Dinamica di modelli realistici di singolo neurone

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FIRENZE ANNO ACCADEMICO Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Corso di Laurea in Fisica Tesi di Laurea Dinamica di modelli realistici di singolo neurone Candidato: Stefano Luccioli Relatore: dott. Alessandro Torcini Correlatore: prof. Roberto Livi 19 luglio 2005

2 Indice Introduzione 1 1 Elementi di neurofisiologia I neuroni I segnali neuronali ed il potenziale di azione Le sinapsi Introduzione alla dinamica neuronale La membrana cellulare del neurone Canali ionici e correnti ioniche Origine del potenziale di riposo Un modello cellulare semplificato L equazione di Nerst Effetto del sodio e pompe ioniche Effetto della permeabilità ionica e dei meccanismi di trasporto Proprietà elettriche passive della membrana Modelli di singolo neurone Il modello di Hodgkin-Huxley dell assone gigante del calamaro La tecnica di blocco del voltaggio Conduttanze del sodio e del potassio I

3 II Le equazioni di Hodgkin-Huxley Diagramma di biforcazione del modello di Hodgkin-Huxley I modelli ridotti Il modello di FitzHugh-Nagumo Risposta del modello di FitzHugh-Nagumo ad una corrente costante Il modello leaky integrate and fire Risposta ad una corrente costante Elementi di teoria dell informazione L approccio della teoria dell informazione Entropie condizionali Applicazioni delle entropie dinamiche Entropia di un treno di impulsi Entropie dinamiche quali indicatori per la risonanza stocastica 64 4 Risposta del singolo neurone a treni d impulsi ad alta frequenza Caratterizzazione degli stimoli in ingresso Metodi numerici ed indicatori impiegati Analogia con una particella in una buca di potenziale Risposta nel regime silente Risposta nel limite di alto e basso rumore Risonanza coerente Origine della risonanza coerente Risposta nel regime bistabile Risposta nel regime oltre la biforcazione di Hopf

4 III Conclusioni 110 A Fenomenologia delle biforcazioni 113 A.1 Biforcazioni sovra-critiche di punti fissi A.2 Biforcazioni sotto-critiche B Integrazione numerica di equazioni differenziali ordinarie 118 B.1 Il metodo di Eulero B.2 Il metodo Runge-Kutta

5 Introduzione Il presente lavoro di tesi rientra nell ambito di un ampia attività di ricerca che ha visto negli ultimi anni molti fisici orientarsi verso problematiche che un tempo erano dominio di biologi, biochimici o fisiologi. A partire dai lavori pionieristici di A. L. Hodgkin e A. F. Huxley sulla fisiologia del neurone, che li portarono al conseguimento del premio Nobel nel 1963, nonché a sviluppare un modello matematico, tuttora attuale, per la dinamica del neurone, sono stati fatti molti passi avanti. In particolare, queste attivitá di frontiera hanno consentito il trasferimento e l applicazione di tecniche e metodologie propriamente fisiche a vari campi delle scienze che si occupano degli organismi viventi, fra cui le neuroscienze. Scopo di questa tesi di laurea è lo studio dei comportamenti dinamici di modelli realistici di singolo neurone, in condizioni simili a quelle in cui si trovano abitualmente i neuroni in vivo nella corteccia cerebrale dei mammiferi. Analizzeremo perciò la risposta del singolo neurone sottoposto a continue stimolazioni, schematizzate con gradini di tensione, dovute ad impulsi elettrici (potenziali d azione) provenienti da un gran numero di altri neuroni connessi tramite sinapsi a quello in esame. Un modo sensato di schematizzare i treni di impulsi che raggiungono il neurone, e che trova corrispondenza nei dati sperimentali [1], consiste nell approssimare tale successione di impulsi come un processo puramente stocastico, più specificamente come un processo di rinnovo [2]. In questa tesi ci avvarremo quindi di metodologie proprie della

6 Introduzione 2 meccanica statistica e dei sistemi dinamici per investigare la risposta di un modello non lineare di interesse biologico sottoposto a stimoli stocastici. Prima di riassumere gli aspetti salienti e i risultati contenuti nella tesi, ci preme cercare di inquadrarla in una prospettiva più generale, che fa riferimento ad aspetti di carattere fondamentale. In particolare va notato come lo studio dei fenomeni guidati da processi stocastici costituisca uno dei campi di ricerca tradizionali nell ambito della meccanica statistica di equilibrio e di non-equilibrio. D altro canto nello studio dei sistemi biologici e piú specificamente dei sistemi neuro-biologici, spesso si sono usati, con successo, approcci di tipo statistico per ovviare alla mancanza di informazioni dettagliate sui processi e le reazioni chimiche e fisiche alla base del fenomeno in oggetto [2]. Inoltre in tali ambiti si fa spesso ricorso a modelli fenomenologici e ad analogie con processi fisici più semplici per poter arrivare ad una qualche comprensione di fenomeni di carattere generale. Una schematizzazione di processi che coinvolgono molti gradi di libertá largamente usata é rappresentata dal cosiddetto approccio alla Langevin, in cui il rumore gioca il ruolo di una forza aleatoria che rappresenta la manifestazione macroscopica di interazioni complesse a livello microscopico. In questo caso le proprietà statistiche che caratterizzano il sistema possono essere dedotte dalla forma della distribuzione di probabilitá indotta dal processo stocastico. Malgrado la sua estrema semplicitá questa descrizione si rivela efficace in molte applicazioni, anche in ambito biologico, la piú nota delle quali é la teoria del moto browniano proposta da A. Einstein nel Entrando maggiormente nello specifico, gli studi riguardanti le neuroscienze, e più in particolare il funzionamento del cervello come centro di elaborazione e di immagazzinamento di dati sia sensoriali che cognitivi, si sono intrecciati negli anni passati con quelli di teoria dell informazione ed anzi si puó dire che i due campi di indagine abbiano reciprocamente benificiato di scambi ed interazioni [3].

