TIPI di SPETT TIPI ROSCOPIA di SPETT NMR IR UV- VISIBILE
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1 TIPI di SPETTROSCOPIA NMR IR UV- VISIBILE
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5 TRASMITTANZA ed ASSORBANZA I 0 I TRASMITTANZA T = I /I 0, 0 < T < 1 ASSORBANZA: A = log I 0 /I 0 < A < o anche: A = log T LEGGE di LAMBERT-BEER A = bc coefficiente di estinzione molare b= lunghezza del cammino ottico (in cm) c= concentrazione molare
6 SPETTROSCOPIA UV Analisi di metalli pesanti: spettro a righe (Pb, Hg etc) Analisi di molecole: spettro a bande PERCHE SI OSSERVA UNA BANDA LARGA? abs = el + vib + rot
7 STRUMENTAZIONE SORGENTE: lampada di tungsteno (visibile) o lampada a scarica di deuterio (UV) CAMPIONE: si alloggia in celle al quarzo (UV) o in vetro o policarbonato (visibile) CONCENTRAZIONE: bisogna sceglierla in modo tale che l assorbanza non superi il valore di 2-3
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14 Spettroscopia UV: definizioni Cromoforo: la parte della molecola responsabile dell'assorbimento UV (per esempio, un carbonile a,b insaturo) Gruppo auxocromo: Un gruppo che non è di per sé un cromoforo, ma può modificare l'intensità e la lunghezza d'onda dell'assorbimento di un cromoforo Shift batocromico: spostamento di un assorbimento UV verso lunghezze d'onda maggiori (anche: spostamento verso il rosso) Shift ipsocromico: spostamento di un assorbimento UV verso lunghezze d'onda minori (anche: spostamento verso il blu; non sempre è letterale!!!) Effetto ipercromico: aumento dell' dovuto ad un sostituente del cromoforo. Effetto ipocromico: diminuzione dell' dovuto ad un sostituente del cromoforo.
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16 Spettroscopia UV Transizioni elettroniche (guscio esterno) Per le molecole => transizioni elettroniche tra orbitali molecolari Orbitali,, n,, Le transizioni promuovono elettroni da orbitali,, n verso orbitali di antilegame. Le transizioni => * provocano scissione omolitica del legame (Es.: Alogenazione alcani)
17 RELAZIONI GENERALI fra STRUTTURA e PROPRIETA UV I composti saturi non danno assorbimento UV (fuori osservazione) n Gruppi funzionali contenenti legami possono dare assorbimento nella regione nm. Tali gruppi funzionali insaturi sono detti cromofori Le transizioni n sono quelle che richiedono meno energia ma sono proibite e le corrispondenti bande sono caratterizzate da basso coefficiente di estinzione molare ( <100). Caratteristica saliente di tali transizioni è il fatto che si osserva uno shift ipsocromico con l aumento della polarità del solvente
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20 TRANSIZIONI * Danno luogo alle cosiddette bande K Hanno coefficienti di estinzione molare alti ( ~10 4 ) La max dipende da: numero di doppi legami coniugati sostituenti sul sistema coniugato presenza di cicli
21 TRANSIZIONI * (n di doppi legami) * 4* 3* 2 1 etilene 1,3-butadiene
22 Transizioni * negli alcheni E HOMO-LUMO dipende dai sostituenti sul doppio legame: quando i E HOMO-LUMO diminuiscono, le max si spostano verso valori più alti
23 Un estesa coniugazione ha un grande effetto sulla max; ; lo spostamento sarà a lunghezze d onda maggiori H H H H C C C C H H H H C C H H max 170 nm max 217 nm
24 H H C C H C C H H H max 217 nm (diene coniugato) H 3 C H C C H C C H H max 263 nm triene coniugato H C C H CH 3
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26 Licopene È il pigmento rosso-arancio del pomodoro max 505 nm
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28 TRANSIZIONI * (sistemi ciclici) Un diene può esistere in due conformazioni: H H H H H H H H H H H H s-trans s-cis In un diene ciclico i due doppi legami possono essere omoannulari o eteroannulari Diene omoannulare Diene eteroannulare Per ragioni non chiare un diene omoannulare assorbe a max molto più lunghe di un diene eteroannulare o ciclico. La è maggiore però per i dieni eteroannulari (>10000) che per quelli omoannulari (<10000)
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30 303 nm TRANSIZIONI n * Transizioni in molecole con cromofori coniugati ad auxocromi Es.: formaldeide O C H H * O C H H n Transizioni a elevata in formaldeide.
