Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie per la salute. Prof.ssa R. Tomaiuolo

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1 Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie per la salute Biochimica clinica Argomenti della lezione: Il Glucosio Il laboratorio nel metabolismo del glucosio IL METABOLISMO GLUCIDICO Il glucosio e gli acidi grassi sono le principali fond di energia Glucosio libero (plasma e liquidi extracellulari): 20 gr. Glicogeno epadco: gr Glicogeno muscolare: 200 gr In condizioni fisiologiche la concentrazione glicemica a digiuno (<100 mg/dl o 5.6 mmol/l) è mantenuta dalla coesistenza simultanea e bilanciata dell u"lizzo e della produzione del glucosio Prof.ssa R. Tomaiuolo il 60-80% del glucosio si rinnova nelle 24 ore La glicemia a digiuno La concentrazione del glucosio nel sangue è una variabile omeostatica: l organismo tende a mantenere le oscillazioni della glicemia entro valori ben controllati L omeostasi glicemica dipende da: adeguata introduzione di glucosio con la dieta udlizzazione periferica di glucosio riserva epadca di glucosio (glicogeno) faxori ormonali Scopi: ~ garantire un apporto di glucosio costante al SNC, anche in condizioni di digiuno ~ Immagazzinare glucosio nel periodo postprandiale sotto forma di glicogeno INSULINA Proteina composta da 2 catene polipepddiche (A e B) connesse da 2 pond disolfuro, 51 aminoacidi, PM=5800 Deriva dalla proinsulina per distacco di un pepdde di connessione (C- pepdde) Il principale elemento regolatore della secrezione insulinica è il glucosio SDmolano la secrezione insulinica anche mold aminoacidi, ormoni gastrointesdnali (secredna, gastrina, VIP, GIP, colecistochinina), glucagone, sistema parasimpadco AZIONE DELL INSULINA Le azioni dell insulina sono globalmente anaboliche Essa infa]: a]va la rimozione del glucosio dal circolo (promuove l entrata del glucosio nelle cellule del muscolo, del miocardio, del tessuto adiposo) a]va la sintesi di glicogeno a]va la conversione del glucosio in lipidi a]va la conversione degli ac. grassi in lipidi a]va la captazione di aa da parte del fegato e del muscolo scheletrico e la successiva sintesi proteica L azione dell insulina non interessa il cervello, le emazie, il cristallino ed il glomerulo renale. 1

2 IPOGLICEMIA E CONTROREGOLAZIONE Controregolazione: l'insieme di tuxe le risposte, nervose ed ormonali, tese a riportare la glicemia entro valori normali. Si innesca quando la glicemia scende soxo i 60 mg/dl. Meccanismi della controregolazione: Ormonali (glucagone, adrenalina, ormone della crescita, cordsolo) Neuronali (noradrenalina secreta dai neuroni postgangliari) Autoregolatori ( produzione epadca di glucosio) Metabolici (udlizzazione di substrad alternadvi al glucosio) Parametri per la valutazione dell omeostasi glicemica Glicemia Emoglobina glicata Glicosuria Chetonuria/emia Glicemia Valuta la quandtà di glucosio presente nel sangue al momento del prelievo. Può essere udlizzata: per la valutazione retrospe]va dell equilibrio metabolico in termini predi]vi per l adeguamento terapeudco Metodiche di dosaggio Enzimatiche Self-monitoring: metodiche colorimetriche ed amperometriche Può essere valutata: come misurazione basale (al ma]no prima della colazione) nel corso della giornata (profilo glicemico) Il campione biologico per la valutazione della glicemia il prelievo deve essere eseguito dopo 6-8 h di digiuno Campione biologico: plasma, siero, sangue intero. TuXavia, è preferibile che la glicemia sia misurata su plasma. nel sangue venoso la glicemia è più bassa del 5-10% rispexo al sangue arterioso. Per effexuare la glicemia occorre separare presto il plasma o il siero, perché gli eritrocid consumano glucosio, quindi diminuiscono la glicemia (circa 6 mg/dl/h) Ideale: udlizzare fluoruro come andcoagulante (poiché inibisce la glicolisi, e quindi limita il consumo di glucosio da parte degli eritrocid). se il plasma non può essere separato dalle cellule entro 60 min, la provexa deve contenere un inibitore della glicolisi (NaF, iodoacetato sodico) Metodi enzimadci di dosaggio del glucosio Esochinasi: metodo di riferimento Glu + ATP > Glu- 6P + ADP Glu- 6P + NADP > 6P- gluconato + NADPH Glucosio deidrogenasi: (può subire l interferenza dello xilosio) Glu + NAD > gluconolaxone + NADH (meglio con aggiunta di mutorotasi) In queste due reazioni, si valuta la variazione delle concentrazioni di NADH o NADPH spexrofotometricamente. Glucosio ossidasi: (risente di interferenza da parte di sostanze riducend, es. glutadone) Glu+ O2 > Acido gluconico + H 2 O 2 H 2 O 2 + cromogeno ridoxo > cromogeno ossidato + H 2 O In quest uldma reazione si valuta la variazione di concentrazione del cromogeno spexrofotometricamente. 2