7 Introduzione 3 L analisi elettrofisiologica dei tessuti cerebrali ha mostrato come gli elementi deputati alla trasmissione ed elaborazione di informazioni siano i neuroni, e come essi, sebbene ne esistano di svariate tipologie, abbiano tuttavia in comune alcune caratteristiche salienti. Nello specifico, i comportamenti dinamici rilevanti di una cellula quale il neurone, consistono nella emissione e trasmissione di impulsi elettrici stereotipati (i cosiddetti potenziali d azione) ad altre cellule. L emissione dei potenziali d azione è a sua volta indotta dalla ricezione tramite le sinapsi di altri potenziali d azione provenienti da neuroni connessi a quello in esame. Quindi si puó ben dire che i potenziali d azione rappresentino gli elementi base del codice usato per la trasmissione d informazione a livello neuronale. Come giá menzionato, studi dettagliati della dinamica della membrana cellulare dell assone gigante del calamaro condotti da Hodgkin e Huxley negli anni cinquanta [4, 5, 6], hanno portato alla messa a punto di un modello realistico capace di riprodurre l evoluzione temporale della differenza di potenziale trans-cellulare durante l emissione di un potenziale d azione per una grande classe di neuroni (fra cui i neuroni piramidali presenti nella corteccia cerebrale dei mammiferi). Questo modello consiste di quattro equazioni differenziali ordinarie non lineari accoppiate fra di loro e sarà l oggetto principale di studio di questa tesi. Sebbene questo modello sia stato introdotto giá nel 1952, non é stato ancora caratterizzato appieno in tutti i suoi aspetti dinamici, e la comprensione della sua risposta, in condizioni quantomeno simili a quelle dei neuroni in vivo nella corteccia cerebrale, é di sicuro un passo necessario e fondamentale per poter poi procedere alla successiva modellizzazione di processi cognitivi elementari in termini di reti neurali con topologie assai complesse di cui i singoli neuroni rappresentano i nodi [7]. Avendo presenti queste motivazioni studieremo la risposta del modello di Hodgkin e Huxley, e di modelli semplificati, sottoposti a sollecitazioni di natura stocastica

8 Introduzione 4 ad alta frequenza, dovute alle molte stimolazioni per unità di tempo che i singoli neuroni ricevono in vivo dalle centinaia (se non migliaia [1]) di connessioni con altri neuroni della corteccia cerebrale. Il primo capitolo della tesi sarà dedicato ad una breve introduzione di semplici concetti di neurofisiologia, in particolare si riporteranno una schematica descrizione del neurone, delle sinapsi e della struttura della membrana cellulare. Si descriveranno poi la fenomenologia della dinamica neuronale con particolare enfasi sulla generazione del potenziale d azione in termini della dinamica delle correnti ioniche che attraversano la membrana neuronale. Il secondo capitolo sará principalmente dedicato ai modelli piú usati in letteratura per riprodurre la dinamica dei neuroni, a partire da modelli più realistici quale il modello di Hodgkin-Huxley, passando per il modello ridotto di FitzHugh-Nagumo (che è un modello paradigmatico per i sistemi eccitabili [8]) e concludendo con un modello schematico, ma assai usato per le possibilitá di trattazione analitica che consente, quale il modello leaky integrated and fire [9]. Elementi di teoria dell informazione, a partire dall entropia di Shannon per arrivare alle entropie dinamiche, saranno riportati nel capitolo terzo assieme ad applicazioni rilevanti per questa tesi. I contributi originali, riportati nel capitolo quarto, riguarderanno lo studio della risposta dinamica del modello di Hodgkin-Huxley e del modello di FitzHugh-Nagumo sottoposti a stimoli decorrelati sia inibitori che eccitatori ad alta frequenza. Dopo una esauriente descrizione di come vengono generati gli stimoli di ingresso e delle loro caratteristiche statistiche, sará delineata una utile analogia tra la dinamica di generazione del potenziale d azione e la dinamica alla Langevin di una particella in una buca di potenziale a temperatura finita. Si descriverá poi dettagliatamente la risposta del modello di Hodgkin-Huxley nei tre regimi principali individuati: il

9 Introduzione 5 regime silente, il regime di bistabilità ed il regime di emissione di treni d impulsi periodici. In ognuno dei tre regimi la risposta del neurone sarà caratterizzata in termini sia di indicatori che prendono in esame la statistica dei tempi fra impulsi successivi, quali la distribuzione di probabilità di tali tempi e i momenti relativi, sia di indicatori piú propriamente dinamici quali la funzione di autocorrelazione del segnale o le entropie dinamiche condizionali. La combinazione di questi indicatori consentirà di comprendere appieno l evoluzione dinamica nei vari regimi e di tracciare paralleli con semplici modelli stocastici passibili di trattazioni analitiche. Nelle conclusioni riporteremo i principali risultati ottenuti in questa tesi assieme a possibili prospettive e applicazioni future di questi studi. Infine brevi cenni alla teoria delle biforcazioni saranno riportati nella Appendice A, mentre gli schemi di integrazione numerica impiegati saranno descritti nella Appendice B.

10 Capitolo 1 Elementi di neurofisiologia In questo capitolo introdurremo alcuni concetti basilari relativi alla neurofisiologia del neurone. In particolare dopo una breve descrizione della morfologia del neurone e delle sinapsi, analizzeremo quei particolari segnali elettrici emessi durante la dinamica neuronale chiamati potenziali di azione i quali rappresentano l unità elementare di informazione scambiabile fra i neuroni. Inoltre descriveremo in dettaglio le caratteristiche della membrana cellulare, sia a riposo che eccitata, con particolare attenzione alle sue proprietà elettriche. 1.1 I neuroni I neuroni sono cellule del sistema nervoso altamente specializzate e dedicate al trasferimento, immagazzinamento ed elaborazione delle informazioni. Tale elaborazione avviene attraverso segnali elettrici dovuti a differenze di potenziale associate a correnti elettriche di natura ionica (essenzialmente sono rilevanti solo gli ioni sodio, potassio, calcio e cloro) che attraversano la membrana cellulare del neurone. I neuroni sono in numero molto elevato e sono connessi fra di loro in modo molto

