PROGETTO 962 SAFEMILK FINANZIATO DALLA REGIONE LOMBARDIA, Piano 2006

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1 RISULTATI CONSEGUITI DAL PROGETTO Diagnosi precoce di mastiti subcliniche per un miglioramento quali-quantitativo delle produzioni lattiero-casearie (SAFEMILK) ENTE PROPONENTE Università degli Studi di Milano Dipartimento di Patologia Animale, Igiene e Sanita Pubblica Veterinaria SOGGETTI ATTUATORI Consiglio Nazionale delle Ricerche - Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria (CNR-IBBA), Università degli Studi di Milano - Dipartimento di Patologia Animale, Igiene e Sanità Pubblica Veterinaria

2 OBIETTIVI PERSEGUITI Il patrimonio nazionale di bovine da latte rappresenta circa il 10% di quello dell'unione Europea; l'italia si colloca al quarto posto della graduatoria, dopo Germania, Francia e Regno Unito. La produzione nazionale di latte vaccino è di circa 10 milioni di tonnellate, e più del 65% del patrimonio vacche da latte e i 3/4 della produzione di latte sono appannaggio di Lombardia, Emilia Romagna, Veneto e Piemonte; in Lombardia sono presenti circa vacche da latte che producono in media ciascuna circa 95q di latte all anno (Dati ANAFI 2008). La mastite, processo infiammatorio a carico della mammella, può essere considerata la principale patologia, assieme a quelle dell apparato riproduttore, nell allevamento del bovino da latte (Schukken, 1996). La mastite è caratterizzata da una alterazione del latte e/o della mammella e comporta sempre un calo della produzione, che si assesta mediamente tra il 18 e il 25%, e la necessità di dover eliminare del latte, anche a causa del trattamento terapeutico con antibiotici o chemioterapici. Inoltre, la mastite induce sempre un peggioramento delle caratteristiche qualitative del latte (numero di cellule somatiche, percentuale di grasso e proteine), con ripercussioni negative anche sulle rese di caseificazione. Va sottolineato che, sia in ambito nazionale che internazionale, il prezzo del latte è fissato in base a rigidi parametri qualitativi. La mastite rappresenta quindi un grave problema economico, oltre che gestionale, per l azienda. Le mastiti possono essere classificate in funzione dell andamento del processo infiammatorio e della sua evoluzione in mastiti cliniche, subcliniche e croniche. Le mastiti cliniche sono caratterizzate da insorgenza improvvisa e modificazioni evidenti delle ghiandola mammaria e del latte accompagnati da un sensibile e repentino calo della produzione, che in alcuni casi può arrivare fino alla completa agalassia. Nelle forme più gravi si può avere un interessamento generale dell animale che può addirittura portare alla morte. Negli ultimi anni l introduzione di capi altamente selezionati per la produzione di elevati quantitativi di latte ha favorito un aumento dei casi clinici di mastite ma soprattutto quelli di mastite subclinica. Dai dati disponibili si evidenzia che l incidenza media in Europa è di casi per 100 vacche per anno (Schukken et al., 1996) con costi elevatissimi (quantificabili per una mastite clinica, in 210 Euro e per una mastite subclinica fino a 120 Euro in Danimarca) (Huijps et al., 2008) mentre in Italia i costi stimati sono rispettivamente di circa 300 e 400 Euro (Dr. Paolo Moroni-Dati personali). Nella maggioranza dei casi, la mastite si presenta in forma subclinica. Anche se le manifestazioni sono meno evidenti, le perdite economiche dovute a questo tipo di patologia sono notevoli, per la difficoltà di individuarla e curarla in tempo utile, per la necessità di diagnosticarla con tecniche di laboratorio, nonché per le alterazioni che la malattia comunque induce nella composizione del latte. Solo tramite analisi batteriologiche e citologiche è evidenziabile la presenza di infezioni intramammarie. Il controllo della mastite subclinica è più importante del semplice trattamento dei casi clinici, in quanto le bovine con mastite subclinica rappresentano dei "serbatoi" di diffusione di microrganismi (soprattutto dei cosiddetti patogeni contagiosi). Inoltre, poiché la maggior parte dei casi clinici è l evoluzione di casi subclinici, la cura di questo tipo di mastite è essenziale per la riduzione dei casi clinici. Le mastiti croniche rappresentano l evoluzione di forme cliniche o subcliniche, che perdurano nel tempo. Si può avere una fibrosi del tessuto della mammella a scapito del tessuto secretivo, e quindi minor produzione di latte e rialzo delle cellule somatiche. Queste forme sono difficilmente trattabili e conducono spesso all eliminazione dell animale. I microrganismi responsabili delle mastiti possono essere classificati in base alle modalità di trasmissione in: contagiosi, che si trasmettono da un animale infetto ad uno sano durante la mungitura (Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Mycoplasma); ambientali, la cui fonte principale è rappresentata dalla lettiera, che sono favoriti in condizioni di umidità e temperatura elevata, sovraffollamento, scarsa igiene (Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Escherichia coli e Salmonella spp.); opportunisti, che si localizzano principalmente sulla cute della mammella e del capezzolo e in seguito ad immunodepressione dell animale possono colonizzare il dotto del capezzolo (Stafilococchi coagulasi negativi - CNS). La mastite, come quasi tutte le patologie che possono colpire gli animali da reddito, è quindi il risultato dell interazione tra animale, ambiente e microrganismo causa di malattia. Il problema mastite va quindi inserito all interno di un progetto gestionale, che non si limiti alla cura del singolo caso, ma valuti lo stato di salute della mammella della mandria.

