno evidenziato una maggiore incidenza di contaminazione nelle coltivazioni convenzionali rispetto a quelle bio e biotech associata però al riscontro di livelli di contaminazione maggiori nelle coltivazioni bio rispetto alle altre ed un effetto di abbattimento delle contaminazioni nelle produzioni biotech. Questi risultati non sono stati tuttavia dimostrati in modo univoco e non sono da considerare rappresentativi della situazione reale, con particolare riferimento a quella esistente in Italia. Inoltre, ancora più incerta, se non in alcuni casi totalmente mancante, è l informazione sulla combinazione dei fattori intrinseci ed estrinseci che sono alla base di una maggiore o minore sensibilità alla colonizzazione fungina ed alla produzione di micotossine nella produzione cerealicola, soprattutto quella ottenuta con metodi di coltivazione biologica. Infatti, anche se con un accurata pulizia della granella si ottiene una significativa riduzione della contaminazione, almeno per le aflatossine, è necessario studiare opportune misure preventive già nella fase di coltivazione, in modo tale da contenere il livello di contaminazione entro i limiti stabiliti dalla normativa vigente o da standard aziendali. Pertanto, sulla base di quanto descritto, ci si propone di valutare l impatto quali/quantitativo delle diverse pratiche agronomiche in uso nella produzione biologica sulla sicurezza d uso della granella di mais e frumento, con particolare riferimento alla rilevazione delle specie fungine ed alla valutazione del livello di contaminazione delle micotossine; saranno inoltre determinati tutti i più importanti elementi inorganici sia per valutare il loro ruolo come possibili modulatori della contaminazione da micotossine, sia per accertare la qualità e la sicurezza delle produzioni biologiche. A questo fine sarà selezionato un numero statisticamente idoneo di aziende operanti nel settore della produzione biologica di mais e di frumento tenero, da ricercarsi nel Nord e Centro Italia, rappresentative delle più diffuse modalità di gestione agronomica in uso e includendo le varietà più diffuse e quindi maggiormente rappresentative della produzione nazionale. Inoltre, per ogni azienda e partita campionata, sarà effettuata la determinazione dei parametri, che come variabili indipendenti, saranno oggetto, insieme alle variabili agronomiche, dell analisi statistica volta a valutarne l associazione e la correlazione con la variabili dipendenti (in primis la presenza e la concentrazione di micotossine). Le variabili indipendenti che saranno prese in considerazione saranno: (1) le componenti del suolo, con particolare riguardo alle condizioni del terreno e la disponibilità di nutrienti; (2) l apporto di macro e microelementi, che giocano un ruolo importante nel favorire le capacità di resistenza delle piante agli attacchi fungini; (3) le variabili climatiche. Questi fattori saranno studiati mediante ANOVA e metodi di analisi multivariata (Analisi delle componenti principali, ACP, Analisi delle componenti Multiple, ACM) al fine di valutare gli effetti delle pratiche agronomiche e mettere in luce le relazioni fra le variabili oggetto dello studio. Particolare attenzione sarà posta al campionamento impiegato per il prelievo dei campioni per l analisi delle micotossine che sarà condotto secondo protocolli rigorosamente 6