3 Omeostasi del glucosio Glicemia a digiuno: tra 70 e 100 mg/dl (su sangue venoso) Glicemia post- prandiale: fino a 180 mg/dl, con ritorno al valore basale entro 2-4 ore (a 2 ore deve essere < 140 mg/dl) CV intra- individuale per la glicemia: 5-15% Sintomi da iperglicemia compaiono per valori >230 mg/dl. Valore cridco (al di sopra del quale vi può essere rischio per le funzioni vitali): 480 mg/dl (il laboratorio deve tempesdvamente darne comunicazione) Sintomi da ipoglicemia compaiono per valori <50 mg/dl Valore cridco < 46 mg/dl Significato clinico Le fluxuazioni intra- individuali nelle 24 ore sono quelle più alte rispexo a tu] gli altri parametri del sangue (a causa di a]vità muscolare, introduzione di cibo) Standardizzare l ora del prelievo ed il Dpo di campione biologico (digiuno da 8 h, plasma separato entro 1 h, eparina + NaF) Il valore soglia per il sospexo di diabete corrisponde oggi a valori di glicemia >126mg/dL (criteri ADA*2006) *ADA: american diabetes associadon L'esempio Il Diabete Mellito Incidenza = 5-10 % negli aduld > 40 anni Disordine del metabolismo glucidico caraxerizzato da un assoluta e/o reladva assenza di insulina e insulino- resistenza a cui segue iperglicemia Sindrome caraxerizzata da aumento dei livelli emadci di glucosio (iperglicemia): a digiuno 126 mg/dl 2h dopo carico orale di glucosio 200 mg/dl (microangiopatia, neuropatia e macroangiopatia) Comporta il rischio di complicanze acute (coma iperglicemico) e croniche Il Diabete Mellito: categorie ADA Diabete di Bpo 1 = distruzione delle beta cellule, con perdita della secrezione di insulina Immuno- mediato (auto- andcorpi), giovanile e dell adulto idiopadco Diabete di Bpo 2 Prevalente insulino- resistenza e reladvo deficit di insulina Prevalente deficit di insulina e reladva insulino- resistenza Diabete di altro Dpo = farmaci, sostanze chimiche, dife] genedci Diabete mellito gestazionale IGT = impaired glucose tolerance IFG = impaired fasdng glucose, ossia l'alterazione dei livelli di glicemia a digiuno (a digiuno compresa tra 100 e 125mg/dl) NB = I paziend IGT e/o IFG devono essere ricontrollad ogni anno Glicemia a digiuno In condizioni fisiologiche <100 mg/dl (5,6 mmol/l) Diabete > 126 mg/dl IFG e IGT mg/dl Criteri per la diagnosi di Diabete ADA 2006 Sintomi legad al diabete (poliuria, polidispia ed inspiegabile perdita di peso) e rilievo casuale di glicemia plasmadca >200 mg/ dl (Casuale significa in qualsiasi momento indipendentemente dalla distanza dall uldmo pasto) Oppure" " Glicemia plasmadca a digiuno (FPG) >126 mg/dl (a digiuno significa distanza >8 ore dall uldma ingesdone di cibo o bevande caloriche) Un valore di iperglicemia che non soddisfa i criteri diagnosdci per il diabete deve essere rivalutato con un carico orale di glucosio (OGTT) 3