3 Attualmente la diagnosi di mastite si basa principalmente su una analisi della sintomatologia clinica, sulla conta di cellule somatiche (SSC) e sull isolamento batteriologico di patogeni eventualmente presenti nel latte. Questo tipo di analisi è però soggetto ad alcune limitazioni: infatti, a causa dei costi elevati, le indagini sono realizzate a campione e spesso in numero limitato, in particolare solo sui soggetti che presentano produzioni quali-quantitativamente alterate o sui campioni di latte in cui la conta delle cellule somatiche risulti elevata, essendo questo valore altamente correlato con la presenza di infezioni (Peeler et al., 2003). In questo modo non è possibile effettuare uno screening completo di un allevamento, come invece sarebbe necessario. Inoltre ultimamente si sono verificati numerosi casi in cui l isolamento di Staph. aureus è avvenuto anche da campioni con basso conteggio di cellule somatiche. Scopo del progetto era quello di risolvere le difficoltà metodologiche che a tutt oggi si verificano nel corso della gestione del problema mastite. Gli strumenti diagnostici correntemente utilizzati non sono adeguati ad una diagnosi precoce di una mastite e molto spesso, in particolare per le forme sub-cliniche, che non presentano una sintomatologia clinicamente manifesta, la patologia viene riconosciuta tardivamente, quando il danno economico è ormai non recuperabile. La diagnostica a livello molecolare rappresenta uno strumento più efficiente e sensibile e recentemente ai metodi tradizionali sono state affiancate analisi molecolari basate sull amplificazione del DNA dei patogeni mediante PCR (reazione a catena della polimerasi) (Riffon et al., 2001; Tamarapu et al., 2001; Akineden et al., 2001; Phuektes et al., 2003; Boerlin et al., 2003). I DNA microarray (o DNA chip) sono superfici miniaturizzate, contenenti sonde costituite da DNA deposte roboticamente su supporti in vetro in una posizione spaziale determinata da coordinate e permettono di identificare rapidamente e con estrema sensibilità e specificità sequenze di DNA caratteristiche di batteri patogeni. Il microchip viene messo a contatto con il materiale biologico, nella fattispecie il latte; la presenza o meno di DNA batterico viene individuata ed il tipo di batterio viene identificato sulla base delle coordinate con cui era stato disegnato il chip. La miniaturizzazione della matrice consente di raccogliere con un unico esperimento una quantità di informazioni precedentemente inimmaginabile, di utilizzare meno materiale, di ridurre i costi e i tempi. Particolare interessante, l intero processo può venire automatizzato, ed allo stato attuale la tecnologia è facilmente assimilabile a livello di Enti di Controllo, come per esempio ARAL. I Microchip a DNA sono già ampiamente utilizzati per identificare senza ambiguità i batteri responsabili di diverse patologie infettive (Gingeras et al., 1998; Smoot et al., 2002). In questo campo, la tecnologia dei microarray si è rivelata fortemente competitiva rispetto ai metodi convenzionali, in quanto permette un abbattimento di costi e tempo, garantendo allo stesso tempo un miglioramento nella qualità e validità dei dati ottenuti. Il chip a DNA sviluppato nel corso del progetto permette l identificazione dei seguenti patogeni: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus spp. (Stafilococchi Coagulasi Negativi), Streptococcus bovis, Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, Streptococcus canis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus parauberis, Streptococcus uberis, Streptococcus pyogenes, Mycoplasma spp., Salmonella spp., Bacillus spp., Campylobacter spp., Escherichia coli spp. E stato inoltre realizzato un software per l analisi statistica su larga scala dei dati raccolti di routine sulla concentrazione delle cellule somatiche, con l obiettivo di sviluppare un nuovo metodo statistico per la valutazione genetica del dato Somatic Cell Score in presenza ed assenza di dati relativi all infezione. 1.3 Bibliografia Akineden O., Annemuller C., Hassan AA., Lammler C. et al. (2001). Toxin genes and other characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Ali, A.K.A., and Shook G. (1980). An optimal transformation for somatic cell concentration in milk. J. Dairy Sci. 63: Boerlin P., Kuhnert P. et al. (2003). Methods for identification of Staphylococcus aureus isolates in cases of bovine mastitis. Journal of Clinical Microbiology,

4 Gingeras T.R., G. Ghandour, E. Wang, A. Berno, P.M. Small, F. Drobniewski, D. Alland, E. Desmond, M. Holodniy, J. Drenkow. (1998). Simultaneous genotyping and species identification using hybridazion pattern recognition analysis of generic Micobacterium DNA arrays. Genome Research 8: Huijps K,, Lam T., Hogeveen H. (2008) Costs of mastitis : facts and perception. J. Dairy Res. 75: Peeler EJ, Green MJ, Fitzpatrick JL, Green LE. (2003) The association between quarter somatic-cell counts and clinical mastitis in three British dairy herds. Prev Vet Med. 59: Phuektes P, Browning GF, Anderson G, Mansell PD. (2003). Multiplex polymerase chain reaction as a mastitis screening test for Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae and Streptococcus uberis in bulk milk samples. J Dairy Res. 70: Riffon R., Khampoune S, Hayssam K. et al. (2001). Development of a Rapid and Sensitive Test for Identification of Major Pathogens in Bovine Mastitis by PCR. Journal of Clinical Microbiology, 39: Schukken Y.H., Grommers F.J. Van De Geer D. & Brand A. (1993). Incidence of clinical mastitis on heard with low somatic cell count in bulk milk. Veterinary Record, 125: Smoot J.C., Barbian K.D., Van Gompel J.J., Smoot L.M., Chaussee M.S., Sylva G.L.,. Sturdevant D.E,. Ricklefs S.M, Porcella S.F., Parkins L.D., Beres S.B., Campbell D.S., Smith T.M., Zhang Q.,. V Kapur, J.A.Daly, L.G. Veasy, J.M. Musser. (2002). Genome sequence and comparative microarray analysis of serotype M18 group A Streptococcus strains associated with acute rheumatic fever outbreaks. Proc Natl Acad Sci U S A, 99: Tamarapu S., McKillip JL, Drake M. (2001). Development of a multiplex polymerase chain reaction assay for detection and differentiation of Staphylococcus aureus in dairy products. Journal of Food Protection, 64:

5 ATTIVITA' REALIZZATE E RISULTATI OTTENUTI RACCOLTA DEI CAMPIONI E ANALISI MICROBIOLOGICHE Nel corso dei due anni di attività sono stati raccolti 500 campioni di latte provenienti da vacche di razza Frisona ubicate nelle province di Lodi, Cremona, Milano, Pavia, Bergamo, Brescia, Varese, Como. Sui campioni di latte sono state eseguite la valutazione citologica e SCC differenziale. La SCC è stata determinata con un contacellule a fluorescenza (Bentley Somacount 150, Bentley Instrument, USA). Per l analisi statistica, l SCC è stata normalizzata a Somatic Cell Score lineare (SCS) mediante trasformazione log 2 standard di Ali and Shook (1980). E stata inoltre eseguita l analisi microbiologica per la valutazione dello stato sanitario degli animali: 10 microlitri di ognuno dei campioni di latte sono stati seminati su piastre di agar sangue (5% sangue di pecora defibrinato) incubate aerobicamente a 37 C ed esaminate dopo 24 ore. Le colonie sono state identificate sulla base della colorazione di Gram, della morfologia, del pattern di emolisi. Le colonie più rappresentative sono state subcoltivate su piastre di agar sangue ed incubate aerobicamente a 37 C per 24 ore al fine di ottenere colonie pure. La presenza di cocci Gram+ è stata evidenziata mediante produzione di catalasi e di coagulasi, mentre l identificazione di classi specifiche di Stafilococci è stata eseguita con micrometodi disponibili commercialmente (API Staph ; BioMérieux, Italy). La condizione di infezione dei campioni di latte è stata definita sulla base delle procedure raccomandate dal Consiglio Nazionale delle Mastiti (NMC, 1987) ed è stata diagnosticata una infezione intramammaria quando sono state isolate 500 CFU/ml e da 1 a 3 tipi di colonie. Nella figura 1 sottostante sono rappresentati i risultati ottenuti dall analisi microbiologica effettuata. Come mostrato, nella maggior parte dei campioni di latte analizzati (58%) non è stata rilevata la presenza di patogeni. Per quanto riguarda invece i campioni risultati positivi, i microrganismi maggiormente presenti sono risultati gli Stafilococchi Coagulasi Negativi (CNS Staphylococcus spp) (30,4%), seguiti da Staph. aureus (7,7% dei campioni analizzati). Altri patogeni rilevati appartenevano alle specie degli Streptococchi, di Mycoplasma e di Escherichia coli. Dei 500 quarti esaminati, 3, pari allo 0,6%, sono risultati ciechi, cioè non producevano latte per patologie precedenti. Figura 1. Risultati ottenuti dalle analisi microbiologiche dei campioni di latte raccolti, provenienti da diversi allevamenti lombardi. 58 % 7.6 % 1.4 % 30.4 % 0.8 % 1.1 % In allegato alla presente relazione vengono fornite le schede relative alle analisi batteriologiche effettuate.