11 Elementi di neurofisiologia 7 intricato (vedi fig.1.1): ad esempio nella corteccia cerebrale si ha una densità superiore a 10 4 neuroni/mm 3. Tipicamente, pur nella varietà di tipi di cellule neuronali (neuroni della corteccia cerebrale, motoneuroni del midollo spinale, ecc.), possiamo riconoscere tre parti morfologicamente e funzionalmente distinte: il corpo cellulare o soma; i dendriti e gli assoni. Il soma ha una struttura compatta che risulta approssimativamente sferica (di circa 70 µm di diametro) ed è sostanzialmente l unità deputata all elaborazione dell informazione. I dendriti sono estensioni del soma con una struttura molto ramificata che si estendono per distanze che possono raggiungere il millimetro ed hanno la funzione di raccogliere i segnali provenienti dagli altri neuroni e trasmetterli al soma. Gli assoni sono lunghe protuberanze (anche oltre un metro nei neuroni motori degli organismi animali superiori) che si proiettano dal soma e la loro funzione consiste nella trasmissione del segnale generato dal soma verso i dendriti di un altro neurone. Usando la terminologia dei circuiti elettronici si puó quindi dire che i dendriti rappresentano il dispositivo di ingresso ( input ), gli assoni il dispositivo di uscita ( output ) e il soma l unitá di elaborazione delle informazioni. La morfologia di un particolare tipo di neurone nonchè la sua posizione nella rete neuronale forniscono indizi sulla funzione espletata: ad esempio il livello di arborizzazione fornisce un idea del numero di connessioni che può ricevere e verso quante altre cellule neuronali invii i propri segnali (vedi fig.1.2). 1.2 I segnali neuronali ed il potenziale di azione Si definisce potenziale di membrana la differenza di potenziale misurata ai capi di due elettrodi, uno posto all interno della cellula neuronale ed uno posto nel liquido extracellulare circostante. Quando si parla di segnale neuronale ci si riferisce alla variazione temporale e spaziale del potenziale di membrana. Quando il neurone è

12 Elementi di neurofisiologia 8 Figura 1.1. Neuroni della corteccia dei mammiferi osservati al microscopio. Possiamo distinguere neuroni con corpi cellulari triangolari e circolari: la cellula b è un classico esempio di cellula piramidale con corpo triangolare [10]. Figura 1.2. Forme e dimensioni dei neuroni [11]. a riposo, ossia non è in qualche modo eccitato dall esterno (e chiariremo nel seguito cosa si intende), il potenziale di membrana assume un valore caratteristico denominato potenziale di riposo, tipicamente dell ordine di -65mV, ossia l interno della cellula si trova ad un potenziale inferiore rispetto all esterno.

13 Elementi di neurofisiologia 9 I potenziali di azione sono impulsi di tensione tipici generati durante la dinamica neuronale; essi hanno una forma pressoché stereotipata e non sono soggetti ad attenuazione o distorsione durante la propagazione lungo l assone. In fig.1.3 è riportata la forma tipica di un potenziale di azione. Si notino le seguenti caratteristiche: l impulso di tensione ha una durata di circa 1-2 ms ed una ampiezza misurata fra il minimo ed il massimo di circa mv; nella prima fase dell impulso si assiste ad una crescita veolce del potenziale di membrana fino ad arrivare ad una fase denominata di depolarizzazione dove il potenziale di membrana diventa positivo, cioè l interno della cellula si trova ad un potenziale superiore rispetto all esterno; nella fase di discesa l impulso prima di ritornare al valore di riposo passa attraverso una fase denominata di iperpolarizzazione, tipicamente della durata di circa 10 ms (e quindi molto piú lenta della depolarizzazione), in cui la cellula presenta un potenziale di membrana inferiore rispetto a quello di riposo. Il potenziale di azione, che una volta generato nella cellula neuronale, viaggia lungo l assone ed è trasmesso agli altri neuroni, costituisce l unità elementare associata alla trasmissione dei segnali neuronali. Tipicamente quindi quando ci si riferisce al segnale emesso da un neurone si intende la sequenza temporale di questi potenziali di azione, detta anche treno di impulsi (in inglese spike train). 1.3 Le sinapsi La sinapsi costituisce essenzialmente la giunzione tra due neuroni ossia la struttura attraverso la quale le informazioni sono trasferite da una cellula nervosa all altra.

14 Elementi di neurofisiologia 10 Figura 1.3. Forma tipica di un potenziale di azione (o impulso) [9]. In tale contesto si definisce neurone presinaptico il neurone trasmettente i potenziali di azione, a monte della sinapsi, e neurone postsinaptico il neurone ricevente i potenziali di azione, a valle della sinapsi. Con questa terminologia la sinapsi è quindi la regione in cui l assone del neurone presinaptico interagisce con il dendrite del neurone postsinaptico. Si definisce inoltre potenziale postsinaptico (che ha come acronimo PPS) la risposta in tensione del neurone postsinaptico conseguente all arrivo del potenziale di azione proveniente dal neurone presinaptico. Si distinguono essenzialmente due tipi di sinapsi: la sinapsi chimica e la sinapsi elettrica (altrimenti detta gap-junction). La sinapsi chimica, della quale è riportato lo schema in fig.1.4, risulta la più comune nel cervello dei vertebrati e si basa sul meccanismo che andiamo a descrivere. Il potenziale di azione generato dal neurone presinaptico, giunto all estremità dell assone depolarizza localmente la membrana cellulare causando il rilascio all interno della fessura sinaptica (ossia il piccolo spazio tra le due membrane cellulari presinaptiche e postsinaptiche), da parte di strutture poste sull assone denominate vescicole sinaptiche, di particolari

15 Elementi di neurofisiologia 11 sostanze chimiche denominate neurotrasmettitori. Il neurotrasmettitore, non appena raggiunto il versante postsinaptico della sinapsi, é rivelato da speciali molecole (chemorecettori) poste sulla membrana postsinaptica che provocano l apertura (o direttamente o tramite una catena di segnali biochimici) di specifici canali attraverso i quali una corrente ionica fluisce dal liquido extracellulare alla cellula. L ingresso di questi ioni porta a sua volta ad una variazione del valore del potenziale di membrana postsinaptico. Dunque in una sinapsi chimica si ha prima la trasformazione di un segnale elettrico in un segnale chimico sulla membrana presinaptica e poi la successiva trasformazione sulla membrana postsinaptica di un segnale chimico in un segnale elettrico. La sinapsi elettrica realizza invece un accoppiamento elettrico tra due neuroni attraverso canali ionici altamente specializzati (detti gap-junctions) che collegano la membrana presinaptica e postsinaptica. La sinapsi elettrica permette perció un flusso di corrente diretto tra neuroni adiacenti. Figura 1.4. Esempio di sinapsi chimica: la terminazione presinaptica libera una sostanza chimica, il neurotrasmettitore, in risposta ad una depolarizzazione [11]. 1.4 Introduzione alla dinamica neuronale Abbiamo già accennato che l arrivo di un potenziale di azione dal neurone presinaptico provoca una risposta in tensione (il potenziale postsinaptico) nel potenziale