4 La diagnosi del DIABETE MELLITO Sintomi clinici ed una glicemia random 200 mg/dl Glicemia a digiuno (da almeno 8 ore) 126 mg/dl In assenza di sintomi è opportuno che il valore della glicemia a digiuno venga confermato in più misurazioni. Glicemia a due ore dal carico orale di glucosio 200 mg/dl Intolleranza al glucosio (IGT): glicemia 140 mg/dl ma <200 mg/dl a 2 ore dal carico orale di glucosio. Alterata glicemia a digiuno (IGF): glicemia a digiuno tra 110mg/dl e 125 mg/dl TEST DI CARICO ORALE DI GLUCOSIO (OGTT) esecuzione Nei tre giorni precedend dieta contenente almeno 150 g di carboidrad e a]vità fisica normale. Digiuno da circa 12 ore. Durante l esecuzione del test il soggexo deve rimanere seduto e non deve fumare. Prima dell inizio del test viene effexuato un prelievo di sangue venoso per determinare la glicemia a digiuno. Il soggexo assume poi 75 g di glucosio anidro sciold in 250 ml di acqua nell arco di 5 minud Nei bambini la quandtà di glucosio somministrato è pari a 1.75 g di glucosio per Kg di peso corporeo fino ad un massimo di 75 g. Dopo due ore viene effexuato un ulteriore prelievo di sangue venoso per la determinazione della glicemia. Il tempo viene valutato dal momento in cui il soggexo inizia a bere. OGTT: test di tolleranza al glucosio per via orale Somministrare 75 g di glucosio anidro in ml di acqua in 5 minud Criteri ADA 2006:» Glicemia a digiuno: meno di 100 mg/dl» Glicemia a due ore dal pasto: meno di 140 mg/dl TEST DI CARICO ORALE DI GLUCOSIO (OGTT) interpretazione Glicemia 200 mg/dl a 2 ore dal carico orale di glucosio: diagnosi di diabete mellito Glicemia 140 mg/dl ma <200 mg/dl a 2 ore dal carico orale di glucosio: diagnosi di intolleranza al glucosio (impaired glucose tolerance o IGT)» IFG tra 100 e 125 mg/dl» SospeXo di Diabete > 126 mg/dl ASPETTI SFAVOREVOLI DEL TEST DA CARICO DI GLUCOSIO Richiede 3 giorni di preparazione Richiede la sospensione di alcune terapie in corso Richiede il digiuno da almeno 10 ore Richiede l assunzione di una forte quandtà di glucosio Richiede 5-6 prelievi di sangue Riproduce una situazione non fisiologica MONITORAGGIO METABOLICO DEL DIABETE Profilo glicemico giornaliero: E indispensabile per monitorare l andamento delle glicemie Glicosuria: Indica la presenza di glucosio nelle urine quando la glicemia supera la soglia renale (> 180mg/dl) Chetonuria: Indica una insufficienza insulnica, una situazione di digiuno protraxo o una dieta troppo povera di carboidrad. Emoglobina glicosilata: Esprime la qualità del controllo metabolico degli uldmi 3 mesi. Riserva β- cellulare: AXraverso il C- pepdde si valuta la produzione endogena di insulina 4

5 Profilo glicemico E cosdtuito da misurazioni eseguite in vari momend della giornata sia a digiuno che dopo i pasd. Può essere pradcato: in regime ospedaliero (validità limitata a casi pardcolari) in regime di automonitoraggio domiciliare (elemento di riferimento più importante per la valutazione dell equilibrio glicemico) Emoglobina glicosilata L emoglobina glicosilata HbA 1c è un addotto stabile del glucosio ai gruppi N-terminale delle catene beta dell HbA L emoglobina glicosilata è un test utile al monitoraggio del soggetto diabetico durante la terapia e alla valutazione del metabolismo glicidico nei due mesi precedenti il prelievo. La concentrazione dell emoglobina glicata rappresenta una integrazione dei valori della glicemia nelle precedenti 6-8 settimane L autovalutazione della glicemia è raccomandata in tutti i pazienti con diabete di tipo 1 trattati con insulina, la sua efficacia nei pazienti con diabete di tipo 2 non è stata stabilita Deriva da una reazione pradcamente irreversibile nella quale il glucosio viene legato all emoglobina La percentuale e la velocità di emoglobina che viene glicosilata dipende dalla concentrazione di glucosio a cui il globulo rosso viene esposto e dall età del globulo rosso L emoglobina glicosilata rimane in tale forma per tuxa la vita del globulo rosso La glicosilazione è piuxosto lenta e la concentrazione di emoglobina glicosilata non varia con le oscillazioni giornaliere della glicemia, ma è uno specchio fedele della glicemia media dei 60 giorni precedend la determinazione. Pertanto questo esame deve essere eseguito ogni 2-3 mesi Il dosaggio dell HbA1c non esclude l automonitoraggio della glicemia che solo può darci informazioni sulla variabilità giornaliera dei valori glicemici ed in pardcolare sull iperglicemia postprandiale. Valutazione dell'emoglobina glicosilata Metodo di riferimento IFCC: spettrometria di massa o elettroforesi capillare Intervallo di riferimento HbA 1c = 4,3 5,9 % dell emoglobina totale < 6,3% = ottimo controllo glicemico > 9% = pessimo controllo glicemico Metodiche routinarie = cromatografia di affinità, HPLC, immunochimica Interferenze = emoglobinopatie e ridotta sopravvivenza della vita media dei G.R., emoglobine carbamilate Raccomandazioni ADA per l Emoglobina glicata HbA1c dovrebbe essere misurata almeno due volte all anno in tu] i paziend e ogni tre mesi nei paziend la cui terapia è stata modificata o che presentano un diabete non controllato Test per il controllo glicemico a breve termine Albumina glicosilata Fibrinogeno glicosilato FruXosamine (prodoxo chetoiminico della glicazione proteica) 5