6 SVILUPPO DEL CHIP A DNA DIAGNOSTICO Nel corso del primo anno di attività si è proceduto a sviluppare una piattaforma microarray basata sull utilizzo di array universali, associati ad una reazione di ligazione (ligation detection reaction, LDR), come descritto in Castiglioni et al., Gli array universali sono costituiti da vetrini microarray su cui vengono deposte sonde oligonucleotidiche chiamate Zipcode (schema riportato in figura 2), differenti l una dall altra, le cui sequenze sono costruite artificialmente in silico in modo da non avere nulla in comune con sequenze presenti in natura. Disegno delle sonde: I patogeni oggetto della presente ricerca sono identificati sulla base di polimorfismi specie-specifici. Il metodo prevede pertanto che per ogni singolo target da identificare siano disegnate due sonde oligonucleotidiche adiacenti, nella regione circostante il polimorfismo specie-specifico. Le due sonde ibridano affiancate sul templato e, solo se l appaiamento è avvenuto correttamente, un enzima DNA ligasi salda le loro estremità. Questa reazione prende il nome di LDR (ligation detection reaction). Successivamente i prodotti di ligazione sono ibridati sul vetrino microarray. Per il disegno delle sonde è stato utilizzato come gene target il gene che codifica per la subunità 16S dell RNA ribosomiale. Per il disegno delle sonde è stato sviluppato inoltre un apposito software per l identificazione in automatico dei polimorfismi gruppo-specifici di interesse. A questo punto si è proceduto ad una analisi in silico delle sonde disegnate su questi polimorfismi al fine di individuare quelle migliori. Da un numero iniziale di 385 probabili coppie di sonde ne sono state selezionate 16 per le prove in vivo, una per ogni gruppo selezionato tranne che per il gruppo dei Campylobacter spp., per l identificazione del quale ne sono state utilizzate due, come descritto nella tabella sottostante (Tabella 1). Estrazione del DNA genomico dai ceppi batterici: per le prove di ottimizzazione della metodica, è stata eseguita l estrazione del DNA da ceppi ATCC di riferimento o da ceppi di campo mediante il protocollo precedentemente sviluppato da Cremonesi et al., PCR: sono stati utilizzati il protocollo di amplificazione e i primer universali per la regione di DNA codificante per il 16S rrna come descritti in letteratura (Edwards et al., 1989). Ligase Detection Reaction (LDR): la reazione è stata eseguita in un volume finale di 20 L contenente il buffer 10X, 1 mol di ogni sonda, 50 fmol di prodotto di PCR purificato e quantificato mediante strumentazione Agilent Bioanalyser 2100 e 4U di Pfu DNA ligasi, con le seguenti modalità: denaturazione iniziale a 94 C per 5 minuti, seguita da 30 cicli di 94 C per 30 secondi e 65 C per 4 minuti, infine 2 minuti a 94 C. Ibridazione sul vetrino: dopo denaturazione, il prodotto della LDR è stato applicato al vetrino mediante una reazione di ibridazione a 65 C per un ora e mezza, in un apposita cameretta. Il segnale fluorescente è stato acquisito grazie al sistema di scansione laser ScanArray Lite (Perkin Elmer). Specificità delle sonde disegnate: nella figura 2 sottostante è mostrato lo schema dell array utilizzato e sono riportati alcuni dei risultati ottenuti dalle prove di specificità condotte sui ceppi di riferimento ATCC di Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma bovis e su un ceppo di campo di Streptococcus bovis: queste prove hanno dimostrato la corretta specificità delle sonde disegnate, in quanto hanno prodotto segnali di ibridazione ben interpretabili. Nel corso del secondo anno di attività del progetto si sono effettuate numerose prove di validazione delle sonde disegnate. A tal fine, per ogni campione batterico di riferimento analizzato, è stato calcolato il valore medio del rapporto tra segnale fluorescente e rumore di fondo (signal-to-noise-ratio, SNR) sia della specifica coppia di sonde sia delle restanti sonde non specifiche. E stato quindi condotto un t-test statistico per calcolare il p-value relativo alla specificità delle sonde. Come mostrato nella tabella 2 sottostante, per tutti i campioni analizzati i valori del p-value sono risultati inferiori allo 0,01, dimostrando in questo modo la grande specificità delle sonde disegnate e della metodica utilizzata. Grazie allo strumento diagnostico sviluppato è stato possibile discriminare tra due specie batteriche, Streptococcus uberis e Streptococcus parauberis, la cui identificazione è molto difficile da ottenere utilizzando i metodi biochimici classici. Un altro vantaggio della metodica sviluppata consiste nella sua capacità di identificare i batteri appartenenti alla specie Mycoplasma. Infatti l isolamento e l identificazione di questo microrganismo è molto difficoltosa e laboriosa da ottenere con i metodi microbiologici tradizionali, che richiedono circa sette giorni per una diagnosi. Sensibilità del metodo sviluppato: nel secondo anno di attività si è anche proceduto a stabilire i limiti di sensibilità del metodo, utilizzando diluizioni seriali (da 100 ad 6 femtomoli) del DNA estratto da diversi ceppi batterici ATCC.