16 Elementi di neurofisiologia 12 di membrana del neurone ricevente. A tal proposito si distingue tra potenziale postsinaptico eccitatorio (che ha come acronimo PPSE) e potenziale postsinaptico inibitorio (che ha come acronimo PPSI ) a seconda che l effetto sia quello di aumentare ovvero di diminuire il valore del potenziale di membrana. Analogo significato ha la distinzione tra sinapsi eccitatoria e sinapsi inibitoria ovvero tra stimolo depolarizzante e stimolo iperpolarizzante. Il numero di contatti sinaptici dipende dal tipo di neurone: ad esempio i neuroni della corteccia cerebrale (neuroni corticali) possiedono migliaia di contatti sinaptici (da a 10 4 ) con gli altri neuroni della corteccia dei quali circa l 85% sono eccitatori ed il resto inibitori. In realtà solo una frazione dell ordine del 5-10% risultano sinapsi realmente attive [1, 12]. Per avere un idea dell ampiezza di un PPSE si veda la fig.1.5 in cui sono riportati i PPSE registrati su una cellula neuronale ed il relativo istogramma delle altezze di picco: come si vede il valor medio è dell ordine di 0.5 mv. In fig.1.6 è riportata una rappre- Figura 1.5. Registrazione di 479 PPSE sul soma di cellule piramidali della corteccia visuale del ratto, in presenza di attività neuronale spontanea (fig.a). Istogramma delle altezze di picco dei PPSE (fig.b) [13]. sentazione schematica della dinamica neuronale che si instaura in risposta all arrivo di impulsi da neuroni presinaptici: fig.a: un neurone postsinaptico i riceve impulsi da due neuroni presinaptici j = 1,2; u i (t) e u rest rappresentano rispettivamente il potenziale di membrana e il valore del potenziale di riposo del neurone i; la quantità ɛ i1 (t t (f) 1 ) rappresenta il potenziale postsinaptico generato dall arrivo all istante t (f) 1 di un impulso dal

17 Elementi di neurofisiologia 13 neurone j = 1; fig.b: un impulso che arriva dall altro neurone presinaptico j = 2 ad un istante t (f) 2, entro un intervallo di tempo sufficientemente breve, causa un secondo potenziale postsinaptico che si somma al precedente; in questo regime la risposta del neurone postsinaptico risulta approssimativamente lineare nel senso che la risposta è circa proporzionale agli input che riceve; fig.c: quando u i (t) raggiunge un valore tipico, θ, denominato soglia di attivazione, il comportamento del neurone diviene altamente non lineare: è generato un potenziale di azione (il picco dell impulso rappresentato da una freccia è fuori dalla scala della figura) che ha una forma stereotipata e quindi senza legame con gli stimoli che lo hanno prodotto; inoltre il neurone, per tutta la durata del potenziale di azione, diviene per così dire insensibile, ovvero refrattario, agli stimoli che gli arrivano dagli altri neuroni. La refrattarietà neuronale si distingue in genere in refrattarietà assoluta e refrattarietà relativa. La refrattarietà assoluta è quell arco temporale (di circa 2ms) corrispondente alla durata del potenziale di azione in cui è impossibile che venga generato un altro potenziale di azione. La refrattarietà relativa, che segue temporalmente la refrattarietà assoluta, coincide con la fase di iperpolarizzazione del neurone in cui è difficile ma non impossibile che il neurone venga eccitato fino ad emettere un altro potenziale di azione. Conseguentemente il periodo di refrattarietà fornisce un limite inferiore al minimo intervallo temporale tra due potenziali di azione consecutivi.

18 Elementi di neurofisiologia 14 Figura 1.6. Rappresentazione della dinamica neuronale [9]. 1.5 La membrana cellulare del neurone La membrana cellulare del neurone (vedi fig.1.7) è composta da molecole di lipidi e proteine. Le molecole lipidiche sono disposte in un doppio strato con uno spessore di circa 6nm. In questa matrice lipidica si trovano alcune molecole proteiche che attraversano tutto lo spessore della membrana cellulare entrando quindi in contatto sia con l interno della cellula che con il liquido extracellulare. Tali particolari proteine prendono il nome di canali proteici, ovvero canali di membrana, canali acquosi o canali ionici (la ragione di tali denominazioni sarà chiara a breve). La membrana

19 Elementi di neurofisiologia 15 cellulare può essere attraversata dalle sostanze dall esterno all interno o viceversa attraverso vari meccanismi. Vi sono ad esempio alcuni tipi di molecole (alcoli o glicerolo) che attraversano la membrana sciogliendosi nel doppio strato lipidico e riemergendo dall altro lato; in tal caso la facilità di penetrazione dipende dal grado di solubilità nei lipidi. Gli ioni inorganici (sodio, potassio, calcio e cloro) che, come abbiamo già detto, costituiscono le correnti ioniche alla base dell attività elettrica neuronale, si muovono attraverso la membrana o legandosi a particolare molecole dette molecole di trasporto, che li veicolano, ovvero attraverso i canali proteici sopra citati. Si noti comunque che il meccanismo di trasporto adottato durante la generazione di un potenziale di azione risulta quello dei canali proteici, in quanto i flussi di ioni coinvolti (dell ordine di 10 6 ioni/s) risultano ben oltre le possibilità di azione delle molecole di trasporto. Nella struttura dei canali proteici (vedi fig.1.7) si possono riconoscere i seguenti elementi: un poro centrale pieno d acqua; una regione del poro che agisce da filtro di selettività regolando il transito degli ioni in base alle dimensioni ed alle caratteristiche chimico-fisiche; un sistema di porte (in inglese gates) che si aprono e si chiudono in modo stocastico facendo oscillare il canale tra uno stato di apertura ed uno stato di chiusura; di norma lo stato di chiusura predomina quando il potenziale di membrana si trova al valore di riposo Esiste peraltro l eccezione costituita da alcuni canali per i quali lo stato di apertura è predominante nella membrana a riposo: si tratta per lo più, come vedremo nel seguito, di quei canali del cloro e del potassio che risultano responsabili proprio del valore del potenziale di riposo.

