PROGETTO DI TRACCIABILITÀ

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1 Ricerca Argomento e innovazione Fabio Nonino ERSA - Servizio fitosanitario, chimico-agrario, analisi e certificazione Laboratorio di biotecnologie PROGETTO DI TRACCIABILITÀ DEL FRUMENTO TENERO 1 Lo scopo del presente lavoro è stato la caratterizzazione genetica delle varietà coltivate di frumento tenero, attraverso l uso di marcatori molecolari (microsatelliti), per arrivare a identificare le varietà di forza. L identificazione varietale rientra nel Programma Interregionale Agricoltura-Qualità-Ambiente Sottoprogetto filiera frumento (Attuazione progetti interregionali di cui alla Legge 499/1999). L obiettivo del progetto è la valorizzazione della coltivazione del frumento tenero, attraverso la coltivazione di varietà selezionate per la produzione di farina di qualità, particolarmente adatte per la panificazione (frumenti panificabili, panificabili superiore e di forza). Tale progetto prevede, inoltre, la costituzione di una filiera produttiva del frumento, garantita da un sistema di tracciabilità, e la caratterizzazione genetica delle varietà di interesse e delle relative produzioni. 1 Frumento Tab.1 Varietà di frumento analizzate. ID: numero che identifica il campione Varietà di frumento ID camp. Varietà di frumento ID camp. A Craklin 1911 Abate 8003 Dekan 1735 Africa 8004 Delfino 1912 Agadir 1907 Eureka 1897 Albachiara 8005 Generale 8013 Alcione 1908 Geppetto 8014 Anapo 8006 Guadalupe 1896 Apache 8007 Guarni 1904 Artico 1910 Isengrain 1900 Aster 8008 Kalango 8015 Aubusson 8009 Levis 1894 Avorio 8010 Ludwig 1733 Bilancia 1909 Mieti 1901 Bisquit 1913 Nearco 1899 Blasco 1914 Palesio Bokaro 8011 PR22R Bolero 1905 Provinciale 1898 Bologna 6444 Ravenna 1895 Bramante 8012 Renan 1732 Buon pastore 1903 Sagittario 1891 Capo 1736 Salvia 1893 Centro 1902 Saturnus 1734 Chinese spreng 1777 Serpico 8017 Collerosso 1906 Vittorio 8018 VTA In questo lavoro sono state analizzate 49 varietà di frumento tenero (Tab. 1). Delle varietà coltivate si è considerato in modo particolare quelle di forza italiane (BOLO- GNA, PALESIO) e austriache (RENAN, LUD- WIG, SATURNUS, DEKAN, CAPO). Prima di riportare i risultati diamo delle definizioni. DEFINIZIONI Genoma o patrimonio genetico è l insieme dei geni presente in ogni organismo vivente contenenti tutta l informazione necessaria per la costruzione dell organismo stesso (Fig.1). Il genoma risiede nel nucleo della cellula ed è rappresentato da un numero minimo (x) di cromosomi. Ogni cromosoma, quando è in forma condensata, è visibile ed è costituito da due cromatidi che sono tenuti assieme in un unico punto chiamato centromero. Ciascun cromatidio è costituito da un filamento di DNA. L informazione genetica risiede nella molecola di acido desossiribonucleico o DNA e in particolare nella sua se-

2 56 Fig.1 Rappresentazione delle sequenze nucleotidiche che costituiscono il DNA quenza nucleotidica; quest ultima è costitutia da Adenina (A), Timina (T), Citosina (C), Guanidina (G) dette anche basi azotate. Ci sono regioni del DNA codificanti e altre non codificanti. Nelle codificanti sono presenti i geni, cioè le sequenze nucleotidiche che portano alla formazione di proteine e quindi del carattere (= espressione del gene). In quelle non codificanti non sono presenti geni. Entrambi i tipi di regioni possono essere studiate per individuare delle differenze tra DNA. Marcatore Molecolare evidenzia le differenze tra due genomi, in termini di lunghezza (paia di basi) di regioni (del DNA) dalle estremità conosciute, o di presenza/assenza di una sequenza nota. I marcatori molecolari, quindi, rilevano direttamente differenze nella sequenza nucleotidica di regioni del Dna e questa loro caratteristica vale per qualsiasi parte del genoma (codificante e non); inoltre non subiscono interferenze da parte dell ambiente. I marcatori molecolari permettono la caratterizzazione genetica dell individuo o dalla varietà o delle popolazioni perché sono capaci di rilevare differenze (polimorfismo), anche tra individui geneticamente molto simili. In biologia molecolare, si definisce impronta genetica (o fingerprint, o fingerprinting genetico) il profilo derivato dalla applicazione di determinati marcatori molecolari ad un genoma, al fine di renderlo riconoscibile e rintracciabile. In genetica agraria, si può ricorrere alla caratterizzazione genetica per certificare la varietà/clone (in associazione con analisi del fenotipo), per risolvere casi di sinonimia, per verificare il successo di un impollinazione controllata, o la presenza di un elemento a base genetica nota. Microsatelliti o semplici-sequenze-ripetute (SSRs), sono dei marcatori molecolari costituiti da brevi sequenze nucleotidiche elementari (es.atatat) ripetute in tandem e sono distribuite casualmente nel genoma degli eucarioti, specialmente in zone con minor concentrazione di geni. Tali sequenze sono variabili sia nel numero di volte che vengono ripetute, sia nel motivo di basi nucleotidiche che le costituiscono. In particolare ogni microsatellite può avere diverse forme chiamate Alleli; ogni allele si misura in termini di lunghezza della sequenza nucleotidica (numero di basi) considerata o di presenza/assenza della sequenza. Il Polimorfismo di un microsatellite è dato dall insieme dei suoi alleli. A causa del loro alto tasso di mutazione, sono dei marcatori molecolari con il più elevato polimorfismo. Questa loro caratteristica ha fatto si che i microsatelliti vengano utilizzati come marcatori molecolari per la caratterizzazione genetica (finger-

3 Tab.2 Microsatelliti utilizzati per la caratterizzazione genetica delle 49 varietà di frumento: i primers identificano le regioni del DNA in cui sono presenti i microsatelliti print), per la mappatura del genoma, per gli studi dei rapporti filogenetici e genetici, per lo studio della genetica di popolazione. I microsatelliti, inoltre, presentano una riproducibilità ed accessibilità anche ai laboratori che difettano di apparecchiatura altamente specializzata di analisi. Differenti specie di piante quale la soia, riso, mais, uva, frumento, seme di ravizzone, kiwifruit, fagiolo comune, pino, cece, lattuga ed altri, sono state studiate con i microsatelliti. Frumento tenero è una specie alloesaploide cioè è costituito da tre diversi genomi chiamati A,B,D; ogni genoma presenta un numero base (x) di cromosomi pari a 7 (es.a = 7) e ogni cromosoma è presente in doppio (AA=14). Il frumento tenero, quindi, ha in totale 42 cromosomi (AA 14 + BB 14 + DD 14 cioè 2n = 42) così indicati: AABBDD. Il frumento nasce dall unione (si parla di ibridazione) tra due specie Triticum turgidum (2n=28, AABB), a cui appartiene anche il frumento duro, e il Triticum tauschii (2n=14, DD). Attualmente gran parte dei microsatelliti individuati sono presenti nel genoma B e in parte nel D. primers Xgwm95-2A Xgwm155-3A Xgwm458-ID Xgwm3-3D Xgwm437-7D Xgwm325-6D Xgwm513-4B Xgwm413-IB Xgwm539-2D Xgwm408-5B Xgwm46-7B XgwmI90-5D Xgwm261-2D microsatellite (AC)16 (CT)19 (CA)13 (CA)18 (CT)24 (CT)16 (CA)12 (CA)18 (GA)27 (CA)>22(TA)(CA)7(TA)9 (GA)2GC(GA)33 (CT)22 (CT)21 MATERIALI E METODI Il processo di analisi si è basato sull uso della tecnica della PCR (Reazione a catena della polimerasi) e sull analisi dei relativi frammenti di DNA amplificati (Fragment analysis), mediante l utilizzo di 13 coppie di primers Xgwm (Tab.2) marcati con un fluoroforo (cioe una sostanza che in determinate condizioni emette fluorescenza, rendendosi visibile); quest ultimo può emettere una luce fluorescente di colore o verde o rosso o blue o gialla. Ogni coppia di primers individua la regione del Dna in cui è presente il relativo microsatellite e il suo fluoroforo associato permette di visualizzare i relativi prodotti PCR nella corsa elettroforetica della Fragment analysis. Per ogni microsatellite si è elaborato l indice di PIC (Polymorphic information content), che stima il grado di polimorfismo ottenuto, tiene conto del n di alleli prodotti e della loro relativa frequenza allelica: un valore di PIC maggiore di 0,50 é buono. Nella Tabella 3 vengono riassunti i microsatelliti con i relativi alleli trovati e ordinati in modo decrescente all interno del gruppo in base all indice di PIC. Ogni singola varietà è stata individuata da 13 microsatelliti in modo univoco, i quali costituiscono l impronta digitale della stessa (fingerprint). In particolare si è visto che di questi 13 solo 5 sono sufficienti per differenziare tutte le 49 varietà. Nella Tabella 4 viene riportato il profilo degli Alleli relativi a questi 5 microsatelliti (Xgwm 539-2D, Xgwm 413-1B, Xgwm 190-5D, Xgwm 46-7B, Xgwm 325-6D) per tutte le varietà: ogni coppia di primers identifica un microsatellite il quale presenta diverse forme alleliche tipiche di quella varietà. Il nome della coppia di primers coincide con il nome del microsatellite. Gli Alleli sono misurati in bp (paia di basi). Nella tabella 4, inoltre, a ogni varietà corrisponde un colore che individua i microsatelliti da utilizzare per discriminarla da tutte le altre: ad esempio è sufficiente solo il microsatellite Xgwm 539-2D per discriminare 13 varietà tra cui Bologna, Palesio. Tab.3 Polimorfismo osservato per ogni microsatellite microsatellite T a alleli dimensione alleli (bt) PIC Xgwm539-2D , 122, 124,128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 146, 149, 151, 162, 164 0,809 Xgwm46-7B , 160, 164, 170, 172, 176, 178, 180, 184, 186 0,756 Xgwm408-5B , 170, 174, 176, 178, 180, 182, 186, 188, 192, 194, 198, 200 0,753 Xgwm325-6D , 133, 135, 137, 139, 141, 143 0,735 Xgwm261-2D , 172, 190, 192, 194, 200 0,710 Xgwm513-4B , 138, 140, 142, 145, 147, 149 0,722 Xgwm413-1B , 88, 90, 94, 104, 106 0,673 Xgwm190-5D , 203, 207,209, 211, 213 0,654 Xgwm437-7D , 99, 101, 103, 105, 106, 108, 112, 115, 116, 118, 120 0,752 Xgwm95-2A , 110, 118, 120, 122, 123 0,652 Xgwm155-3A , 136, 139, 141, 143, 145, 147 0,570 Xgwm3-3D , 75, 77, 81 0,556 Xgwm458-1D , 109, 111 0,493

