Sviluppo storico. Spettroscopia. Sviluppo storico della spettroscopia. Dal qualitativo al quantitativo. C. A. Mattia

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SALERNO Sviluppo storico della spettroscopia L inizio: il problema del colore Il colore è contenuto nella luce o nei corpi? FACOLTÀ DI FARMACIA Spettroscopia C. A. Mattia Dal qualitativo al quantitativo *1801 Young calcola la lunghezza d onda usando dati di Newton di interferenza da lamine sottili 2d = differenza di cammino fra il raggio (2) e il raggio (1) si assegna al colore la lunghezza λ = 2d d raggio incidente *1810 Fraunhofer sviluppa i diffrattometri e misura ben 700 righe fra righe chiare (di emissione) e righe scure (di assorbimento). Herschel, Brewster, Foucault associano righe e sostanze dando vita alla spettroscopia come tecnica di analisi chimica. C. A. Mattia 3 (2) (1) *1660 Newton studia la rifrazione e scopre gli spettri il colore è contenuto nella luce tuttavia da dove proviene il colore delle fiamme? *1752 Melville scopre gli spettri a righe e descrive la riga gialla della fiamma che attribuisce al sodio il colore è contenuto anche nei corpi? *1800 Herschel scopre l infrarosso nella radiazione solare e Ritter scopre l ultravioletto nelle proprietà fotochimiche di AgCl. C. A. Mattia 2 *1859 Le leggi di Kirchoff Sviluppo storico la lunghezza d onda a cui una sostanza emette dipende unicamente dalla sostanza. una sostanza assorbe alle stesse lunghezze d onda a cui emette. una sostanza trasparente non emette nel visibile. Inoltre Kirchoff spiega: - le righe scure nella corona solare; - il puzzle della riga D del sodio; - predice l esistenza del rubidio estrapolando le righe di Na e K. C. A. Mattia 4

2 Sviluppo storico verso la fisica dei quanti Sviluppo storico spettroscopia * 1913 Ipotesi di Bohr sulle transizioni fra stati stazionari. * 1885 la serie di Balmer: ν 1/n 2-1/m 2 assorbimento emissione * 1905 Einstein spiega l effetto fotoelettrico, E=hν. * 1908 Principio di ricombinazione di Ritz: stati stazionari termine spettrale a cui è associata una frequenza ν = R Z 2 1/n 2 (R s -1 ). +E = = E + conservazione dell energia C. A. Mattia 5 C. A. Mattia 6 Sviluppo storico spettroscopia Interazione radiazione-materia La statistica della luce * 1918 Einstein ipotizza l emissione stimolata e l equilibrio radiazione materia. Emissione stimolata assorbimento emissione + E = + 2E i due fotoni uscenti sono identici al fotone incidente. * 1954 Gordon, Zeiger e Townes realizzano il MASER all ammoniaca. C. A. Mattia 7 +E = + E = + 2E = E + emissione stimolata C. A. Mattia 8

3 Regioni spettro Infrarosso Spettro elettromagnetico e radiazioni del visibile. Il tipo di interazione con le sostanze dipende dalla energia della radiazione perturbante. Una radiazione UV può provocare transizioni degli elettroni di valenza e di legame, non una fotoemissione degli elettroni dei livelli molecolari interni. Per quanto possa essere intensa una radiazione IR non è utile per eseguire una radiografia. Intensità ed energia sono quantità differenti. Spettro visibile Ultravioletto C. A. Mattia Lunghezza d onda (nm) 9 Porta campioni Campioni e rivelatori forma dipendente dalla tecnica» tubicini» cuvette». elevata trasparenza alle radiazioni usate» bromuro di potassio (IR)» cloruro di sodio (IR)» nujol (IR liquido oleoso)» vetro o plastica (visibile)» quarzo (UV) Rivelatori diversi tipi di dispositivi sensibili alle radiazioni» semiconduttori (CCD)» pellicole fotografiche» fotomoltiplicatori». C. A. Mattia 11 Lampade Sorgenti filamento di Nernst (IR - ceramica con ossidi di terre rare) klystron (microonde λ ristretto) tungsteno (visibile) laser (IR/visibile monocromatica) deuterio (UV) sincrotrone (raggi X) Elemento disperdente prisma reticolo trasformata di Fourier C. A. Mattia 10 Ampiezza righe Ampiezza naturale: E t h/4π Interazione intermolecolari (pressione) (princ. indeterm.) ν = 1/4π π t Effetto Doppler ν = ν 0 (1±v/c v/c) C. A. Mattia 12