7 definiti, in quanto, data la estrema eterogeneità della distribuzione della contaminazione da micotossine, tale fase rappresenta uno dei punti particolarmente cruciali per la valutazione dello stato di contaminazione dei cereali e conseguentemente per l affidabilità delle informazioni derivanti dal progetto. Le micotossine che saranno ricercate saranno quelle desunte dall indagine relativa alla caratterizzazione delle specie fungine presenti in modo tale sia da verificarne la presenza a livello quantitativo sia da stabilire l incidenza di contaminazione contemporanea di più micotossine. Alla luce della forte relazione fra contaminazione da micotossine e andamenti stagionali, e al fine di garantire la massima rappresentatività delle informazioni ottenute, i campionamenti saranno effettuati in due anni consecutivi in tutte le aziende incluse nello studio. Inoltre, al fine di effettuare una valutazione comparativa, negli stessi areali geografici, saranno raccolti campioni di mais e frumento dei medesimi genotipi, ma ottenuti con pratiche agronomiche convenzionali o produzione integrata. Nei campioni prelevati sarà quantificata la contaminazione da micotossine e sarà confrontata con quella rilevata nelle produzioni biologiche. Infine, tra gli obiettivi del progetto vi sarà anche quello di predisporre le basi per la emanazione di specifiche linee guida che forniscano uno strumento per un utilizzo pratico da parte degli operatori delle filiere interessate. [Relazione Finale in PDF nella sezione progetti di ricerca del sito ME.DI.T.A. - MIUR Metodologie diagnostiche e tecnologie avanzate per la qualità e la sicurezza dei prodotti alimentari del mezzogiorno d Italia ( ) Interventi a sostegno della Ricerca Industriale a valere sul D.M. 8 agosto 2000 n. 593 Obiettivi realizzativi OR1: MBA - Metodi analitici su Batteri con tecnica Chip Array e loro evoluzioni Dopo circa quattro anni di lavoro, sono state portate a compimento tutte le attività di ricerca del progetto Me.Di.T.A in relazione a tutti gli obiettivi realizzativi, sia in ambito di ricerca industriale sia in ambito di sviluppo precompetitivo. Nello specifico, sono stati realizzati i microchip DNA e Proteina, sono state portate a termine le attività di ricerca e sviluppo per i sistemi di ossidazione degli ambienti di lavoro e delle derrate alimentari con ozono e ioni negativi, ed, infine, è stato concluso il sistema informatico di predizione sensoriale. Tutti i partecipanti hanno pienamente cooperato alla realizzazione del progetto ottenendo significativi risultati scientifici e tecnici sia in termini di conoscenze acquisite sia in termini di realizzazione di prodotti di interesse industriale. OR2: MMA - Metodi analitici su Micotossine con tecnica Chip Array e loro evoluzioni In questo periodo di rendicontazione, anche l ultima fase di verifica interna della funzionalità dei chip proteina array sulle matrici reali è stata portata a termine. Tale verifica è stata condotta accoppiando alla fase di rivelazione su chip varie tecniche di purificazione preliminare, quali l estrazione con solventi, la purificazione di immunoaffinità, la diluizione semplice. Il prodotto si è dimostrato funzionante rispetto alle matrici analizzate, con lo stesso comportamento tipico dei sistemi immunologici, ossia fortemente dipendenti dalle matrici analizzate in merito al protocollo estrattivo e di purificazione da adottare. A tutt oggi tale sistema è l unico in grado di funzionare sul supporto chip generando in modo soddisfacente dati e informazioni sia di tipo qualitativo che quantitativo. In questa fase ISS ha operato per la validazione dei Chip Array proteina prodotti da Neotron su matrici a titolo noto di tossina, determinate tramite utilizzo di tecnologia slurry e analizzatore LC MSMS ESI Q TOF. Nei laboratori ISS sono state applicate le tecnologie di estrazione multi-micotossina messe a punto nelle precedenti fasi alle matrici alimentari complesse da analizzare e sono state applicate le procedure di rivelazione su chip proteina precedute da purificazione di immunoaffinità ottenendo un ottima riproducibilità ed accuratezza dei dati rispetto a quanto atteso. 7