31 AROMATICI Sono possibili varie transizioni *. In particolare, il benzene presenta 3 bande di assorbimento, a max 184 (e = ), Banda E1 max 204 (7900) BandaE2 max 254 (200) Banda B Banda a struttura fine di solito usata a scopi di indagine strutturale Esempi di assorbimento di benzeni sostituiti: Banda E2 Banda B Composto max max Benzene Clorobenzene Tiofenolo Anisolo Fenolo Fenato o-catecolo o-catecolato Anilina Catione anilinio
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34 Analisi UV di fenoli e aniline OH O OMe OH max 270 nm = 1450 (shift batocromico) max 287 nm = 2600 max 269 nm = 1480 NH 2 NH 3 + H + max 280 nm = 1430 (shift ipsocromico) max 254 nm = 160
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37 Regole di Woodward Contributi additivi per calcolare di assorbimento di gruppi funzionali o frammenti molecolari Applicabili a sistemi dienici coniugati o carbonilici -insaturi
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39 TRANSIZIONI * (regole di additività) Regole di Woodward-Fieser per i dieni coniugati dieni eteroannulari dieni omooannulari Sostituenti Ulteriore C=C Gruppo alchilico C=C esociclico OAc OAlchile SAlchile Cl o Br N(Alchile) 2 Valore di base: 214 nm 253 nm Incrementi: 30 nm 5 nm 5 nm 0 nm 6 nm 30 nm 5 nm 60 nm Br Esempi max 235 nm
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41 Composti carbonilici Sono presenti due transizioni * nel lontano UV a~ 150 nm n * (BANDA R) nm con molto bassi (<100) Composti carbonilici, -insaturi Regole di Woodward-Fieser per gli enoni: Valori di base: Sostituenti Incrementi: Chetoni aciclici 215 nm SAlchile 85 nm Chetoni ciclici a 6 termini 215 nm Cl 15 nm Chetoni ciclici a 5 termini 202 nm 12 nm Aldeidi (acicliche) 210 nm Br 25 nm Acidi ed esteri (aciclici e a 6) 195 nm 30 nm Sostituenti Incrementi: N(Alchile) 2 95 nm Ulteriore C=C 30 nm Gruppo alchilico 10 nm 12 nm Solvente Correzione 18 nm Etanolo 0 nm C=C esociclico 5 nm Metanolo 0 nm C=C omodienici 39 nm Diossano -5 nm OH 35 nm Cloroformio -1 nm 30 nm Etere -7 nm 50 nm Acqua +8 nm OAc 6 nm Esano -11 nm OMe 35 nm Cicloesano -11 nm 30 nm 17 nm 31 nm
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45 Regole di selezione 1. Ridistribuzione di carica (variazione del ) 2. Lo spin totale si deve conservare (o meglio la molteplicità) 3. La simmetria Ψ 2 deve essere conservata
46 2 a Regola di selezione Spin elettronico: +1/2, -1/2 Spin totale: 0, ½, 1 Molteplicità di spin: M = 2S+1 => stati di: a) singoletto (diamagnetismo) b) tripletto (ossigeno, paramagnetismo) Stabilità di singoletti o tripletti dipendente dalla distanza tra livelli.
47 Fluorescenza e fosforescenza S 1 stato eccitato (singoletto) E 1 energia dissipata (termica) stato eccitato a minor energia (singoletto) stato eccitato a minor energia (tripletto) Fluorescenza Fosforescenza E 3 E 2 S 0 stato fondamentale (singoletto) 1. Assorbimento a < di quella di emissione 2. Inter-sistem crossing: cambio molteplicità
48 La luminescenza Luminescenza: emissione di luce da atomi, molecole o cristalli eccitati elettronicamente. Eccitazione luminosa: Eccitazione chimica: Chemiluminescenza fluorescenza fosforescenza
49 Fluorescenza e fosforescenza I materiali fluorescenti cessano di essere luminosi al cessare dello stimolo che ne determina la luminosità I materiali fosforescenti continuano ad emettere la luce per un certo periodo dopo la fine dello stimolo
50 Esempi noti a tutti Detersivo più bianco del bianco Discoteca: i denti ed i vestiti che brillano Sveglie con il quadrante fluorescente Inchiostri per banconote contro i falsari
51 Che cosa succede alla luce che e stata assorbita da una molecola? L energia della luce assorbita da un oggetto qualsiasi viene generalmente dissipata sotto forma di calore. Alcune sostanze invece liberano parte dell energia assorbita attraverso l emissione di luce di un colore diverso da quella assorbita (fluorescenza). Le molecole che assorbono non sempre fluorescono.