4 Risoluzione Potere di risoluzione R = λ/ λ (R = ν/ ν) (a) due righe ben risolte da (b) a (d) due righe sempre più sovrapposte C. A. Mattia 13 I 0 Legge di Lambert-Beer b I 0 intensità luce monocromatica I I intensità luce trasmessa b cammino ottico lni = -kb + lni 0 k costante dipendente dal mezzo assorbente -lni/i 0 = kb A = εbc I/I 0 = T (trasmittanza) -logt = A (assorbanza) ε coefficiente di assorbimento molare ε coefficiente di estinzione molare (c concentrazione molare) C. A. Mattia 15 Intensità L intensità di una riga dipende da molti fattori ed è legata al numero di molecole coinvolte nella transizione. N a /N b = e -hν/kt Densità di radiazione Coefficiente di Einstein Fluttuazioni casuali Regole di selezione: (legge di distribuzione di Boltzmann) (dipende dalla frequenza al cubo) (dipende dall emissione stimolata) (rapporto segnale/rumore) transizioni proibite per lo spin ( S S = 0) transizioni proibite per simmetria C. A. Mattia 14 Spettri rotazionali E R = J(J+1)h 2 /8π 2 I = BJ(J+1)h N J N E E = E J E J-1 = Bh2J N J /N 0 = (2J+1)e -(E (E J -E 0 )/kt C. A. Mattia J 16

5 Spettri vibrazionali E V = (υ( + ½)h (oscillatore armonico) E V = (υ( + ½)hν x( x(υ + ½) 2 hν υ = ±1 υ = 0 1 (banda fondamentale (banda fondamentale hv ) υ = 1 2 (banda calda (banda calda hv ) υ = 0 2, 0 3,. (armoniche superiori proibite) (oscillatore anarmonico) C. A. Mattia 17 Luce diffusa Spettri Raman υ = ±1; J J = ±2 variazione di frequenza rispetto luce incidente Spettri vibrorotazionali J J = ±1 regola di selezione E E = (υ +½)h( )hν + BJ (J (J +1)h (υ +½)hν BJ (J (J +1)h υ = 0 1 (υ ( υ = 1) E E = hν h + Bh[J [J (J +1) J (J +1)] Ramo P (J = J J 1) Ramo R (J = J J + 1) HCl gassoso H 35 Cl 75% Cl 25% H 37 Cl 25% C. A. Mattia 18 Spettri Raman Spettro rotazionale del biossido di carbonio CCl 4 intensità numero d onda C. A. Mattia 19 sono presenti solo righe con J pari C. A. Mattia 20

6 Statistica nucleare Rotazione di 180 CO 2 => scambio nuclei identici di O. spin nucleari: 1 H = 1/2; 2 H = 1; 19 F = 1/2; 12 C = 0; 13 C = 1/2; 16 O = 0; 33 S = 3/2 Para-idrogeno (J pari) Orto-idrogeno (J dispari) w orto spin nucleari appaiati spin nucleari paralleli orto = 3 w para = 1 w simm = (2I+1)(I+1) w asimm = (2I+1)I C. A. Mattia 21 Alcani C=C (X=Y) Spettri elettronici Gruppi atomici (cromofori( cromofori) transizioni elettroniche tipo σ σ* trans. el.. tipo π π*; σ π*; n π* σ π*; n π* * deboli (proibite) Spettroscopia elettronica Principio di Franck-Condon Tempo necessario per vibrazioni (~10( -12 s) è maggiore rispetto al tempo di una transizione elettronica (~10( -15 s). Per le transizioni più probabili (intense) le distanze internucleari rimangono inalterate (transizione( verticale). Per le molecole poliatomiche elevati momenti d inerzia d danno luogo a spettri a bande. C. A. Mattia 22 Amminoacidi Spettri UV Basi DNA Proteine: assorbanza 280 nm Acidi nucleici: assorbanza 260 nm C. A. Mattia 23 C. A. Mattia 24

7 Spettri e ph Fluorescenza e fosforescenza Punto isosbestico a 267 nm Tirosina Laser Molecola Molecola Molecola NH 2 H C OH Emissione per FLUORESCENZA (o fosforescenza) COOH AOH AO + H + Punto isosbestico a 277,5 nm Eccitazione (Assorbimento) Stato metastabile (Energia accumulata dalla molecola) Diseccitazione (Emissione) C. A. Mattia 25 C. A. Mattia 26 Struttura elettronica e roto-vibrazionale Struttura elettronica e roto-vibrazionale Struttura elettronica di una molecola biatomica Il potenziale di interazione dipende dalla distanza fra gli atomi Gli stati elettronici hanno distanza di equilibrio propria Stati di singoletto e di tripletto Stati elettronici eccitati 4 ev cm nm Stato elettronico fondamentale C. A. Mattia Distanza di legame 27 Struttura vibrazionale di una molecola biatomica Deformazione della molecola per allungamento Livelli energetici quantizzati E n = (n+1/2) hνh Struttura rotazionale di una molecola biatomica Rotazione della molecola intorno agli assi Livelli energetici quantizzati E j = B J(J+1) Β ~ 0.01 ev C. A. Mattia ( 80 cm -1, 120 µm) 28 J 5 4 n E ~ 0.1 ev ( 800 cm -1,12 µm)