7 Nella figura 3 sottostante sono mostrati alcuni dei risultati ottenuti. Nella figura sono riportati i valori di SNR (signal-to-noise) e i p-value (in scala logaritmica) ottenuti dalle analisi compiute utilizzando diluizioni seriali di quattro specie batteriche. Considerando 0,01 il valore soglia significativo per la rilevazione del segnale specifico della sonda, il limite di rilevazione per le specie Mycoplasma bovis, Str. agalactiae e Str. pyogenes è stato di 6 femtomoli, mentre quello per la specie Staph. aureus è stato di 12 femtomoli. Come atteso, i valori di SNR e di p-value sono risultati essere inversamente correlati (correlazione di Pearson compresa tra e -0.97). Validazione del DNA chip con campioni di campo: il DNA chip sviluppato è stato utilizzato per testare i campioni di latte raccolti in diversi allevamenti lombardi e risultati positivi per la presenza di uno o più patogeni dai test microbiologici effettuati. Nella maggior parte dei casi, le analisi molecolari condotte hanno confermato i risultati ottenuti mediante le tecniche microbiologiche classiche. Per due campioni di latte, il chip a DNA ha rilevato, in un caso, la presenza anche di Stafilococchi CNS, e nel secondo caso anche la presenza di Str. uberis e Mycoplasma, oltre a quella di Staph. aureus in accordo con le analisi microbiologiche (figura 4). Inoltre, nel primo caso, le analisi con DNA chip hanno permesso di identificare come Str. uberis la specie di streptococchi presente. Ring Test: una volta conclusa la fase di definizione del protocollo per l identificazione dei patogeni, la procedura è stata validata mediante lo svolgimento di un Ring-Test Interno, per permettere un controllo sulla qualità del procedimento analitico eseguito. L estrazione del DNA e le prove di ibridazione su DNA chip di un numero scelto di campioni sono state effettuate in parallelo in due diversi laboratori del DIPAV. I risultati ottenuti nei tre diversi laboratori (uno di IBBA-CNR, due del DIPAV) sono risultati riproducibili, con un coefficiente di variabilità inferiore al 5%, confermando la corretta esecuzione della procedura e la validità dei risultati ottenuti. Studio di fattibilità per sviluppo di un test diagnostico: a livello interno è stato effettuato uno studio della fattibilità per lo sviluppo di un test rapido per la diagnosi precoce di mastiti subcliniche basate sull impiego di chip a DNA sviluppato nel corso del progetto. L intero processo che va dall estrazione del DNA dal campione di latte all analisi finale dei dati ottenuti dall impiego del chip a DNA può essere completato in meno di sette ore. I costi stimati sono di circa 1 a campione; questi costi comprendono la sintesi delle sonde e tutti i reagenti che si utilizzano. Gli alti costi iniziali necessari per l allestimento di un laboratorio per microarray, dovuti all acquisto degli strumenti necessari alla creazione dei chip a DNA (robot per lo spottaggio) e alla lettura dei chip a DNA dopo l ibridazione (laser scanner), possono essere ammortizzati in un periodo medio di 3 anni. In alternativa, esistono oggi sul mercato ditte che offrono il servizio di spottaggio e di lettura dei chip a DNA a costi ragionevoli. Allo stato attuale non è possibile utilizzare il chip a DNA direttamente in campo mediante tecnologie del tipo SNAP-test, ma non si esclude che in un prossimo futuro la diffusione della analisi mediante chip a DNA in altri campi, quali per esempio la diagnostica in oncologia, oppure la stessa analisi routinaria sulle derrate alimentari, possa favorire lo sviluppo di tecnologie più economiche alla portata di un comune laboratorio di analisi. Attrezzature utilizzate per lo sviluppo del DNA chip diagnostico Per l estrazione del DNA dai campioni di latte: concentratore Eppendorf, centrifughe da banco, spettrofotometro Nanodrop. Per la preparazione dei DNA chip: depositore per microarray BioRobotics. Per le analisi molecolari: tre termociclatori (2 Applied Biosystem e 1 Eppendorf), un 2100 Bioanalyzer Agilent, un incubatore Thermo, uno scanner per microarray ScanArray Lite Perkin Elmer.

8 Tabella 1. Lista delle sonde disegnate per la messa a punto del chip a DNA. NOME SONDA DISCRIMINANTE (5 3 ) SONDA COMUNE (5 3 ) Staph. aureus TAA TAC CGG ATA ATA TTT TGA ACC GCA TGG TTC AAA AGT TTG CTG TCA CTT ATA GAT GGA TCC GCG CTG CAT TAG CTA GAA AGA CGG TC GTT GGT AA Str. canis CGT AAA GCT CTG TTG TTA GAG AAG AAC GGT AAT GGG AGT CCA TTA TGT GAC GGT AAC TAA CCA GAA AGG GAC GGC TAA GGA AAA C CTA C Str. dysgalactiae GGT CTA GAG ATA GGC TTT CCC TTC GGG GCA GG AGT GAC AGG TGG TGC ATG GTT GTC GTC AGC TCG Salmonella spp. CCA TCA GAT GTG CCC AGA TGG GAT TAG CTT GTT GGT GA GGT AAC GGC TCA CCA AGG CGA CGA TCC CTA G Campylobacter spp. CCC TAC ACA AGA GGA CAA CAG TTG GAA ACG ACT GCT AAT ACT CTA TAC TCC TGC TTA ACA CAA GTT GAG TAG GGA AAG TTT TTC GGT GTA Campylobacter spp. CTC TAT ACT CCT GCT TAA CAC AAG TTG AGT AGG GAA AGT TTT TCG G TGT AGG ATG AGA CTA TAT AGT ATC AGC TAG TTG GTI AGG TAA TGG C Bacillus spp. CTA AGT GTT AGA GGG TTT CCG CCC TTT AGT GCT GAA GT TAA CGC ATT AAG CAC TCC GCC TGG GGA GTA CG Str. equi subsp. CTA ATA CCG CAT AAA AGT GGT TGA CCC ATG TTA ACI GCT CCA CTA TGA GAT GGA CCT GCG TTG TAT zooepidemicus ATT TAA AAG GAG CAA CA TAG CTA GTT Str. agalactiae CGT GCC TAA TAC ATG CAA GTA GAA CGC TGA IGT TTG GTG TTT A CAC TAG ACT GAT GAG TTG CGA ACG GGT GAG TAA CG Str. bovis GCG TGC CTA ATA CAT GCA AGT AGA ACG CTG AAG ACT TTA GCT TGC TAA AGT TGG AAG AGT TGC GAA CGG GTG AGT AAC GCG TAG GTA A Str. parauberis GCC GTG GCT CAA CCA TGG TTC GCT TTG GAA ACT GGA T AAC TTG AGT GCA GAA GGG GAG AGT GGA ATT CCA TGT GTA GC Str. uberis AAT ACC GCA TGA CAA TAG GGT ACA CAT GTA CCC TAT TTA TGC TTC ACT ATG AGA TGG ACC TGC GTT GTA TTA GCT AGT AAA GGG GCA AA TGG TAA GGT AA Mycoplasma spp. CGI CGC AGC TAA CGC ATT AAA TGA TCC GCC TGA GT AGT AIG ITC GCA AGA ITI AAA CTT AAA GGA ATT GAC GGG GAI CC Staph. CNS CCG GAG CTA ATA CCG GAT AAT ATI TIG AAC CGC ATG GTT CIA T AGT GAA AGA IGG TTT TGC TIT CAC TTA TAG ATG GAI CCG CGC Str. pyogenes GCA GGC GGT TTT TTA AGT CTG AAG TTA AAG GCA TTG GCT CAA CCA A TGT ACG CTT TGG AAA CTG GAG AAC TTG AGT GCA GAA GGG E. coli spp. GGG TTG TAA AGT ACT TTC AGC GGG GAG GAA GGG AGT AAA GTT AAT AC CTT TGC TCA TTG ACG TTA CCC GCA GAA GAA GCA CCG G