8 [Relazione Finale in PDF nella sezione progetti di ricerca del sito MICORID - Valutazione dello stato di contaminazione da micotossine degli alimenti zootecnici ( ) Progetto finanziato dal Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali. Finanziamento: ,00 Gli obiettivi che si intendono perseguire sono finalizzati alla acquisizione di dati attendibili sul reale stato di contaminazione da micotossine presente negli alimenti zootecnici sia di importazione di produzione nazionale. In particolare, saranno oggetto di studio dell U.O. i mangimi composti e le materie prime ed i mangimi di importazione. Le micotossine che saranno ricercate sono le aflatossine, l ocratossina A, lo zearalenone, le fumonisine ed i tricoteceni. Sarà contestualmente definito un metodo di analisi per HPLC-FLD allo scopo dia di acquisire l informazione relativa alla possibile copresenza delle micotossine di interesse (aflatossine, ocra tossina A e fumonisine) sia di favorire il rapporto numerosità campionaria / numero di analisi. Al fine sdi raggiungere gli obiettivi preposti è stato programmato il seguente piano di lavoro: codifica dei campioni ricevuti Messa a punto del metodo di analisi multi micotossina Valutazione descrittiva su basi statistiche dei risultati ottenuti. Le attività relative al piano di lavoro citato hanno riguardato la registrazione dei campioni e relativa suddivisione per classi ed in alcuni casi la doppia macinazione dei campioni per l ottenimento di un grado di macinazione omogeneo (0.5 mm.) tramite mulinetto ROMER RAS Mill e Retsch ZM200. Successivamente le aliquote sono state sottoposte ad analisi utilizzando il metodo di purificazione multimicotossina per la determinazione di Alfatossina (A), Ocratossina (O), Fumosine (F), Desossinivalenolo (D), Zearalenone (Z), T2 ed HT2 (metodo AOF DT2HT2Z). [Relazione Finale in PDF nella sezione progetti di ricerca del sito PROSCIUTTO - Valutazione di alcune caratteristiche peculiari della contaminazione da Ocratossina A nel Prosciutto di Parma ( ) Progetto finanziato dal Consorzio del Prosciutto di Parma. Finanziamento: ,00 Alla luce dei risultati che stanno emergendo dallo studio in corso e dal parere dell EFSA dell aprile 2006, secondo cui la soglia tossicologica giornaliera tollerabile (TDI) è stata portata da 5ng/kg pc/giorno ad una soglia settimanale di 120 ng/kg pc/sett corrispondente di fatto a circa 17 ng/kg pc/giorno, ci si proporne, dunque, lo sviluppo di un secondo studio avente i seguenti obiettivo: 1) valutazione della quota di rischio a cui il consumatore è esposto attraverso il consumo di prosciutto crudo; 2) valutazione comparativa dei livelli medi ci contaminazione da OTA in prosciutti di produzione estera (Spagna); 3) affinamento dei metodi di screening (ELISA) finalizzato ad una ottimizzazione delle performance del metodo attraverso la determinazione della OTA effettuata con differenti kit commerciali; 4) organizzazione di un secondo studio interlaboratorio per la validazione di un metodo HPLC per la determinazione della OTA in campioni di prosciutto crudo. Il progetto si articola in 4 fasi: Fase 1 Valutazione del rischio: 8

9 Viene predisposta una mappatura dei consumi in Italia in modo da orientare nel modo più corretto e rappresentativo la campionatura di cosce di prosciutto in quelle zone geografiche in cui si registra un consumo medio alto. Fase 2 Valutazione comparativa: Viene effettuata una valutazione comparativa tra campioni di produzione nazionale campioni di produzione estera, in particola re spagnola, e viene effettuato un monitoraggio per valutare lo stato di contaminazione da OTA in prosciutti tipo iberico e serrano. Fase 3 Affinamento della metodologia di screening: si rende necessaria l ottimizzazione di un metodo di screening in ELISA, in quanto dallo studio in corso sono sorte alcune difficoltà relativamente alla presenza di falsi positivi e di una costante sovrastima rispetto ai valori riscontrati con le analisi di conferma effettuate mediante HPLC-FLD Fase 4: Studio interlaboratorio di validazione: lo studio di validazione da effettuarsi con laboratori pubblici e privati sarà svolto prevedendo una fase preliminare volta alla verifica delle causali che possono essere intercorse nel primo studio interlaboratorio in cui un parametro, l