20 Elementi di neurofisiologia 16 Figura 1.7. a) Struttura della membrana cellulare del neurone; b) struttura di un canale ionico [11]. 1.6 Canali ionici e correnti ioniche Quando il canale ionico si trova in uno stato di apertura il canale è detto attivato, altrimenti quando si trova in uno stato di chiusura è detto inattivato. È opportuno sottolineare che essendo l apertura e chiusura dei canali un processo di natura stocastica l attivazione o disattivazione di un canale sta a significare solo un aumentata o diminuita probabilità di apertura del canale e non uno stato di apertura o chiusura continua (vedi fig.1.8). Esistono varie modalità di attivazione, ossia di apertura, di un canale. In particolare se l apertura del canale può essere regolata dal valore del potenziale di membrana i canali si dicono voltaggio-attivati. A titolo di esempio citiamo in questa categoria di canali il canale voltaggio-dipendente del sodio che, come vedremo in seguito (2.1), è quello responsabile della depolarizzazione della membrana che provoca la fase di salita del potenziale di azione. Riguardo alla selettività alla specificità ionica i canali si possono distinguere in cationici e anionici a seconda che risultino rispettivamente permeabili agli ioni positivi o negativi. La permeabilità di una membrana ad una specie ionica, indicata con p, è una proprietà intrinseca della membrana che misura la facilità con cui gli ioni attraversano la membrana stessa; essa è definita in modo empirico dalla relazione [1, 16]: J = p [C] (1.1)

21 Elementi di neurofisiologia 17 dove J è il flusso molare (misurato in mol/(cm 2 s)) e [C] rappresenta la differenza di concentrazione ionica ai due lati della membrana (misurata in mol/cm 3 ). P ha le dimensioni di una velocità ed è solitamente misurata in cm/s. La permeabilità dipende solo dal tipo e dal numero di canali ionici presenti sulla membrana. In particolare i canali cationici possono essere specifici o non specifici qualora risultino o meno specializzati per una particolare specie ionica (ad esempio si hanno canali specifici del Na +, K +, Ca 2+ ). I canali anionici risultano essenzialmente costituiti dai canali del cloro (Cl ), che è di gran lunga il maggior permeante anionico nelle soluzioni biologiche. Figura 1.8. Esempio di corrente di canale. Come si vede tale corrente risulta di impulsi di forma quasi rettangolare che possono essere posti in relazione con lo stato di apertura e chiusura dei canali stessi [14]. La conduttanza è invece una misura dell abilità della membrana di trasportare corrente elettrica ed è misurata soltitamente in Siemens, con simbolo S, dove 1S = 1Ω 1. Poichè la corrente è trasportata dagli ioni, la conduttanza di una membrana non dipenderà solo dalle proprietà della membrana (cioè dalla permeabilità) ma anche dalla concentrazione ionica all interno ed all esterno della cellula (ovvero il numero dei portatori liberi di carica). Non è tuttavia possibile ricavare una relazione matematica generale tra permeabilità e conduttanza perchè tale relazione dipende strettamente dalle modalità con cui gli ioni attraversano il canale (semplice diffusione attraverso i pori pieni d acqua ovvero modelli più complicati che analizzano l interazione canale-ione permeante). In generale quindi la corrente che attraversa un canale ionico dipenderà [11, 15, 16]):

22 Elementi di neurofisiologia 18 dalla conduttanza del canale; dal gradiente di concentrazione tra l interno e l esterno della cellula che tende a produrre un flusso dalla zona a maggior concentrazione a quella a minor concentrazione secondo la legge empirica enunciata da Fick [16]: J diff = D d[c] dx (1.2) dove J diff rappresenta il flusso dovuto alla diffusione (misurato in numero di ioni/(cm 2 s)), D è il coefficiente di diffusione (misurato in cm 2 /s) e [C] è la concentrazione ionica (qui espressa in numero di ioni/cm 3 ); dalla differenza di potenziale applicata alla membrana. 1.7 Origine del potenziale di riposo Un modello cellulare semplificato In fig.1.9 è presentato un modello cellulare semplificato [11] ma che coglie l essenza dell origine del potenziale di riposo della cellula neuronale. La cellula contiene ioni potassio (K + ), sodio (Na + ), cloro (Cl ) ed altri anioni (A ) di grandi dimensioni ed è a sua volta immersa in una soluzione di sodio, potassio e cloro. Le concentrazioni ioniche mostrate in figura sono espresse in millimoli per litro (che ha per simbolo mm dove 1mM = 10 3 mol/l). Nelle cellule neuronali sono presenti altri ioni, come il calcio e il magnesio, ma il loro contributo al potenziale di riposo è trascurabile. In questo modello la membrana cellulare è completamente impermeabile al sodio ed all anione interno (A ) e risulta invece permeabile al potassio ed al cloro. Il potassio risulta più concentrato dentro la cellula che fuori e tende quindi a muoversi verso l esterno secondo il proprio gradiente di concentrazione. D altro canto, come

23 Elementi di neurofisiologia 19 abbiamo precedentemente illustrato, la superficie interna della membrana è negativa rispetto a quella esterna, e quindi il gradiente di potenziale tende ad attrarre il potassio dentro la cellula. In una cellula a riposo il gradiente di concentrazione ed il gradiente elettrico sono in equilibrio. Si definisce potenziale di equilibrio di una specie ionica il valore del potenziale di membrana al quale non si ha alcun flusso netto di quella specie ionica. Per il cloro il gradiente di concentrazione ed il gradiente elettrico hanno direzione opposta rispetto al potassio. Figura 1.9. Un modello semplificato per le distribuzioni ioniche all interno ed all esterno della cellula. Le frecce rappresentano le direzioni dei gradienti di concentrazione ed elettrici per il potassio (K + ) e per il cloro (Cl ). Le concentrazioni sono espresse in millimoli per litro [11] L equazione di Nerst Il potenziale di equilibrio di ogni specie ionica è legato alle concentrazioni intracellulari ed extracellulari attraverso la cosiddetta equazione di Nerst: E ione = kt q ln [n] e [n] i (1.3) dove: E ione è il potenziale di equilibrio dello ione; [n] e, [n] i sono rispettivamente le concentrazioni extracellulari ed intracellulari; k J/K è la costante di Boltzmann; T è la temperatura assoluta in Kelvin; q è la carica elettrica (in Coulomb) della specie ionica. È possibile capire l origine dell equazione di Nerst attraverso il seguente ragionamento (vedi anche fig.1.10). Dalla meccanica statistica