4 58 Tab.4 Microsatelliti discriminanti. Ogni varietà è identificata, in modo univoco, dagli alleli dei 5 microsatelliti. Il profilo degli alleli di ogni varietà è unico. A ogni varietà corrisponde un colore che indica quali microsatelliti, dei cinque considerati, servono per discriminarla da tutte le altre

5 Fig.2 Eletroferogramma che riporta il profilo genetico del frumento Bologna ottenuto utilizzando i 5 microsatelliti (Xgwm 539-2D, Xgwm 413-1B, Xgwm 190-5D, Xgwm 46-7B, Xgwm 325-6D) Profilo genetico della varietà Bologna: alleli 124, 86, 207, 176, 137 CONCLUSIONI L uso dei microsatelliti, nel presente lavoro, ha permesso di mettere a punto una protocollo di analisi per l identificazione varietale mediante marcatori molecolari: caratterizzazione genetica (Fingerprint). Il protocollo prevede l uso della PCR, dei primers marcati con fluorofori, e la Fragment analysis. Utilizzando solo 5 microsatelliti è stato possibile riconoscere geneticamente in modo univoco tutte le 49 varietà di frumento tenero oggetto di studio in particolare quelle di forza: RENAN, LUDWIG, SATURNUS, DEKAN, CAPO, BOLOGNA e PALESIO. Il metodo ora prevede che le PCR siano effettuate singolarmente per ogni microsatellite per un totale di 5 PCR e 5 Fragment analysis. Il successivo obiettivo sarà la messa a punto di un unica PCR MULTIPLEX operante alle stesse condizioni in modo tale da abbattere tempi e costi del lavoro d analisi. È previsto, inoltre, l aggiornamento dell elenco delle varietà di frumento oggetto d analisi. Il presente lavoro si colloca nel campo della ricerca applicata all agricoltura. L identificazione varietale è applicabile in questo caso alla filiera del frumento, in quanto dà la possibilità di poter individuare e certificare la produzione proveniente da quelle varietà adatte, nel nostro aerale, alla panificazione. Bibliografia Marion S. Röder et al.: A Microsatellite Map of Wheat. Genetics 149: (August 1998) A. Pasqualone, C. Lotti, A. Bianco: Identification of durum wheat cultivars and monovarietal semolinnas by analysis of DNA microsatellates. Eur Food REs Technol (1999) 210: X. Y. Zhang, C. W. Li, L. F. Wang, H. M. Wang, G. X. You, Y. S. Dong: An estimation of the minimun number of SSR alleles needed to reveal genetic relationships in wheat varieties. Theor Appl Genet (2002) 106: M. Signor, E. Nazzi, S. Candotti: Varietà di frumento provenienti dall Austria e Italia a confronto. Notiziario ERSA 2005 n 2: M. Bertolami, G. Tassan Mazzocco, F. Miceli: Qualità panificatoria in varietà di frumento tenero coltivate in Friuli. Notiziario ERSA 1996 n 6: 18-20;