esattezza, non è risultato rispondente a quanto previsto dalla normativa cogente a livello comunitario. Successivamente sarà attivato lo studio con duplice finalità, vale a dire la validazione del metodo per HPLC e del metodo per ELISA. PROSCIUTTO - Valutazione di alcune caratteristiche peculiari della contaminazione da Ocratossina A nel Prosciutto di Parma (2008) Progetto finanziato dal Consorzio del Prosciutto di Parma. Finanziamento: ,00 Il progetto intende sviluppare alcune tematiche di rilievo al fine di: Stabilire criteri analitici standardizzati che permettano la determinazione affidabile e sicura dell OTA nella porzione superficiale e in quella interna, sia grassa che magra, del prosciutto crudo stagionato. Definire un pian odi campionamento finalizzato alla verifica della distribuzione della tossina nelle varie porzioni del prodotto anche in funzione del fungo produttore di tossina stessa. Il programma di attività da svolgere si articola in varie fasi: 1) valutazione dei parametri microbiotici e chimicofisici potenzialmente responsabili della incidenza di contaminazione da OTA nei prosciutti ; 2) messa a punto di un piano di campionamento per il prelievo di campioni rappresentativi della forma di prosciutto diversificati per contenuto in grassi e valore di Aw; 3) messa a punto di un sistema rapido di determinazione della OTA; 4) messa a punto di un sistema diagnostico quantitativo per la determinazione della OTA; 5) valutazione statistica dei risultati. Si vuole acquisire dati scientificamente indispensabili per orientare le misure di prevenzione al fine di ridurre o eliminare la contaminazione da OTA nei prosciutti. SIGRAD Studio sull'influenza del processo di macinazione sul contenuto di Ocratossina A e sua distribuzione nei prodotti di molitura ( ) Progetto finanziato dalla Società Interprofessionale Grano Duro Finanziamento: ,00 Ci si propone di valutare l influenza dei processi di lavorazione industriale del grano duro (prepulitura, pulitura e successiva macinazione) sul contenuto di ocratossina A e la sua ripartizione relativa nei diversi prodotti e sottoprodotti derivati (grano non pulito, grano dopo pulitura, farinetta, semola, pasta). 9

10 Attraverso l allestimento di analisi in HPLC per il monitoraggio della concentrazione di Ocratossina A nei campioni. Il metodo prevede l estrazione con solvente organico, un clean up con colonnine di immunoaffinità IAC, analisi strumentale con cromatografia liquida ad alta prestazione HPLC e rivelazione fluorimetrica. Si vuole raccogliere nuove informazioni sull effetto dei processi di pulitura e molitura industriale sulla distribuzione della tossina, ed informazioni sulla ripartizione della concentrazione della micotossina negli scarti. IZS MEZZOGIORNO - Strategie per l analisi multi-classe e multi-residuo di biotossine ed altri contaminanti ambientali in alimenti di origine animale e vegetale mediante spettrometria di massa con rivelatore ibrido _ ( ) Progetto finanziato dal Ministero della Salute, IZS ME 01/08 RC. Coordinatore del Progetto: Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno (Portici) Responsabile scientifico: dr. Carlo Brera Il regolamento 1881/2006 ha predisposto misure preventive per mantenere il tenore di alcuni contaminanti potenzialmente presenti negli alimenti a livelli accettabili per la tutela della salute pubblica. Analogamente, la Raccomandazione della Commissione del 17 agosto 2006 sulla presenza di alcune micotossine quali deossinivalenolo, zearalenone, ocratossina A, tossine T-2 e HT-2 e fumonisine in prodotti destinati all alimentazione degli animali, pur non fissando limiti massimi tollerabili, ha individuato valori guida da utilizzare da parte degli stakeholders nei piani di autocontrollo aziendali. Attualmente si è attualmente nella posizione di poter effettuare pochi campionamenti destinati alla ricerca di micotossine singole, con notevole dispendio di risorse economiche