24 Elementi di neurofisiologia 20 di Boltzmann per sistemi in equilibrio termico si ha che la probabilità p(u < U < U + du) che una molecola si trovi in uno stato di energia U < U < U + du risulta: p(u < U < U + du) exp( U/kT ) [17]. Consideriamo adesso degli ioni con carica positiva q in un campo elettrico statico. La loro energia nel punto x risulta U(x) = qv (x) dove V (x) è il potenziale nel punto x. La probabilità di trovare uno ione in una regione nell intorno del punto x è perciò proporzionale alla quantità exp( qv (x)/kt ). Reinterpretando la densità di probabilità come una quantità proporzionale ad una densità ionica [n(x)], ovvero ad una concentrazione, si ha: p(u(x 1 )) p(u(x 2 )) = [n(x 1)] [n(x 2 )] = exp( q(v (x 1) V (x 2 ))/kt ) (1.4) e dunque all equilibrio termodinamico si ha che un gradiente di potenziale elettrostatico V = (V (x 1 ) V (x 2 )) genera un gradiente di densità ionica. Ma poichè questo è un assunto su uno stato di equilibrio la relazione deve valere anche nell altro senso: ossia un gradiente di concentrazione genera un gradiente di potenziale elettrostatico. Risolvendo la (1.4) rispetto al gradiente di potenziale si ha che all equilibrio termodinamico vale V = kt q ln [n] 2 [n] 1 che è appunto l equazione di Nerst. Figura Origine del potenziale di Nerst [9]. La quantità kt/q ha le dimensioni di una differenza di potenziale elettrico e per una specie ionica monovalente (per la quale q = e, dove e C è il valore

25 Elementi di neurofisiologia 21 assoluto della carica dell elettrone) è uguale a circa 25mV a temperatura ambiente (T 300K). Per il modello cellulare mostrato in fig.1.9 nel quale il rapporto delle concentrazioni del cloro e del potassio è uguale e pari a 1:30 si avrà a T 300K: E k 85mV, E Cl 85mV. Nel modello cellulare semplificato, essendo gli ioni potassio e cloro gli unici in grado di muoversi attraverso la membrana ed essendo entrambi in equilibrio a -85mV, la cellula non manifesta alcun guadagno o perdita netta di ioni: il potenziale di riposo della cellula semplificata coincide quindi con il potenziale di equilibrio del potassio e del cloro Effetto del sodio e pompe ioniche Lo ione sodio (Na + ) è molto più concentrato all esterno che all interno della cellula (vedi fig.1.9), dunque per opporsi all ingresso del sodio dovuto al gradiente di concentrazione la membrana deve avere una differenza di potenziale tra l interno e l esterno positiva: infatti usando le concentrazioni di fig.1.9 si ha che a T 300K il potenziale di equilibrio del sodio risulta E Na +34mV. Dunque in una cellula neuronale, dove il potenziale di riposo della membrana è negativo, sia il gradiente di concentrazione sia il potenziale di membrana favoriscono l ingresso del sodio. La membrana cellulare è scarsamente permeabile al sodio ma il sia pur limitato ingresso di questo ione depolarrizza leggermente la membrana rispetto al potenziale di equilibrio del potassio con la conseguenza che il potassio, fuori dall equilibrio, fluisce verso l esterno. Per mantenere lo stato di equilibrio (ovvero le concentrazioni ioniche costanti) a fronte di queste perdite continue esistono delle cosiddette pompe ioniche che trasportano il sodio fuori dalla cellula ed il potassio dentro la cellula in modo da mantenere uno stato stazionario, ovvero una sistuazione di equilibrio dinamico. Il più importante sistema di trasporto è costituito dalla pompa Na-K che trasporta tre ioni sodio fuori dalla cellula per ogni due ioni potassio portati invece

26 Elementi di neurofisiologia 22 all interno: in tal caso si dice che il rapporto di accoppiamento Na:K della pompa è di 3:2. Tale situazione è rappresentata in fig.1.11 dove le frecce tratteggiate indicano i movimenti ionici passivi (ovvero guidati solo dal bilancio tra i gradienti elettrici e di concentrazione) mentre le frecce continue e i circoli indicano le pompe ioniche. La lunghezza delle frecce indica l entità dei movimenti netti ionici: per ciascuno ione il flusso totale è nullo all equilibrio. Figura Flussi ionici passivi e pompe ioniche in una cellula in stato stazionario [11] Effetto della permeabilità ionica e dei meccanismi di trasporto Abbiamo visto nel paragrafo che il potenziale di riposo della membrana è determinato principalmente dal rapporto delle concentrazioni transmembranali del potassio. Esiste tuttavia una dipendenza non solo dalle concentrazioni ioniche ma anche dalla permeabilità alle specie ioniche. L equazione di campo costante, detta anche equazione GHK dagli autori D.E. Goldman [18], A.L. Hodgkin e B. Katz [19], esprime tale dipendenza: V m = kt e ln p k[k + ] e + p Na [Na + ] e + p Cl [Cl ] i p k [K + ] i + p Na [Na + ] i + p Cl [Cl ] e ; (1.5) dove V m è il potenziale di riposo della membrana; e (valore assoluto della carica dell elettrone) indica la carica degli ioni monovalenti; il simbolo [I] j, dove