9 Tabella 2. Prove di specificità delle sonde disegnate. SNR della MediaSNR p-value delle Organismo Specie Collezione Nome della sonda sonda delle altre sonde specifica sonde(n=14) specifiche Bacillus Bacillus cereus ATCC Bacillus spp E E-09 Campylobacter Campylobacter coli ATCC 1061 Campylobacter spp E-07 Campylobacter spp E-04 Campylobacter lari ATCC Campylobacter spp E-06 BAA1060 Campylobacter spp E-08 Campylobacter jejuni ATCC Campylobacter spp E E-06 Campylobacter spp E E-05 E. coli E. coli O157 ATCC Ecoli E E-09 Mycoplasma M. agalactiae DIPAEE Mycoplasma spp E E-04 M. arginini DIPAEE E-04 M. bovis DIPAEE E E-12 M. capri DIPAEE E-06 M. capricolum DIPAEE E-04 M. mycoides DIPAEE E-05 Salmonella Salmonella enteritidis ATCC Salmonella spp E E-11 Staphylococcus Staph. aureus ATCC Staph. aureus E E-10 Staph. epidermidis ISPA-CNR Staph. CNS E E-06 Staph. sciuri DIPAV E-04

10 E-05 Staph. haemoliticus DIPAV E E-05 Streptococcus Str. agalactiae ATCC BAA611 Str. agalactiae E E-07 Str. uberis ATCC 9927 Str. uberis E E-11 Str. parauberis DMS 6632 Str. parauberis E E-10 Str. bovis DIPAV Str. bovis E E-06 Str. canis DIPAV Str. canis E E-10 Str. dysgalactiae DIPAV Str. dysgalactiae E E-08 Str. equi subsp. DIPAV Str. equi E-06 zooepidemicus E-07 Str. pyogenes ATCC Str. pyogenes E E-14

11 Tabella 3. Validazione del DNA chip con campioni di campo. N campioni Analisi microbiologiche Analisi DNA-chip 290 Negativo Negativo 152 Coagulase Negative Staphylococci Coagulase Negative Staphylococci 37 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 6 Mycoplasma spp. Mycoplasma spp. 4 Escherichia coli Escherichia coli 3 Streptococcus dysgalactiae Streptococcus dysgalactiae 2 Streptococcus agalactiae Streptococcus agalactiae 1 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, Mycoplasma spp. 1 Streptococcus canis Streptococcus canis 1 Streptococcus uberis Streptococcus uberis 1 Streptococcus bovis Streptococcus bovis 1 Streptococcus equi Streptococcus equi 1 Streptococcus spp. Streptococcus uberis, Coagulase Negative Staphylococci

12 Figura 2. Prototipo del DNA chip sviluppato e alcune prove di specificità delle sonde. A) schema del chip a DNA; B) gruppi batterici identificati; C) alcuni risultati ottenuti.

13 Figura 3. Test di sensibilità delle sonde. Figura 4. Confronto di alcuni risultati ottenuti dall analisi di campioni di campo con metodi microbiologici classici e con il chip a DNA sviluppato.

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15 SVILUPPO DI UN SOFTWARE PER LA VALUTAZIONE DEGLI ANIMALI SOMATIC CELL SCORES TRAMITE E stata effettuata una analisi statistica su larga scala dei dati raccolti di routine, allo scopo di sviluppare un software che correli il numero di cellule somatiche e lo status sano/infetto dell animale. Matematicamente, i dati per il Somatic Cell Score (SCC) sono solitamente analizzati come dati omogenei. Tuttavia, la distribuzione statistica di SCC è in realtà una combinazione o una miscela di dati provenienti da due distribuzioni, 1) quella degli animali infetti e 2) quella dele vacche sane, ciascuno con varianza differente o "eteroschedastica". Il software sviluppato tiene conto di questa differenza nelle distribuzioni, stimando i valori di SCC di allevamento dei bovini (vacche e tori, in quanto carattere trasmissibile geneticamente) per entrambi i tipi di dati SCC. Tali dati consentiranno di effettuare quindi una più precisa selezione nella stima del valore genetico degli animali per la resistenza mastite. L approccio di Ødegård et al. (2003) è stato usato per ottenere un Heteroscedastic Bayesian Normal Mixture Model per predire la presenza o l assenza di mastite in assenza di dati batteriologici. Inoltre, sono state stimate le ereditabilità del Somatic Cell Score in presenza ed in assenza dell infezione batterica e le correlazioni tra tutti i caratteri considerati. Il modello matematico sviluppato dal gruppo di ricerca (Boettcher PJ, Caraviello D, Gianola D. (2007). Genetic analysis of Somatic Cell Scores in US Holsteins with a Bayesian mixture model. J Dairy Sci.;90(1): ) ) è stato utilizzato come punto di partenza per la realizzazione del software. Il software è stato programmato in modo da poter gestire valutazioni genetiche su ampia scala, per razze ad ampia diffusione. Il programma, ad esempio, potrà essere applicato ai dati relativi alla razza Frisona italiana e, di conseguenza, le correlazioni popolazione-specifiche potranno essere utilizzate per confrontare indici genetici per maschi e femmine con i modelli finora usati dalla Associazione Nazionale di Allevatori Frisona Italiana. Inoltre, i dati di queste analisi possono essere utilizzati anche a posteriori per prevedere quali animali avevano mastite durante una data lattazione. Perché si tratta di un analisi retroattiva, essa non sarà utile per l individuazione e la cura dei casi clinici di mastite, ma potrà fornire agli allevatori informazioni preziose per l'identificazione dei bovini affetti da infezioni subcliniche, in modo che gli animali possano essere trattati durante il periodo di asciutta o eliminati alla fine della lattazione. Il programma ed una descrizione dettagliata dello stesso sono allegati alla presente relazione.