ed umane. Nasce pertanto la necessità di razionalizzare gli interventi mirati al controllo delle micotossine sopracitate con l ottica di limitare sia i costi sia il numero del personale impiegato. Le attività previste dall UO consistono nell effettuare: a) Campionamenti di materie prime e mangimi sia di importazione che di produzione nazionale b) Analisi multi-micotossina utilizzando sia metodi di screening che di conferma c) Valutazione statistica dei risultati Le attività elencate al punto precedente saranno effettuate con la seguente metodologia: L attività descritta al punto a) sarà effettuata prelevando campioni di materie prime e mangimi secondo le procedure descritte dal regolamento 401/2006 o dal Decreto Ministeriale 20 aprile Le matrici importate saranno campionate o presso il porto di entrata o presso le aziende di destinazione, mentre quelle di produzione nazionale saranno campionate presso mangimifici, centri di stoccaggio, o allevamenti. Sarà preferita una modalità di campionamento dinamica piuttosto che statica e si valuterà l opportunità di campionare in modo automatico rispetto a quello manuale. Le matrici da campionare saranno quelle per cui è previsto o un limite massimo tollerabile o un valore guida, vale a dire materie prime come il mais, l orzo, il cotone e mangimi complementari. L attività descritta al punto b) che costituisce la fase principale del contributo della UO sarà effettuata con l analisi dei campioni prelevati, sia con metodi di screening ELISA, che di conferma; in particolare, i campioni in cui sarà stata riscontrata la presenza contemporanea di più di una micotossina saranno analizzati tramite l utilizzo di un metodo multi-micotossina basato sul principio di estrazione con solventi organici, purificazione su colonnine di immunoaffinità ed analisi per UPLC-MS/MS. L utilizzo nella fase della determinazione quantitativa della spettrometria di massa MS/MS con triplo quadrupolo consentirà di identificare in modo univoco l identità chimica delle micotossine presenti. In linea generale le micotossine ricercate saranno deossinivalenolo, zearalenone, fumonisine, tossine T-2 ed HT-2, aflatossine ed ocratossina A. L attività descritta al punto c) sarà effettuata utilizzando metodologie statistiche allo scopo di verificare la copresenza di micotossine ed eventuali correlazioni tra la provenienza del mangime, la tipologia di stoccaggio, la matrice e la presenza e/o il livello di contaminazione delle micotossine. Le tecniche statistiche utilizzate saranno: test del chi-quadro, coefficienti di correlazione, analisi della varianza, ed analisi fattoriali. Gli obiettivi che saranno perseguiti saranno relativi ai seguenti punti: 10

11 a) ottenere una campionatura di alimenti destinati alla zootecnia rappresentativa dello stato di contaminazione da micotossine. b) disporre di un metodo di analisi multi-micotossina per poter valutare la presenza contemporanea di più micotossine nello stesso campione. Questo strumento diagnostico potrà essere utilizzato in modo innovativo sia nelle attività di controllo ufficiale, sia nelle attività di autocontrollo. c) ottenere una mappatura del rischio derivante dalla presenza delle micotossine negli alimenti zootecnici presi in considerazione. LATTRANS - Valutazione quali/quantitativa di DNA transgenico nel latte di prodotto da aziende a differenti tipologie di stabulazione ( ) Studio finanziato dalla Società Produttori Sementi S.p.A. Impresa strumentale della Fondazione Cassa di Risparmio di Bologna. Finanziamento: ,67 Ci si propone di verificare la natura, endogena o esogena della presenza di DNA transgenico nel latte di massa. Inoltre, nel caso di accertata presenza esogena, saranno valutate le condizioni di allevamento che possano impedire il verificarsi della cross-contamination. Gli OGM presi in considerazione in questo studio saranno la soia Round-up Ready, il mais Bt11, Bt176, G21, Mon 810, T25, Mon 863, NK 