27 Elementi di neurofisiologia 23 I = K +,Na +,Cl e j = i,e, indica la concentrazione interna ed esterna delle specie ioniche; p k, p Na, p Cl rappresentano le permeabilità ioniche di ogni ione. Tale equazione è basata sul presupposto che, a potenziale costante, non deve cambiare la carica sulla membrana anche se gli ioni la attraversano in piccole quantità. Di conseguenza le correnti trasportate dalle perdite di sodio verso l interno, di potasso verso l esterno e dalle altre perdite del cloro devono dare come somma zero. Altrimenti si detetrminerebbe un accumulo, o una perdita, costante di carica e quindi una deriva costante del potenziale di membrana. Il nome equazione di campo costante è legato al fatto che una delle ipotesi alla base di essa è che il campo elettrico all interno della membrana sia uniforme. Come si vede l equazione ricorda quella di Nerst ma considera tutte le specie ioniche presenti pesate con la loro permeabilità e corrisponde pertanto a quello che intuitivamente era possibile aspettarsi: ovvero che il potenziale di membrana tende tanto più al valore del potenziale di equilibrio di una specie ionica quanto più la sua permeabilità è maggiore di quella delle altre specie ioniche. È possibile dimostrare [11] che non vi è una grossa dipendenza del potenziale di riposo dal cloro e pertanto il suo contributo è spesso trascurato; in tal caso l equazione di campo costante viene così riscritta: V m = kt e ln [K+ ] e + b[na + ] e [K + ] i + b[na + ] i ; (1.6) dove b = p Na /p k. Una descrizione ancora più accurata è fornita dall equazione di stato stazionario [20] che considera anche gli effetti dei processi di trasporto attivo della pompa ionica Na K: V m = kt e ln r[k+ ] e + b[na + ] e r[k + ] i + b[na + ] i ; (1.7) dove r è il rapporto di accoppiamento del sistema di trasporto (nel caso della pompa N a K si ha r = 3/2). Si capisce facilmente come gli effetti della pompa si ripercuotano sul potenziale di membrana: infatti il diverso flusso di ioni Na + e K +

28 Elementi di neurofisiologia 24 (tre ioni sodio fuori dalla cellula per ogni due ioni potassio portati invece all interno) causato dalla pompa genera una corrente ionica netta verso l esterno; questo flusso di cariche positive verso l esterno tende a iperpolarizzare la membrana ad un valore leggermente più negativo (ossia avvicina il potenziale di membrana un po di più al potenziale di equilibrio del potassio) di quello che ci si aspetterebbe solo in base a meccanismi passivi. Per avere un idea dell entità del contrbuto delle pompe ioniche si confronti il valore del potenziale di riposo predetto dall equazione di campo costante e dall equazione di stato stazionario relativamente ad assoni di calamaro in acqua di mare alla temperatura di T 300K: usando l equazione di campo costante si trova V m 67mV, mentre usando l equazione di stato stazionario si trova V m 73mV (abbiamo usato i seguenti valori realistici: [K + ] i = 400mM, [K + ] e = 10mM, [Na + ] i = 50mM, [Na + ] e = 460mM, b = p Na /p k = 0.04, r = 1.5). 1.8 Proprietà elettriche passive della membrana Da un punto di vista elettrico la più semplice schematizzazione di una porzione di membrana cellulare a riposo fa ricorso a tre elementi circuitali: una resistenza (R), una capacità (C), ed un generatore di tensione V uguale al potenziale di riposo (vedi fig.1.12 e fig.1.13). La presenza della resistenza si spiega con l esistenza dei canali ionici che realizzano un contatto tra l interno e l esterno della cellula. La resistena di membrana è di solito riportata come una resistenza di membrana specifica, R m, definita come una resistenza per unità di superficie (in unità Ω cm 2 ). R è quindi ottenuta dividendo R m per l area della membrana considerata. R m è determinata principalmente dalle permeabilità a riposo del potassio e del cloro. Valori tipici di R m variano da circa 10 3 Ω cm 2 per membrane con molti canali ionici a circa 5 x 10 4 Ω cm 2 per membrane con pochi canali ionici. Ma oltre a permettere il passaggio

29 Elementi di neurofisiologia 25 Figura Schematizzazione elettrica di una porzione di membrana cellulare del neurone. V rest indica il potenziale di riposo [1]. Figura Equivalente circuitale dell intera membrana cellulare. I simboli R e C in questo caso rappresentano il paralllelo rispettivamente di tutte le resistenze e le capacità delle singole porzioni di membrana; V rest indica il potenziale di riposo; I inj rappresenta una corrente iniettata dentro la cellula [1]. di correnti ioniche, la membrana accumula cariche sulla superfici interna ed esterna, ed è proprio questa separazione che detemina il potenziale di membrana. La realizzazione di questa separazione di cariche conferisce alla membrana le proprietà di un condensatore. La capacità di membrana è di solito specificata in termini di una capacità di membrana specifica, C m, definita come una capacità per unità di superficie (in unità F/cm 2 ). C è quindi ottenuta moltiplicando C m per l area della membrana considerata. C m è tipicamente dell ordine di 1µF/cm 2. Tramite la relazione Q m = C m V, dove Q m è la quantità di carica per unità di superficie, ed assumendo

30 Elementi di neurofisiologia 26 V -65mV si ha che Q m (1µ F/cm 2 ) x (65mV) 6.5 x 10 8 C/cm 2 che equivale, dividendo per il valore assoluto della carica dell elettrone, a circa 4 x ioni monovalenti per cm 2. Ci preme sottolineare che tale schematizzazione descrive solo il comportamento passivo della membrana e non prende in considerazione eventuali componenti non lineari o attivi come ad esempio conduttanze voltaggio-dipendenti (vedi 2.1).

31 Capitolo 2 Modelli di singolo neurone In questo capitolo introdurremo alcuni modelli che descrivono la dinamica del potenziale di membrana del singolo neurone. Inizieremo presentando il noto modello di Hodgkin-Huxley, un modello realistico a quattro dimensioni (in cui cioè la dinamica del neurone è descritta da quattro variabili) ottenuto per riprodurre i dati sperimentali relativi ad una particolare fibra nervosa, l assone gigante del calamaro. Tratteremo poi dei modelli ridotti (dove il termine ridotti indica che essi costituiscono una sorta di approssimazione dei modelli a più alta dimensionalità); in particolare saranno trattati i modelli bidimensionali e tra questi il modello di FitzHugh-Nagumo. L importanza dei modelli ridotti bidimensionali risiede nel fatto che la bassa dimensionalità rende più agevole l analisi e consente di cogliere gli aspetti essenziali della dinamica di modelli più complicati. Tratteremo infine il modello leaky integrate and fire: esso costituisce un esempio dei cosiddeti modelli formali in cui cioè viene descritta in modo estremamente semplificato la dinamica sottosoglia, cioè prima dell insorgenza del potenziale di azione, mentre il potenziale di azione è descritto sinteticamente come un evento impulsivo.