8 Principio di Franck-Condon Decadimento non-radiativo Assorbimento di un fotone E E = hν in => Transizione elettronica indotta Dal livello fondamentale ad un livello elettronico eccitato in uno stato roto-vibrazionale eccitato Regole di selezione L=±1 S=0 S=0 (nessuna transizione fra stati di SINGOLETTO e stati di TRIPLETTO) J=0, ±1 tranne per J=0 Transizione verticale Nuclei immobili durante la transizione (10-15 s) 15 s) Probabilità di posizione relativa Probabilità di posizione relativa Urti con altre molecole Livelli roto-vibrazionali vibrazionali: : dallo stato eccitato allo stato fondamentale (nel livello elettronico eccitato) Energia ceduta per aumentare la temperatura del sistema Tempi di diseccitazione (10-9 s) Dipendenti da temperatura e ambiente molecolare C. A. Mattia 29 FLUORESCENZA Emissione di un fotone E E = hν fl => Transizione elettronica spontanea Dal livello roto-vibrazionale fondamentale del livello elettronico eccitato a livelli roto-vibrazionali eccitati del livello elettronico fondamentale. Tempi tipici 10 s s. C. A. Mattia 30 FLUORESCENZA Caratteristiche dell emissione di fluorescenza Energia del fotone emesso Energia fotone assorbito hν fl hν in Emissione non monocromatica Transizione verso stati roto-vibrazionali eccitati Spettro quasi speculare all assorbimento. Tempo totale di durata del fenomeno s C. A. Mattia 31 C. A. Mattia 32

9 Eccitazione di stati di tripletto Transizione elettronica in uno stato di tripletto (spin allineati) proibita dalle regole di selezione. Un forte accoppiamento spin-orbita (atomi pesanti) rende meno rigida la regola di selezione. In particolare la transizione è possibile all intersezione delle le curve di energia potenziale. Possibilità di transire fra uno stato eccitato di singoletto ed uno di tripletto durante la termalizzazione. C. A. Mattia 33 Influenza dell intorno molecolare Attenuazione dell intensità di FLUORESCENZA Fenomeni dissipativi non radiativi: Urti con molecole, Urti con pareti metalliche FOSFORESCENZA La transizione spontanea ha probabilità bassa. => Tempi di diseccitazione lunghi (secondi). Energia intrappolata in uno stato metastabile. Energia del fotone emesso sempre minore dell energia del fotone incidente. C. A. Mattia 34 Fluorescenza Uso di marcatori fluorescenti per molecole di interesse biologico => Possibilità di seguire i fenomeni in-situ in tempo reale Intensità di fluorescenza in una soluzione Transizioni in stati di tripletto (Intersystem crossing) Intensità Concentrazione ottimale Concentrazione Diminuzione della probabilità di fluorescenza ESEMPIO: Lo studio dell evoluzione di proteine in ambiente acquoso è reso possibile dalla fusione con una proteina fluorescente verde (GFP) estratta da una medusa (Aequorea victoria). Da Nature 338 (1997) Quenching Urti con molecole (O 2 e I - ) capaci di assorbire l energia in eccesso Foto-dissociazione e foto-chimica (bleaching) L energia in eccesso è utilizzata da altre molecole per dissociarsi o per attivare reazioni chimiche C. A. Mattia 35 Il moto della molecola S65T kinesin-gfp lungo un canale (microtubule) in presenza di 1 mm di adenosinatrifosfato (ATP) è rivelato grazie ad un microscopio a fluorescenza. C. A. Mattia 36

10 Fluorescenza Applicazioni in campo biomedico: Dermatologia (diagnosi dei difetti della cute e delle infezioni: tinea,, vitiligine, ). Immunologia (rivelazione di batteri in coltura con marcanti fluorescenti). Immunoreumatologia (presenza di microcristalli nei liquidi sinoviali). Oncologia (fluorescenza risolta in tempo per la diagnosi). Medicina del lavoro (analisi di tracce di metalli pesanti - fino alle atto-moli). atto C. A. Mattia 37 UPS Spettroscopia fotoelettronica nell ultravioletto Lampada a He ~ 58 nm (più usata) Elettroni di valenza. Struttura fine: tipo ionizzazione; stati vibrazionali. Esempio: spettr tro o fotoeletronico di HBr è caratterizzato dalla presenza di due bande: ionizzazione coppia solitaria Br; ionizzazione elettrone di legame (σ).( C. A. Mattia 39 Spettroscopia fotoelettronica Espulsione di elettroni da orbitali diversi. L energia del fotone incidente è uguale all energia di ionizzazione one più quella dell elettrone espulso: hν = 1/2m e υ 2 + I Lo spettrometro è costitutito da una sorgente, un analizzatore elettrostatico e da un rivelatore di elettroni. Gli elettroni sono deviati in funzione della loro velocità. Sorgente C. A. Mattia 38 XPS (raggi X) Energia così elevata da espellere gli elettroni del nocciolo interno dei singoli atomi. Spettroscopia elettronica per analisi chimica (ESCA). Strati superficiali. Può differenziare atomi con carica diversa. Ione azitidrato N=N=N - Carica positiva sull azoto centrale. Cariche negative sugli azoti esterni. + N=N=N Rapporto intensità 2:1 UPS-XPS (luce di sincrotrone) Energia C. A. Mattia 40