603 e di mais Il progetto prevede tre fasi operative: Messa a punto di metodologie di campionamento e analisi; Sperimentazione nei mangifici; Sperimentazione negli allevamenti. I risultati attesi dovranno fornire informazioni sulla natura (endogena o esogena) dell eventuale presenza di DNA transgenico nel latte. Nel caso di accertata presenza esogena saranno individuate le condizioni operative e logistiche degli allevamenti che portano alla contaminazione individuata. Nel caso di accertata presenza endogena negli allevamenti con utilizzo di mangime GM verranno valutate le eventuali correlazioni tra sistema di allevamento (percentuale di materiale GM nei mangimi, condizioni di stabulazione ecc.) e residui di materiale transgenico nel latte. [Relazione Finale in PDF nella sezione progetti di ricerca del sito MICOCER - Valutazione e controllo della contaminazione da micotossine nelle produzioni cerealicole nazionali ( ) Convenzione tra l Istituto Sperimentale per la Cerealicoltura e l ISS Finanziato da Regione Lombardia nell ambito dei Programmi Interregionali III fase. Finanziamento: ,00 Coordinatore e Il progetto interregionale MICOCER (MICOtossine dei CEReali), valutazione e controllo della contaminazione da micotossine nelle produzioni cerealicole nazionali, nasce con lo scopo, tra gli altri, di fornire un quadro complessivo del livello di contaminazione de a micotossine nel mais e nei frumenti, attraverso l acquisizione di informazioni diffuse, comparabili e rappresentative delle diverse condizioni di coltivazione. Dato l elevato numero di campioni previsto si è scelto di utilizzare per le analisi delle micotossine un metodo di screening immunoenzimatico. Al fine di poter valutare l efficienza del metodo e dei laboratori coinvolti nello studio di monitoraggio sono stati organizzati degli studi interlaboratorio di validazione. Durante l intero periodo di svolgimento delle attività del progetto sono stati organizzati tre studi di validazione interlaboratorio, uno per la determinazione delle fumonisine (FBs) in campioni di mais e due per la determinazione del deossinivalenolo (DON) in campioni di grano tenero. L analisi statistica dei risultati ha 11

12 evidenziato una tendenza del metodo immunoenzimatico a sovrastimare il dato ottenuto tramite l analisi in HPLC ed utilizzato come valore di riferimento. Tuttavia i metodi si sono dimostrati adeguati allo scopo (monitoraggio di numerosi campioni) ed hanno anche mostrato una buona concordanza con i criteri di rendimento riportati nel Regolamento CE/401/2006. IZS LAZIO E TOSCANA - Validazione di metodiche analitiche per la determinazione quantitativa di eventi di trasformazione di varietà di mais autorizzati nell'unione Europea" ( ) Progetto Finanziato dal Ministero della Salute Responsabile del progetto: Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio e Toscana Finanziamento: ,00 Responsabile Scientifico: dr.ssa Roberta Onori Nell ambito del controllo ufficiale degli alimenti, la validazione e la successiva divulgazione delle metodiche analitiche quantitative rappresenterà un progresso nell armonizzazione della diagnostica attualmente utilizzata dalle differenti strutture preposte al controllo ufficiale degli alimenti. L IZS del Lazio e della Toscana, in qualità di Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGM di concerto con l ISS trasferirà le Procedure Operative Standa5rd ed i rapporti di validazione ai laboratori della corretta applicazione dei metodi. Sono stati resi disponibili metodi analitici in PCR real time per la determinazione quantitativa specifica del mais MON810, Bt11 e T25, con relativi rapporti di validazione e Procedure Operative Standard. Al termine del progetto i metodi validati sono stati accreditato secondo le norme ISO/IEC/EN ed applicati alle prove ufficiali per la verifica dell ottemperanza alla normativa comunitaria (Reg. CE 1829/2003 e 1830/2003) di prossima applicazione. 12