32 Modelli di singolo neurone Il modello di Hodgkin-Huxley dell assone gigante del calamaro In questa sezione descriveremo una tecnica sperimentale, la cosiddetta tecnica di blocco del voltaggio (in inglese voltage clamp), alla quale ci riferiremo usando anche l acronimo TBV, che permette di misurare le correnti di membrana prodotte da impulsi di tensione depolarizzanti. L applicazione di questa tecnica ad una particolare fibra nervosa, l assone gigante del calamaro, ha permesso di ottenere misure assai accurate che hanno consentito di sviluppare il modello di Hodgkin-Huxley (al quale ci riferiremo usando l acronimo HH ). Come vedremo il modello HH é costituito da un sistema di quattro equazioni differenziali che descrivono la dinamica del potenziale di membrana e delle tre correnti ioniche fondamentali: la corrente del sodio (I Na ), la corrente del potassio (I K ) e la corrente di perdita, o dispersione, (I L, dall inglese leakage current), dovuta principalmente al cloro (Cl ), ma che riassume l effetto di altre specie ioniche non descritte esplicitamente. Verrà messo altresì in evidenza come il meccanismo alla base di queste correnti ioniche risieda nel fatto che la conduttanza della membrana cellulare al sodio (g Na ) ed al potassio (g K ) sono dipendenti dalla differenza di potenziale applicata alla membrana, ovvero la probabilità che i canali si aprano aumenta con la depolarizzazione della membrana. L apertura dei canali avviene tuttavia con tempi e modalità diverse: la depolarizzazione della membrana attiva inizialmente un aumento della conduttanza del sodio (seguita da una successiva inattivazione) e solo con un certo ritardo temporale quella del potassio (vedi fig.2.1). Inoltre l effetto sul potenziale di membrana dell aumento della conduttanza è diverso per il sodio ed il potassio (vedi fig.2.2): per quanto riguarda il sodio si ha un processo di retroazione positiva: infatti una piccola depolarizzazione aumenta il numero dei canali aperti, a ciò segue

33 Modelli di singolo neurone 29 l ingresso di sodio secondo il gradiente elettrochimico che produce a sua volta una depolarizzazione ancora più grande; per quanto riguarda il potassio si ha invece che il flusso in uscita secondo il gradiente eletrochimico dovuto alla depolarizzazione porta alla ripolarizzazione della membrana e quindi alla conseguente riduzione della conduttanza al potassio fino al valore di riposo (retroazione negativa). Il profilo tipico di un potenziale di azione è quindi spiegabile nella fase di salita con un improvviso grande aumento della permeabilità di membrana al sodio: la conseguente corrente del sodio porta rapidamente il potenziale di membrana a spostarsi verso il potenziale di equilibrio del sodio stesso (E Na ). La fase di caduta del potenziale di azione, ossia la ripolarizzazione della membrana, è dovuta ad un successivo aumento della permeabilità al potassio: a causa della corrente del potassio il potenziale di membrana si sposta questa volta verso il potenziale di equilibrio del potassio (E K ). È opportuno ricordare che il modello di Hodgkin-Huxley costi- Figura 2.1. Potenziale di azione teorico (V ) nel modello HH e andamenti temporali delle conduttanze per unità di superficie della membrana al sodio e al potassio durante un potenziale di azione ottenuti con esperimenti di blocco del voltaggio [6]. tuisce il prototipo dei cosiddetti modelli basati sulla conduttanza [9]: esistono molti altri modelli che riescono a riprodurre la dinamica di altri tipi di neuroni (diversi

34 Modelli di singolo neurone 30 Figura 2.2. Effetti sul potenziale di membrana dell aumento della conduttanza al sodio (a) e al potassio (b) [11]. dall assone gigante del calamaro) grazie all introduzione di ulteriori correnti ioniche La tecnica di blocco del voltaggio L assone gigante del calamaro fa parte di una coppia di assoni che si estendono per tutta la lunghezza del mantello del calamaro nel nervo stellato (vedi fig.2.3) e che sono deputati al controllo dei muscoli che provocano il movimento del calamaro. L assone del calamaro ha il vantaggio di presentare un diametro (dell ordine di 1mm) molto grande paragonato ad esempio alle dimensioni di un neurone del sistema nervoso centrale di un mammifero (il diametro del soma, che pure risulta molto più grande di quello degli assoni, è dell ordine di alcune decine di µm) e ciò rende possibile inserire direttamente dentro l assone un elettrodo assiale. Se si pone un altro elettrodo nella soluzione di perfusione in cui è immerso l assone è possibile misurare il potenziale di membrana. La TBV consente di registrare il flusso di corrente attraverso la cellula neuronale in una situazione sperimentale in cui la differenza di potenziale applicata alla membrana è mantenuta costante nel tempo ( bloccata ). In fig.2.4 è illustrato l apparato per effettuare esperimenti con la

35 Modelli di singolo neurone 31 Figura 2.3. A sinistra: disposizione anatomica dell assone gigante del calamaro [21]. A destra: Assone gigante di calamaro isolato con elettrodo di derivazione posizionato assialmente all interno [11]. tecnica del blocco del voltaggio sull assone gigante del calamaro. L assone è perfuso con acqua di mare (che simula il liquido extracellulare) e due sottili fili di argento (gli elettrodi) vengono inseriti all interno di esso da una estremità. Un elettrodo (che potremo definire elettrodo di tensione) fornisce la misura del potenziale di membrana (V m ), ossia la differenza di potenziale tra l interno dell assone e l acqua di mare. Inoltre esso è anche connesso all ingresso invertente ( ) di un amplificatore detto amplificatore di voltage clamp. L ingresso non invertente dell amplificatore (+) è a sua volta connesso ad un generatore di tensione variabile che fornisce il potenziale di comando. In presenza di una differenza di potenziale tra gli ingressi invertente e non invertente l amplificatore di voltage clamp eroga una corrente in uscita la quale scorre attraverso la membrana cellulare tra il secondo elettrodo inserito nell assone (che potremo definire elettrodo di corrente) e l acqua di mare. La corrente è misurata mediante la caduta di tensione attraverso una resistenza in serie. In fig.2.5 è riportato un esempio dell andamento temporale della corrente che si osserva quando il potenziale di membrana è portato improvvisamente dal suo valore di riposo, in questo caso -65mV, a un livello depolarizzato, -9mV, ossia con un gradino di depolarizzazione di 56mV. La corrente prodotta dal gradino di tensione consta di quattro componenti: