Corso di Tecniche diagnostiche in ematologia

Transcript

1 Corso di Tecniche diagnostiche in ematologia Struttura e funzione del sistema emopoietico Inquadramento fisiopatologico Tecniche di studio, cliniche e sperimentali Trapianto di cellule staminali Principali patologie ematologiche Inquadramento fisiopatologico Approccio diagnostico laboratoristico Approcci terapeutici innovatici Inquadramento anemie Neoplasie Mieloproliferative croniche Leucemia mieloide cronica Leucemie mieloidi acute Malattie linfoproliferative croniche Patologie delle piastrine Patologie congenite dei fattori della coagulazione 1

2 Libri di testo Non esiste alcun testo specifico consigliato, i seguenti permettono di estrapolare agevolmente le necessarie informazioni di fisiopatologia e diagnostica: Castoldi G, Core Curriculum Ematologia, McGrawHill, 2009 Castoldi - Liso, Malattie del sangue, McGrawHill, 2008 Corradini P, Manuale di Ematologia, Minerva,

3 Il materiale didattico verrà inserito nel sito Sezione DIDATTICA 3

4 CELLULE CD % nel midollo 0.05% nel sangue periferico % nel sangue cordonale 0.5-3% nel sangue periferico mobilizzato >> in condizioni patologiche (IM) LTR dopo terapia mieloablativa Proteina transmembrana Funzione non nota (adesione?) kd Altamente glicosilata 3 epitopi diversi (mab di tre classi) Varianti molecolari 4

5 VALUTAZIONE DEL SISTEMA EMOPOIETICO La valutazione morfologica del sistema emopoietico richiede i seguenti campioni: BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE CITOASPIRATO MIDOLLARE SANGUE PERIFERICO 5

6 video 6

7 7

8 BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE ASPIRATO MIDOLLARE Cellularità emopoietica Espressione delle diverse filiere emopoietiche Organismi intracellulari-granulomi Tesaurismosi Infiltrati linfocitari Infiltrati cellule non-emopoietiche Stroma ed osso Citomorfologia Reazioni citochimiche Reazione Perls Organismi intracellulari Tesaurociti Infiltrati linfocitari Infiltrati cellule non-emopoietiche 8

9 9

10 10

11 11

12 Trapianto di Cellule Staminali Ematopoietiche Obbiettivo - Ricostituzione di una normale funzione ematopoietica alterata da: - Patologia a carico della cellula staminale emopoietica - Occupazione del tessuto osseo da parte di malattia neoplastica - Controllo della patologia: - Controllo della crescita neoplastica - Immunoterapia 12

13 Modalità Somministrazione di una chemio-radioterapia mieloablativa avente lo scopo di: -Creare lo spazio midollare per l attecchimento del trapianto (++++Allo; + Auto) - determinare l immunosppressione necessaria per impedire il rigetto del trapianto (++++ Allo) - Eradicare il clone neoplastico (++ Allo; ++++ Auto) Infusione per via endovenosa delle CSE Assistenza e terapia di supporto nel periodo successivo al trapianto 13

14 TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE Autologo Singenico Allogenico Da donatore familiare Da donatore non familiare volontario (MUD) Aploidentico Mieloablativo Non-mieloablativo; regimi ad intensità ridotta; mini-allo 14

15 SORGENTI DI CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE Cellule midollari Cellule da sangue periferico [AUTO] Reclutamento con ciclofosfamide + G-CSF Sullo sblocco di un ciclo chemioterapico convenzionale/alte dosi sequenziali +G-CSF Cellule da sangue periferico [ALLO] Reclutamento con solo fattore di crescita (G-CSF) Cellule da sangue di cordone ombelicale [cellule espanse ex-vivo] 15

16 CLASSE II CLASSE III CLASSE I COMPL TNF- DP DQ DR HeatSP B C E A 16

17 * *= cromosoma 15 17

18 CARATTERISTICHE MHC I MHC II Composizione complesso MHCpeptide Tipo di APC Catena polimorfica, 2-MG, peptide Catene polimorfiche e, peptide Tutte le cellule nucleate APC professionali Cellule T responsive CD8+ (CTL) CD4+ (helper) Origine dei peptidi Proteine del cytosol Proteine dagli endosomi/ lisosomi (di orgine extracellulare) Sede di generazione del peptide proteasomi Endosomi / lisosomi Meccanismi di trasporto del peptide TAP Non necessari 18