16 RISULTATI RAGGIUNTI Nei due anni di attività sono stati ottenuti, quali indicatori di risultati misurabili: 1. raccolta di 500 campioni di latte provenienti da vacche di razza Frisona ubicate nelle province di Lodi, Cremona, Milano, Pavia, Bergamo, Brescia, Como e Varese; 2. messa a punto di test molecolari avanzati basati su chip a DNA; 3. analisi microbiologica dei campioni di latte raccolti, per la valutazione dello stato sanitario degli animali mediante microchip a DNA e conferma mediante tecniche batteriologiche convenzionali; 4. dati relativi allo stato sanitario delle bovine da latte negli allevamenti lombardi testati, relativamente alla prevalenza di patogeni nel latte; 5. messa a punto di un modello matematico e relativo software che permetterà di valutare gli animali per quanto riguarda la loro resistenza alle mastiti; 6. studio di fattibilità per la realizzazione di un test diagnostico. SVILUPPI FUTURI Nel complesso, il progetto SAFEMILK ha generato due prodotti: un chip a DNA per l identificazione dei patogeni presenti nel latte e un programma per la valutazione del Somatic Cell Score (SCS). Per entrambi questi prototipi è possibile ipotizzare una serie di sviluppi futuri, nonché di possibili applicazioni. La potenzialità del SCS è notevole, dal momento che il programma può permettere di individuare gli animali maggiormente resistenti alla mastite. In una fase applicativa, gli enti maggiormente interessati ad un ulteriore sviluppo ed applicazione del programma sono i laboratori di referenza delle Associazioni Nazionali degli Allevatori. Il prototipo del chip a DNA sviluppato nell ambito di SAFEMILK è già in una fase applicativa. Il chip a DNA si è dimostrato essere uno strumento estremamente versatile. Progettato inizialmente per la valutazione delle contaminazioni batteriche nel latte bovino, il chip a DNA è stato utilizzato, con risultati positivi, anche per il monitoraggio del latte di capra. Una ulteriore fase applicativa prevede la sua validazione anche in altre specie, quali bufalo e pecora. Uno studio sulla potenziale applicabilità è oggetto di una richiesta di finanziamento europeo, avanzata dal gruppo responsabile di SAFEMILK, focalizzato sulla possibilità di utilizzare il chip a DNA come strumento di trasferimento tecnologico alle piccole medie aziende. Il progetto prevede uno studio sulla applicabilità del DNA chip lungo tutto la filiera produttiva, a partire dal latte di massa fino ad arrivare al prodotto finito (formaggio, ma anche yogurt e gelato). Come è stato disegnato, il chip a DNA rappresenta uno strumento che può venire facilmente utilizzato non solo per la ricerca di batteri responsabili di mastite, ma anche di qualsiasi altro tipo di batteri contaminanti eventualmente introdotti lungo la filiera del latte. Si tratta pertanto di uno strumento facilmente utilizzabile per la tracciabilità igienico-sanitaria: considerata la relativa economicità e versatilità, il chip a DNA ha suscitato un notevole interesse da parte di PMI. Hanno manifestato interesse sia le PMI direttamente coinvolte nella produzione di latte o di alimenti ad esso correlati, sia altre PMI interessate alla analisi dei prodotti di origine animale. CONCLUSIONI La combinazione di un attento disegno delle sonde e della piattaforma microarray si è dimostrata essere un valido strumento per l identificazione dei batteri patogeni nel contesto del controllo della mastite bovina e della sicurezza dei prodotti lattiero-caseari. Oltre a garantire un miglioramento nella qualità e validità dei dati ottenuti, la tecnologia dei microarray è fortemente competitiva rispetto ai metodi convenzionali, in quanto permette un abbattimento di costi e tempo, e presenta quindi le caratteristiche ottimali per diventare analisi di routine. Il prototipo di DNA chip sviluppato nel corso del presente progetto costituisce pertanto la base per lo sviluppo di un test rapido per la diagnosi precoce di mastiti subcliniche nei bovini.

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18 CORSI E CONVEGNI PER LA DIFFUSIONE DEI RISULTATI: 1) Corso organizzato da Bioskills: Metodi Diagnostici Molecolari nel Settore Lattiero-Caseario, Aspetti teorici e pratici, 1 marzo 2007, CNR - Palazzo LITA - via Fratelli Cervi, 93 - Segrate (MI): Dr.ssa Bianca CASTIGLIONI ((IBBA-CNR): Tecniche PCR e microarray per la determinazione rapida e accurata dei principali patogeni nel settore lattiero-caseario. Dr.ssa Paola CREMONESI (IBBA-CNR): Metodi molecolari per la determinazione di ceppi produttori di tossine nel latte e nei formaggi: purificazione DNA estratto e allestimento di una PCR + gel. 2) Corso organizzato da Bioskills: Metodi Diagnostici Molecolari nel Settore Lattiero-Caseario, Aspetti teorici e pratici, 15 maggio 2008, c/o Parco Tecnologico Padano, Lodi: Dr.ssa Bianca CASTIGLIONI (IBBA-CNR): Sviluppo di DNA microarray per la determinazione rapida e accurata dei principali patogeni nel settore lattiero-caseario. Dr.ssa Paola CREMONESI (IBBA-CNR): Metodi molecolari per la determinazione di ceppi produttori di tossine nel latte e nei formaggi: purificazione DNA estratto e allestimento di una PCR + gel. 3) Cremonesi P, Perez G, Pisoni G, Castiglioni B, Luzzana M, Battaglia C, Sartorelli P, Moroni P. Sviluppo di una piattaforma microarray per l identificazione di patogeni presenti nel latte: risultati preliminari. LXI Convegno SISVET, Salsomaggiore Terme, 26-29/09/ ) Cremonesi P, Pisoni G, Perez G, Sartorelli P, Moroni P, Castiglioni B. Sviluppo di una piattaforma microarray per l identificazione di patogeni presenti nel latte: risultati preliminari, nell ambito della Seconda Edizione del convegno Metodologie di genotipizzazione e diagnostica molecolare per il settore agroalimentare, Parco Tecnologico Padano, Lodi, 25/10/ ) Cremonesi P, Pisoni G, Luzzana M, Sartorelli P, Boettcher P, Castiglioni B, Moroni P. Development of a microarray platform for milk pathogens detection: preliminary results. 47th National Mastitis Council Meeting, New Orleans, Louisiana (USA), 20-23/01/ ) Cremonesi P, Pisoni G, Bronzo V, Moroni P, Castiglioni B. Controllo della filiera lattiero-casearia in un allevamento caprino lombardo. XVIII CONVEGNO NAZIONALE S.I.P.A.O.C., Trezzo sull Adda (Mi), 17-20/09/2008 Large Animal Review, 14 (4), 164, ) Cremonesi P, Pisoni G, Severgnini M, Moroni P, Raschetti M, Castiglioni B. Universal Array for Pathogens Detection in Milk and Cheese. First European Food Congress, Lubiana (Slovenia), 4-9/11/ ) Un prospetto di SAFEMILK è stato presentato in un workshop organizzato dalla Divisione Agricoltura della Regione Lombardia, il 24 ottobre 2008, presso la 63 Fiera Internazionale della Bovina da Latte di Cremona. 9) Cremonesi P., Pisoni G., Moroni P., Severgnini M., Castiglioni B. Sviluppo di chip a DNA per il controllo qualitativo dei prodotti lattiero-caseari. XVII Conferenza Nazionale Oxoid: La sicurezza microbiologica nella produzione di alimenti per il 21 secolo. Bologna, 26/5/2009. Articoli relativi al progetto sono stati pubblicati su Lombardia Verde (n. (22) 9- novembre 2006), sull Informatore Zootecnico (n.21 del 12 Dicembre 2008 Dossier Mastiti) e su Agrisole, supplemento del Sole 24 Ore (8-14 maggio 2009, pag. 12). PUBBLICAZIONI SU RIVISTE INTERNAZIONALI CENSITE ISI:

19 1) Cremonesi P, Perez G, Pisoni G, Castiglioni B, Luzzana M, Battaglia C, Sartorelli P, Moroni P. (2008). Development of a microarray platform for detection of milk pathogens: preliminary results. Veterinary Research Communications, 32, suppl. 1: ) Cremonesi P, Pisoni G, Severgnini M, Consolandi C, Moroni P, Raschetti M, Castiglioni B. (2009). Pathogen detection in milk samples by ligation detection reaction-mediated universal array method J. Dairy Sci.92: ) Severgnini M., Cremonesi P., Consolandi C., Caredda G., De Bellis G., Castiglioni B. (2009). ORMA: a tool for identification of species-specific variations in 16S rrna gene and oligonucleotides design. Nucleic Acids Research: 1-15 doi: /nar/gkp499. ALLEGATI Allegato 1. Schede relative alle analisi batteriologiche effettuate, divise per province. Allegato 2. Software sviluppato e manuale di utilizzo.