52 Cos è la fluorescenza? Emissione di radiazione da parte di una molecola eccitata. Il nome deriva dalla fluorite, minerale di calcio e fluoro, in cui è stato osservato per la prima volta il fenomeno E 1 E 0 Diagramma di Jablonski 1) eccitazione 2) rilassamento s decadimento non radiativo isoenergetico fra stati di uguale molteplicità 3) decadimento non radiativo 4) decadimento radiativo tra stati elettronici di uguale molteplicità } 10-9 s
53 Cos è la fosforescenza? Stati elettronici eccitati E 0 Stato elettronico fondamentale
54 Quali sono le molecole fluorescenti? Sono fluorescenti le molecole con sistemi ad elevata. coniugazione Strutture con molti elettroni coniugati Strutture planari con anelli aromatici Esempi: porfirine. fluoresceina, flavine,cianine, rodamine,
55 Alcuni esempi di molecole. O O OH COOH N = C = S Fluorescein isothiocyanate ( FITC ) H 2 N Ethidium Bromide NH 2 N + Br - CH 2 CH 3
56 Il fluorimetro F Lampada ecc. Campione (nm) Monocromatore di eccitazione Lente em. Lente Computer Monocromatore di emissione PMT segnale
57 Diagramma di Jablonski: conseguenze Stokes shift (spostamento ad energie più basse). Regola di Kasha (invarianza spettrale con la lunghezza d onda di eccitazione). Regola dell immagine speculare. E 2 Conversione interna E 1 Abs Fluorescenza E 0
58 Ad esempio La 5,6-carbossifluoresceina assorbimento. fluorescenza. Abs
59 Strumenti e preparazione del campione Cuvette quarzo o vetro Solventi opportuni Conc.: M Spettrofotometro a doppio raggio
60 FLUORESCENZA: metodi per l uso della fluorescenza Uso di marcatori fluorescenti per Molecole di interesse biologico => Possibilità di seguire i fenomeni in-situ in tempo reale ESEMPIO: Lo studio dell evoluzione di proteine in ambiente acquoso è reso possibile dalla fusione con una proteina fluorescente verde (GFP) estratta da una medusa (Aequorea victoria). Da Nature 338 (1997) Moto della molecola S65T kinesin-gfp lungo un canale in presenza di 1 mm di adenosinatrifosfato (ATP) rivelato grazie ad un microscopio a fluorescenza
61 FLUORESCENZA: metodi per l uso della fluorescenza Applicazioni: Dermatologia (diagnosi dei difetti della cute e delle infezioni (tinea, vitiligine) Immunologia (Rivelazione di batteri in coltura con marcanti fluorescenti) Immunoreumatologia (Presenza di microcristalli nei liquidi sinoviale) Oncologia (Fluorescenza risolta in tempo per la diagnosi) Medicina del lavoro (Analisi di tracce di metalli pesanti - fino alle atto-moli)
62 Lo SPETTROMETRO ELABORATORE del SEGNALE: Il segnale in uscita dal rivelatore può essere utilizzato direttamente per tracciare uno spettro usando un registratore. SORGENTE: serve ad assicurare un flusso costante di radiazione elettromagnetica alla desiderata (lampada a deuterio/tungsteno) MONOCROMATORE: Il monocromatore serve a selezionare la radiazione elettromagnetica di una particolare lunghezza d'onda tra tutte quelle prodotte dalla sorgente. RIVELATORE rivelatore è un dispositivo capace di generare un segnale elettrico quando è colpito da una radiazione elettromagnetica.
63 MONOCROMATORI A prisma A reticolo
64 SCELTA del SOLVENTE I più usati sono acqua, acetonitrile e etanolo
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67 Legge di Lambert-Beer A = -log 10 T = c l l in cm c in M E una legge monocromatica Soluzioni diluite: M A concentrazione
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72 Scelta della lunghezza d onda
73 Assorbanza ANALISI QUANTITATIVA L analisi quantitativa UV-VIS si basa sulla legge di Lambert-Beer che esprime una relazione di proporzionalità tra la conc. di un analita e l assorbanza a una determinata. Perchè tale legge sia applicata in analisi quantitativa devono essere rispettate due condizioni: - L analita deve assorbire in modo rilevabile nell intervallo spettrale nm. Questo si verifica con una analisi spettrale dell analita. Si identifica quindi la lunghezza d onda (solitamente max) per l analisi quantitativa - La relazione assorbanza/conc. deve essere lineare. Questo si verifica allestendo una curva di calibrazione Concentrazione (M) Esistono diversi fattori che possono provocare deviazioni dalla linearità tra cui fattori fisici/chimici, fattori strumentali e operativi
74 Assorbanza Fattori fisici e chimici -L indice di rifrazione della soluzione varia al variare della concentrazione (quando è elevata) e di conseguenza varia anche la poiché la rifrazione fa variare la lunghezza d onda della radiazione incidente. Per ridurre tale inconveniente, di solito si lavoro con soluzioni diluite M. - A concentrazioni elevate, le molecole possono formare dimeri e polimeri, anche aggregati con il solvente. Di conseguenza si possono osservare deviazioni positive o negative dalla legge di lambert Beer Formazione di dimeri Formazione di polimeri concentrazione -Variazioni di ph, temperature e solvente possono avere effetto sulla linearità -In soluzioni torbide la luce incidente viene in parte persa per effetto della diffusione con un aumento (apparente) della assorbanza. Si risolve il problema utilizzando opportuni sistemi in grado di raccogliere la luce dispersa (sfera integratice)
75 Assorbanza Radiazione monocromatica Banda stretta Banda larga concentrazione Fattori strumentali -L ampiezza della banda passante, oltre ad essere decisiva sulla precisione e accuratezza dell analisi, influisce inoltre sulla linearità della legge di lambert Beer. -La luce diffusa dovuta a cause strumentali altera l assorbanza soprattutto per soluzioni concentrate (la curva assume pendenza negativa) A = log P 0 + S P + S Per soluzioni molto concentrate, P diminuisce e al limite si annulla A = log P 0 + S S
76 CALIBRAZIONE La calibrazione determina la relazione tra la risposta analitica e la concentrazione dell analita. Di solito tale operazione si effettua mediante standard. Calibrazione con std. esterno Lo std. esterno viene preparato separatamente dal campione (al contrario lo std. Interno è aggiunto al campione stesso). Si prepara una serie di std. esterni contenenti l analita a concentrazioni note (almeno 3 conc., metodo della diluizione progressiva). Si misura quindi l assorbanza rispetto alla concentrazione dell analita e e si determina la curva di calibrazione fittando i dati con un appropriata equazione matematica, quale la relazione lineare usata nel metodo dei minimi quadrati
77 Assorbanza Assorbanza Il metodo dei minimi quadrati L assorbanza (ordinata) è la variabile dipendente mentre concentrazione (ascissa) è la variabile indipendente. In condizioni ideali tutti i punti sono allineati con l origine degli assi (ratta passante per lo 0, y= mx). In condizioni reali, a causa degli errori indeterminati associati al processo di misurazione, non tutti i dati si trovano sulla stessa linea y=mx Concentrazione (M) x m = y/ x y y=mx+b Concentrazione
78 In tali condizioni bisogna derivare la migliore retta che interpoli i punti. L analisi dei minimi quadrati lineare fornisce l equazione della migliore retta passante tra un insieme di dati x,y, assumendo che ogni deviazione dei punti dalla linea retta deriva da un errore commesso nel corso della misurazione. Quindi si assume che ai valori x, ovvero alla preparazione delle concentrazioni, non è associato alcun errore La linea costruita con il metodo dei minimi quadrati è quella che minimizza la somma dei quadrati dei residui (deviazione verticale di ciascun punto dalla retta) corrispondenti a tutti i punti
79 Range Dinamico Lineare Capacità dello strumento di osservare un intervallo di intensità Se l assorbimento del solvente copre quello del soluto si può fare una differenza, ma il r.d.l. e fondamentale!!! Spettrofotometri a doppio raggio Se il r.d.l. è 100, lo strumento rileva un picco che vale 1 accanto ad uno che vale 100.
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