6 GLUCOSIO URINARIO Glucosio urinario: filtrato a livello glomerulare riassorbito a livello tubulare Glucosio nelle urine quando glicemia > 180 mg/dl È possibile osservare glicosuria in presenza di valori glicemici normali (es.: diabete renale, infarto del miocardio, gravidanza). Valutazione della Glicosuria Carta imbevuta di glucosio-ossidasi Glicosuria nelle 24h - Raccolta frazionata delle urine delle 24 ore 1. Mattina: colazione pre-pranzo 2. Intervallo pranzo pre-cena 3. Intervalllo dopo-cena mattina 4. Si misura la concentrazione di glucosio nella diverse fasi della giornata in relazione ai pasti e alla terapia Corpi chetonici Sono l acetoacetato, il beta- idrossibudrrato e l acetone. La sintesi dei corpi chetonici avviene solo nei mitocondri del fegato ogni volta che l acedl- CoA è in eccesso rispexo all ossalacetato, in seguito a:» Dieta sbilanciata molto ricca in grassi e con una bassa percentuale di carboidrad.» Durante la gluconeogenesi, in seguito a digiuno o dopo un intenso sforzo fisico. Acetil-CoA Chetonuria Presenza di corpi chetonici nelle urine reazione colorimetrica al nitro-prussiato (Ketostix) presenza di acetone, ac. Acetoacetico ma non β-idrossibutirrico Valori normali: mg/24h Valori patologici nella: chetoacidosi diabetica digiuno prolungato restrizione di carboidrati riduzione enzimatica β-idrossibutirrico Ac. Acetoacetico condensazione decarbossilazione Acetone Dosaggio dei corpi chetonici Metodi per il dosaggio sierico dei corpi chetonici Dosaggio urinario dei corpi chetonici Generalmente l acido aceto- acedco è dosato nelle urine mediante strisce rea]ve a base di nitroprussiato a ph 9 (metodo di Legal). Aggiungendo glicina si dosa anche l acetone. In caso di posidvità le strisce si colorano in viola con un'intensità che varia a seconda della concentrazione dei corpi chetonici. LimiD: dosaggio semiquandtadvo, che non comprende anche il 3- β- idrossibudrrato, falsi posidvi in presenza di farmaci contenend gruppi sulfidrilici; falsi negadvi se le strisce sono esposte all aria o l urina è molto acida Metodo enzimadco per il dosaggio dell idrossibudrrato: IdrossibuDrrato + NAD > aceto- acetato + NADH Metodo lineare tra 0 e 6 mm 2. Metodo semiquandtadvo su siero diluito 1:2 Valori di riferimento In condizioni normali < 0,5 mm Iperchetonemia > 1 mm Chetoacidosi > 3 mm Iperchetonemia para-fisiologica: Neonati Gravidanza Bambini con febbre e vomito" 6

7 Il GLUCOSIO in gravidanza Il metabolismo dei carboidrad è alterato nelle prime se]mane di gravidanza per I'iperplasia delle cellule b del pancreas, accresciuta secrezione di insulina ed aumentata sensibilità all insulina La glicemia a digiuno diminuisce come conseguenza del 10-20% Gli ormoni cordsolo, progesterone, HPL, potend diabetogeni, raggiungono i livelli più elevad verso la fine della prima metà della gravidanza Il glucosio plasmadco a digiuno resta normale per l alta concentrazione di insulina tuxavia la tolleranza del glucosio è a rischio Screening per il diabete Storia familiare di diabete Obesità (BMI>30) Ipertensione Iperlipidemia Storia precedente di diabete gestazionale Precedente IGT e/o IFG Razza (asiadca, afrocaraibica) Età (>45 anni) GDM (diabete mellito gestazionale) FaXori di rischio anamnesdci maggiori: Pregresso GDM Familiarità di 1 grado BMI > 28 Pregressa macrosomia fetale (> 4 kg) Mortalità perinatale da causa incerta FaXori di rischio anamnesdci minori: Sovrappeso Ipertensione arteriosa 2 o più abord spontanei Poliidramnios Gestosi Elevata parità ParD pretermine Criteri diagnosbci del GDM (diabete mellito gestazionale) Glicemia casuale >200 mg/dl o glicemia a digiuno >126 mg/dl In presenza di faxori di rischio eseguire alla 24ma se]mana di gravidanza il test diagnosdco (OGTT, con 100 g di glucosio anidro e valutazione della glicemia a 2h VR <155 mg/dl, a 3 h- VR <140 mg/dl) Negli altri casi, eseguire alla 24ma se]mana il test di screening (minicarico di glucosio: 50g di glucosio e valutazione della gli. ad 1h VR < 140 mg/dl) Ricontrollare e riclassificare la paziente GDM a 6 se]mane dal parto = le IGT e/o IFG devono essere ricontrollate ogni anno, quelle normali dopo 3 anni 7