20 Riassunto prelievi dal al Cremona Pavia Milano Varese Brescia Bergamo Lodi Totale stf.spp 14 stf.spp 26 stf.spp 12 stf.spp 8 stf.spp 43 stf.spp 37 stf.spp stf.aureus 4 stf.aureus 4 stf.aureus 0 stf.aureus 6 stf.aureus 13 stf.aureus 11 stf.aureus 38 E.coli 2 E.coli 0 E.coli 2 E.coli 0 E.coli 0 E.coli 0 E.coli 0 4 negativo 20 negativo 43 negativo 20 negativo 10 negativo 95 negativo 88 negativo str.spp 0 str.spp 1 str.spp 2 str.spp 0 str.spp 0 str.spp 4 str.spp 0 7 cieco 0 cieco 2 cieco 0 cieco 0 cieco 1 cieco 0 cieco 0 3 myco 0 myco 0 myco 0 myco 0 myco 0 myco 0 myco 6 6 Totale aziende Totale 500 1

21 AZIENDE DELLA PROVINCIA DI CREMONA Azienda Bovina Numero lattaz QUARTO SCC BATTERIOLOGIA mon 19 2 AS 1268 stf.aureus mon 19 2 AD 978 stf.spp mon 19 2 PD 1416 stf.aureus mon 19 2 PS 937 stf.spp mon 24 7 AS 345 negativo mon 24 7 AD 456 negativo mon 24 7 PS 950 negativo mon 24 7 PD 1 stf.spp mon 32 2 AD 1653 E.coli mon 32 2 PD 124 negativo mon 32 2 PS 3 negativo mon 32 2 AS 891 stf.spp mon AD 24 negativo mon PD 50 negativo mon PS 26 negativo mon AS 318 stf.spp pre 12 4 PS 740 negativo pre 12 4 AD 2671 stf.aureus pre 12 4 PD 1735 stf.aureus pre 12 4 AS 3002 stf.spp pre 64 3 AS 51 negativo pre 64 3 AD 50 negativo pre 64 3 PD 5215 negativo pre 64 3 PS 332 negativo pre 83 2 AS 4450 E.coli pre 83 2 AD 2383 stf.spp pre 83 2 PD 1966 stf.spp pre 83 2 PS 1612 stf.spp pre AD 50 negativo pre PD 189 negativo pre AS 786 stf.spp pre PS 3512 stf.spp pre AS 340 negativo pre PD 820 negativo pre PS 173 negativo pre AD 349 stf.spp pre AS 179 negativo pre PS 54 negativo pre AD 411 stf.spp pre PD 386 stf.spp 2

22 AZIENDE DELLA PROVINCIA DI PAVIA Azienda Bovina Numero lattaz QUARTO SCC BATTERIOLOGIA ban AS 432 negativo ban PD 189 negativo ban PS 19 negativo ban AD 431 stf.spp ban AS 217 stf.spp ban AD 299 stf.spp ban PD 137 stf.spp ban PS 337 stf.spp ban AS 48 negativo ban AD 44 negativo ban PD 47 negativo ban PS 24 stf.spp ban PS cieco ban AD 639 negativo ban PD 204 negativo ban AS 804 stf.spp ban AD 294 negativo ban PS 149 negativo ban PD 211 stf.spp ban AS 505 str.spp ban AS 68 negativo ban AD 26 negativo ban PD 158 negativo ban PS 211 negativo ban AS 239 negativo ban AD 77 negativo ban PD 159 stf.spp ban PS 94 stf.spp ban AS 1 negativo ban AD 264 negativo ban PD 282 stf.spp ban PS 771 stf.spp ban AD 1007 stf.aureus ban PD 115 stf.spp ban AS 819 stf.spp ban PS 593 stf.spp ban AS 84 negativo ban AD 65 negativo ban PD 117 negativo 3

23 ban PS 176 negativo ban AS 59 negativo ban AD 23 negativo ban PD 25 negativo ban PS 120 negativo ban AS 220 negativo ban PS 401 negativo ban AD 1166 stf.aureus ban PD 1163 stf.spp ban AD cieco ban AS 66 negativo ban PD 68 negativo ban PS 46 negativo ban AS 93 negativo ban AD 69 negativo ban PD 70 negativo ban PS 56 negativo ban PS 210 negativo ban AD 9277 stf.aureus ban PD 4904 stf.aureus ban AS 2261 stf.spp gai 34 1 AS 29 stf.spp gai 34 1 AD 571 stf.spp gai 34 1 PD 25 stf.spp gai 34 1 PS 1163 stf.spp gai AD 226 negativo gai PS 495 negativo gai AS 556 stf.spp gai PD 345 stf.spp gai AS 34 negativo gai AD 41 negativo gai PD 68 negativo gai PS 26 negativo gai PS 614 negativo gai AS 866 stf.spp gai AD 2150 stf.spp gai PD 911 stf.spp 4

24 AZIENDE DELLA PROVINCIA DI MILANO Allevatore Bovina Numero lattaz QUARTO SCC BATTERIOLOGIA mig 3 2 AS 343 negativo mig 3 2 PD 283 negativo mig 3 2 AD 6608 stf.spp mig 3 2 PS 1426 stf.spp mig 13 3 PS 2695 E.coli mig 13 3 AD 489 negativo mig 13 3 PD 814 negativo mig 13 3 AS 959 str.spp mig 32 3 AS 43 negativo mig 32 3 AD 120 negativo mig 32 3 PD 51 negativo mig 32 3 PS 1530 stf.spp mig 71 4 AS 90 negativo mig 71 4 AD 226 negativo mig 71 4 PD 129 negativo mig 71 4 PS 64 negativo mig PD 1129 E.coli mig AS 345 stf.spp mig AD 314 stf.spp mig PS 6182 str.spp mig AS 250 negativo mig PD 63 negativo mig PS 114 negativo mig AD 578 stf.spp val 67 4 AS 701 negativo val 67 4 PS 608 negativo val 67 4 AD 1280 stf.spp val 67 4 PD 885 stf.spp val AD 713 negativo val PS 180 negativo val AS 1025 stf.spp val PD 2635 stf.spp val AS 33 negativo val PD 161 negativo val AD 666 stf.spp val PS 1689 stf.spp 5