19 Indicazioni al trapianto di cellule staminali emopoietiche Emopatie neoplastiche Emopatie non neoplastiche Difetti congeniti metabolismo Auto Allo/MUD convenz mini-allo CB Aploiden * * /+ Neoplasie solide + -/ M. autoimmuni + -/+ -/+ - - * futuribile: terapia genica 19

20 -196 C 20

21 21

22 22

23 Trapianto Autologo di Cellule Staminali Ematopoietiche di origine Midollare Raccolta - Agoaspirazioni multiple in anestesia generale a partire dalla cresta iliaca anteriore (1/3) e posteriore (2/3). - Raccogliere non meno di milioni di cellule nucleate/kg di peso corporeo - Filtrazione in sala operatoria per rimuovere microaggregati e spicule ossee. - Trasferimento in laboratorio per la manipolazione. 23

24 Trapianto Autologo di Cellule Staminali Ematopoietiche di origine Midollare Manipolazione in Laboratorio Deeritrocizzazione Deplasmazione Purging T-deplezione Selezione positiva e/o negativa Valutazione del contenuto in CD34+ Prove di vitalità Prove di clonogenicità Criopreservazione 24

25 Trapianto Autologo di Cellule Staminali Ematopoietiche di origine Midollare Criopreservazione - Deeritrocizzazione e concentrazione fino a 200 milioni /ml. - Risospensione in una soluzione di plasma omologo contenete il 10% di Dimetilsulfossido (DMSO crioprotettore). - Congelamento automatico a caduta controllata fino a 120 C. - Stoccaggio delle cellule a temperature di 190 C - - La permanenza in queste condizioni può durare fino ad >>10 anni 25

26 Trapianto Autologo di Cellule Staminali Ematopoietiche di origine Midollare Reinfusione Le cellule vengono scongelate in bagnomaria a C. Una volta scongelate devono essere reinfuse entro 30 minuti per evitare eccesso di mortalità cellulare. Prima dell infusione il paziente deve essere premedicato con cortisone perché il DMSO può indurre manifestazioni allergiche. L infusione avviene mediante filtro per evitare il passaggio di clumps formatisi per attivazione delle DNAasi derivante dalle cellule rotte. Durante l infusione è necessario monitorare attività cardiaca e respiratoria per scongiurare i rischi connessi con l infusione di DMSO soprattutto a dosi superiori ai 2 mg/kg. 26

27 Trapianto Autologo di Cellule Staminali Ematopoietiche di origine dal Sangue Periferico Vantaggi eliminazione del rischio anestesiologico riduzione del rischio di contaminazione neoplastica attecchimento rapido Svantaggi ipotetico rischio promuovente connesso alla somministrazione del G-CSF rischi trombotici legati alla procedura alla somministrazione del G-CSF 27

28 Trapianto Autologo di Cellule Staminali Ematopoietiche di origine dal Sangue Periferico Mediante procedura aferetica utilizzando separatori cellulari dopo: - Chemioterapia antiblastica: Modalità di raccolta I farmaci più mobilizzanti sono la Ciclofosfamide e l Etoposide. - Chemioterapia + Fattori di Crescita Emopoietici: Il G-CSF si è dimostrato il più efficace alla dose di 5-10 mcg/kg/di peso corporeo - Fattori di Crescita Emopoietici (allogenico e autologo) G-CSF alla dose di mcg/kg/di peso corporeo 28

29 Trapianto Autologo di Cellule Staminali Ematopoietiche di origine dal Sangue Periferico Modalità di raccolta Le raccolte iniziano quando nel sangue periferico sono presenti almeno 20 cellule CD34+/mcl e ciò avviene mediamente dopo: giorni dall inizio della chemioterapia 5-7 giorni dall inizio della somministrazione del G-CSF 29

30 Trapianto Autologo di Cellule Staminali Ematopoietiche di origine dal Sangue Periferico Modalità di raccolta - Al momento della raccolta il donatore deve avere almeno 30 di Hct (10 gr di Hb/dL) e Plt. - Se il donatore pesa meno di 25 kg la procedura deve essere innescata da una unità di GRC isogruppo irradiati e filtrati. - Le raccolte procedono fino a quando non siano state raccolte una quantità di cellule CD34+ sufficienti ad effettuare il programma trapiantologico e cioè almeno: 2,5 milioni/kg di peso corporeo per ogni procedura nell autologo 30

31 Trapianto Allogenico di Cellule Staminali Ematopoietiche da sangue placentare Vantaggi: Più rapida disponibilità del donatore Barriera immunologica immatura Minor incidenza di GVHD acuta e cronica Svantaggi: Ritardo nell attecchimento Ritardato recupero immunologico Ridotta disponibilità assoluta di progenitori CSE che ne condiziona l impiego nell adulto 31