25 AZIENDE DELLA PROVINCIA DI VARESE-COMO Allevatore Bovina Numero lattaz QUARTO SCC BATTERIOLOGIA gre 2 3 PD 330 negativo gre 2 3 PS 834 negativo gre 2 3 AS 1807 stf.aureus gre 2 3 AD 2512 stf.aureus gre 6 4 AS 2652 stf.aureus gre 6 4 PS 1108 stf.spp gre 6 4 AD 788 stf.spp gre 6 4 PD 660 stf.spp gre PD 1782 stf.aureus gre PS 1153 stf.aureus gre AS 1825 stf.spp gre AD 1285 stf.spp mart 10 4 AD 60 negativo mart 10 4 PD 153 negativo mart 10 4 PS 146 negativo mart 10 4 AS 302 stf.spp mart 24 2 AS 633 negativo mart 24 2 PS 387 negativo mart 24 2 AD 5672 stf.aureus mart 24 2 PD 1089 stf.spp mart AS 385 negativo mart PD 134 negativo mart PS 150 negativo mart AD 457 stf.spp 6

26 AZIENDE DELLA PROVINCIA DI BRESCIA Allevatore Bovina Numero lattaz QUARTO SCC BATTERIOLOGIA ant 74 2 AS 478 negativo ant 74 2 PD 767 negativo ant 74 2 PS 310 negativo ant 74 2 AD 1977 stf.spp ant AS 38 negativo ant AD 6 negativo ant PS 32 negativo ant PD 367 stf.spp ant AS 12 negativo ant PS 10 negativo ant AD 564 stf.spp ant PD 29 stf.spp ant AD 121 negativo ant AS 316 negativo ant PD 386 negativo ant PS 111 negativo ant AD 393 negativo ant PD 183 negativo ant PS 41 negativo ant AS 534 stf.spp ant AS 542 negativo ant AD 61 negativo ant PD 6 negativo ant PS 254 stf.spp bertas 32 2 Ps 1366 negativo bertas 32 2 As 2734 stf.aureus bertas 32 2 Ad 2293 stf.aureus bertas 32 2 Pd 2896 stf.aureus bertas 45 2 As 88 negativo bertas 45 2 Ad 68 negativo bertas 45 2 Pd 78 negativo bertas 45 2 Ps 95 negativo bertas 83 1 Ad 82 negativo bertas 83 1 Pd 75 negativo bertas 83 1 Ps 58 negativo bertas 83 1 As 2879 stf.spp bertas 96 2 As 74 negativo bertas 96 2 Ad 48 negativo bertas 96 2 Pd 52 negativo bertas 96 2 Ps 41 negativo 7

27 bertas Ad 321 negativo bertas Pd 257 negativo bertas As 946 stf.spp bertas Ps 544 stf.spp bertas As 854 negativo bertas Ad 848 negativo bertas Pd 905 negativo bertas Ps 5000 stf.spp caser 74 2 AS 247 negativo caser 74 2 PD 144 negativo caser 74 2 PS 3 negativo caser 74 2 AD 7855 stf.spp caser As 75 negativo caser Ad 8 negativo caser Pd 9 negativo caser Ps 13 negativo caser AS 25 negativo caser AD 1 negativo caser PS 5 negativo caser PD 369 stf.spp caser AS 58 negativo caser PD 60 negativo caser PS 36 negativo caser AD 2750 stf.spp caser AD 24 negativo caser AS 69 negativo caser PS 28 negativo caser PD 400 stf.spp caser As 386 negativo caser Ad 5038 stf.spp caser Pd 4282 stf.spp caser Ps 2380 stf.spp giser 19 2 Ps 51 negativo giser 19 2 As 3853 stf.spp giser 19 2 Ad 231 stf.spp giser 19 2 Pd 83 stf.spp giser 24 7 Ad 45 negativo giser 24 7 Ps 208 negativo giser 24 7 As 1278 stf.spp giser 24 7 Pd 1052 stf.spp giser 38 3 As 304 negativo giser 38 3 Ad 333 negativo giser 38 3 Pd 184 negativo 8

28 giser 38 3 Ps 141 negativo giser 48 2 As 3734 stf.aureus giser 48 2 Ps 5312 stf.aureus giser 48 2 Ad 324 stf.spp giser 48 2 Pd 288 stf.spp giser As 1709 stf.aureus giser Ad 1789 stf.aureus giser Ps 475 stf.spp giser Pd 2112 stf.spp giser As 84 negativo giser Ad 56 negativo giser Pd 27 negativo giser Ps cieco giser As 127 negativo giser Ad 81 negativo giser Pd 68 negativo giser Ps 104 negativo giser Ad 150 negativo giser Pd 287 negativo giser As 1739 stf.aureus giser Ps 1614 stf.aureus giser Ad 2521 stf.aureus giser As 1513 stf.spp giser Pd 2011 stf.spp giser Ps 5397 stf.spp giser Ad 63 negativo giser Pd 15 negativo giser Ps 42 negativo giser As 242 stf.spp ter AS 12 negativo ter AD 14 negativo ter PD 41 negativo ter PS 27 negativo ter AS 5 negativo ter AD 27 negativo ter PS 22 negativo ter PD 1132 stf.spp ter AS 7 negativo ter AD 29 negativo ter PD 50 negativo ter PS 544 stf.spp ter AS 1 negativo ter AD 15 negativo 9

29 ter PD 71 negativo ter PS 175 negativo zanb 63 2 Pd 5091 stf.aureus zanb 63 2 Ad 80 stf.spp zanb 63 2 Ps 1991 stf.spp zanb 63 2 As 1289 stf.spp zanb As 281 negativo zanb Ad 821 negativo zanb Pd 245 negativo zanb Ps 281 negativo zanb As 1201 stf.spp zanb Ad 496 stf.spp zanb Pd 293 stf.spp zanb Ps 3067 stf.spp zanb Pd 3203 stf.aureus zanb As 3462 stf.spp zanb Ad 4095 stf.spp zanb Ps 7260 stf.spp zanb Ad 1183 negativo zanb Ps 268 negativo zanb Pd 1075 stf.aureus zanb As 8071 stf.spp zanb As 88 negativo zanb Ad 99 negativo zanb Pd 190 negativo zanb Ps 138 negativo 10

30 AZIENDE DELLA PROVINCIA DI BERGAMO Allevatore Bovina Numero lattaz QUARTO SCC BATTERIOLOGIA bass AS 1873 negativo bass PS 1401 negativo bass AD 213 negativo bass PD 362 negativo bass AD 3205 negativo bass PS 211 negativo bass PD stf.aureus bass AS 515 stf.spp bass AS 191 negativo bass AD 244 negativo bass PD 152 negativo bass PS 27 negativo bass AD 446 negativo bass PS 504 negativo bass AS 527 stf.spp bass PD 580 stf.spp bass AD 106 negativo bass PD 74 negativo bass PS 150 negativo bass AS 1872 stf.aureus bass PS 341 negativo bass AS 89 negativo bass AD 70 negativo bass PD 65 negativo bass PD negativo bass AS 125 negativo bass AD 104 negativo bass PS 58 negativo bass PS 209 negativo bass AD 591 stf.spp bass PD 157 stf.spp bass AS 1262 stf.spp bel 28 2 AS 287 stf.spp bel 28 2 PD 362 stf.spp bel 28 2 PS 325 stf.spp bel 28 2 AD 343 stf.spp bel 57 2 AS 1973 negativo bel 57 2 AD 1628 negativo bel 57 2 PS 618 negativo bel 57 2 PD 1251 stf.spp 11