32 Le fasi del trapianto autologo Regime di condizionamento Infusione di c. staminali Recupero della funzione emopoietica Recupero della funzione immunologica Aplasia -10/ >

33 Le fasi del trapianto allogenico Regime di condizionamento Infusione di c. staminali Recupero della funzione emopoietica Recupero della funzione immunologica Aplasia -10/ >+365 graft-failure GVHD acuta < +100 GVHD cronica >

34 Trapianto di Cellule Staminali Ematopoietiche Complicanze precoci Danni indotti dalla chemioterapia Complicanze infettive - Batteriche - Fungine - Virali - Protozoarie Malattia veno-occlusiva epatica agvhd Rigetto Cistite emorragica Complicanze polmonari 34

35 TOLLERANZA La tolleranza nel trapianto si definisce come l accettazione di cellule allogeniche nel contesto dell organismo ricevente, in assenza di terapia immunoppressiva continuativa 35

36 GVHD ACUTA Entro 100 gg dal TMO (..ma non sempre ) CRONICA Oltre il terzo mese 36

37 da J Ferrara et al. 37

38 GVHD acuta GRADO CUTE FEGATO INTESTINO + Rash maculopapulare, <25% ++ Rash maculopapulare, 25-50% Bilirubina, 2-3 mg/dl Bilirubina, 3-6 mg/dl +++ Eritroderma generalizzato Bilirubina, 6-15 mg/dl ++++ Desquamazione e bolle Bilirubina, >15 mg/dl Diarrea ml/die oppure Nausea persistente Diarrea, ml/die Diarrea, >1500 ml/die Dolore addominale e/o ileo paralitico 38

39 GvHD ACUTA CUTE Clinica Eritema maculopapulare + prurito o bruciore, con evoluzione in bolle Istologia Vacuolizzazione cellule basali Apoptosi dei cheratinociti Bolle alla giunzione dermoepidermica Distacco dell epidermide 39

40 GvHD ACUTA GASTROINTESTINALE Clinica Nausea, vomito Diarrea acquosa e mucosa + sangue, + dolore, fino all ileo paralitico Istologia Singole apoptosi nelle cripte Distruzione di singole cripte Ulcerazioni focali Denudazione completa della mucosa 40

41 GvHD ACUTA FEGATO Clinica Colestasi ( bilirubina, ALP, GGT) Citolisi ( Transaminasi) VOD Istologia Ingrandimento e pleomorfismo nucleare, picnosi nucleare e perdita di nuclei; singole cellule apoptotiche. Dedriti cellulari nel lume dei dotti biliari. Piccoli linfociti negli spazi portali e soprattutto nell epitelio dei dotti bilari. Colestasi generalmente presente 41

42 GvHD CRONICA Aspetti clinici Immunodeficienza combinata umorale e cellulare (la causa + frequente di morte sono le infezioni). Compromissione della qualità di vita. Correlazione con GVL. Istopatologia Danno cellulare epiteliale Infiltrato cellulare mononucleare Fibrosi Ipocellularità e atrofia del sistema linfoide 42

43 GvHD CRONICA Mucosa Orale: atrofia, eritema, lesioni lichenoidi, slerodermia, contratture articolari. Occhio: cheratocongiuntivite sicca, congiuntivite emorragica, formazione di pseudomembrane, lagoftalmo. Polmone: malattia polmonare ostruttiva, dispnea, tosse cronica, bronchiolite obliterante. App.Gastrointestinale: disfagia, odinofagia, dismotilità esofagea, perdita di peso. Fegato: iperbilirubinemia, ipetrtensione portale, cirrosi, insufficienza epatica. App. Neuromuscolare: dolore neuropatico, crampi muscolari, polimiositi Miscellanee: m. autoimmuni ( S. Sjogren, SLE, cirrosi biliare primitiva, artrite reumatoide, lichen planus) 43

44 GvHD CRONICA 44

45 GVHD GVL GRAFT HOST HVG --> rejection 45

46 46

47 Tecniche per lo studio del chimerismo Cariotipo VNTR STR SNP 47

48 CHIMERISMO FISH XY 48

49 STR CHIMERISMO Patient Donor Mixed chimerism at +30 (PB) Mixed chimerism at +30 (CD3 + ) Full chimerism at +60 (PB) Full chimerism at +60 (CD3 + ) 49