DNA. mrna. red = proteins black = events. in eukaryotes pre-mrnas = hnrna. in prokaryotes. trna X SOME. spliceosomal proteins. Assembling SPLICEOSOME

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Stefania Vigano
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1 spliceosomal proteins Assembling SPLICEOSOME + snrnas in eukaryotes pre-mrnas = hnrna capping & tailing proteins DNA + RNA-Pol & Transcript. factors & regulatory proteins pre-trnas pre-rrnas + RNAases & modifying enzymes in prokaryotes Processing Transcription a.a.-trnasynthetases + trnas rrnas + ribosomal proteins mrna Charging AssemblingRIBO- SOME Translation polypeptides + modifying enzymes trna X Folding, Modifying Proteins Assembling Structural, metabolism, signaling, etc. blue = RNAs red = proteins black = events

2 La regolazione nei procarioti I geni batterici sono tipicamente raggruppati in operoni, in cui più geni si susseguono l un l altro preceduti da un unico promotore e trascritti insieme in un unico RNA policistronico. Il primo operone di cui è stata studiata la regolazione a livello molecolare è l operone del lattosio di Escherichia coli. Esso consiste di tre geni (LacZ, LacY, LacA) posti di seguito, sotto il controllo di un unico promotore, i quali codificano tre proteine coinvolte nel metabolismo del lattosio: la β-galattosidasi, una permeasi e una transacetilasi. La permeasi facilita l ingresso del lattosio nella cellula, la β- galattosidasi catalizza la scissione del lattosio in galattosio e glucosio, che poi intraprendono la loro via metabolica, la transacetilasi ha una funzione a tutt oggi non chiara. I tre geni sono preceduti da un promotore inducibile (che cioè permette la trascrizione dell operone soltanto in risposta ad opportuni stimoli ambientali in questo caso la presenza del lattosio). Nella regolazione della trascrizione di questo operone sono implicate due proteine regolatrici, il lac-repressor (codificato dal gene LacI) e la camp-receptor-protein CRP (codificata dal gene crp) detta anche CAP (catabolite activator protein).

3 β-galactosidase + H Following the β-galactosidase Reaction. The galactoside substrate X-Gal produces a colored product on cleavage by β-galactosidase. The appearance of this colored product provides a convenient means for monitoring the amount of the enzyme both in vitro and in vivo.

4 I = lac-repressor Z = β-galactosidase Y = Permease A = Transacetylase

5 The DNA footprinting technique. (A) This technique requires a DNA molecule that has been labeled at one end. The protein shown binds tightly to a specific DNA sequence that is seven nucleotides long, thereby protecting these seven nucleotides from the cleaving agent. If the same reaction were performed without the DNAbinding protein, a complete ladder of bands would be seen on the gel (not shown). (B) An actual footprint used to determine the binding site for a human protein that stimulates the transcription of specific eucaryotic genes. These results locate the binding site about 60 nucleotides upstream from the start site for RNA synthesis. The cleaving agent was a small, iron-containing organic molecule that normally cuts at every phosphodiester bond with nearly equal frequency.

Negative control of the lac operon The i gene encodes a repressor which, in the absence of lactose (top), binds to the operator (o) and blocks transcription of the three structural genes (z,

7 Negative control of the lac operon The i gene encodes a repressor which, in the absence of lactose (top), binds to the operator (o) and blocks transcription of the three structural genes (z, β-galactosidase; y, permease; and a, transacetylase). Lactose induces expression of the operon by binding to the repressor (bottom), which prevents the repressor from binding to the operator. P = promoter; Pol = polymerase. +1 The nearly palindromic operator sequence

M Complex of both DNA fragments with the repressor protein Complex of the longer DNA fragment with the repressor protein Longer DNA fragment containing the primary operator binding site for the lac

8 M Complex of both DNA fragments with the repressor protein Complex of the longer DNA fragment with the repressor protein Longer DNA fragment containing the primary operator binding site for the lac repressor Shorter DNA fragment containing the secondary operator binding site for the lac repressor Increasing amounts of repressor Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) M: corsia dei marcatori, vari frammenti di DNA di lunghezze note che servono da riferimento per i frammenti allo studio

Cyclic AMP then binds to the catabolite activator protein (CAP) and stimulates its binding to regulatory

9 Positive control of the lac operon by glucose Low levels of glucose activate adenylyl cyclase, which converts ATP to cyclic AMP (camp). Cyclic AMP then binds to the catabolite activator protein (CAP) and stimulates its binding to regulatory sequences of various operons concerned with the metabolism of alternative sugars, such as lactose. CAP interacts with the a subunit of RNA polymerase to activate transcription.

11 L operone del triptofano La regolazione dell operone del triptofano (che contiene i geni per cinque enzimi necessari alla biosintesi di questo amminoacido) è basata su due meccanismi: il primo implica la presenza di una proteina repressore che viene attivata solo dalla presenza di triptofano, con cui interagisce in modo utile a legarsi alla sequenza bersaglio sul promotore dell operone bloccando la trascrizione, Il secondo meccanismo (l attenuazione) è esclusivo dei procarioti in quanto opera in modo concertato tra trascrizione e traduzione (vedi oltre).

13 The binding of tryptophan to the tryptophan repressor protein changes the conformation of the repressor. The conformational change enables this gene regulatory protein to bind tightly to a specific DNA sequence (the operator), thereby blocking transcription of the genes encoding the enzymes required to produce tryptophan (the trp operon). The threedimensional structure of this bacterial helix-turn-helix protein, as determined by x- ray diffraction with and without tryptophan bound, is illustrated. Tryptophan binding increases the distance between the two recognition helices in the homodimer, allowing the repressor to fit snugly on the operator.

Under these conditions, the mrna regions designated 3 and 4 hybridize to form a stemloop structure that signals the termination of transcription.

14 Mechanism of transcriptional attenuation The trp mrna is translated while still being synthesized. In the presence of high levels of tryptophan, the ribosomes proceed along the message slightly behind the site of transcription. Under these conditions, the mrna regions designated 3 and 4 hybridize to form a stemloop structure that signals the termination of transcription. In the presence of low levels of tryptophan, however, the ribosomes stall at region 1 of the mrna, which contains two adjacent codons for tryptophan. In this case, since region 2 is not bound to a ribosome, it is free to form an alternative stem-loop structure by hybridizing to region 3. This hybridization prevents formation of the 3 4 stem loop, and transcription is able to continue past the attenuator sequence.

15 Leader peptide for attenuation of Trp operon Leader peptides for attenuation of Thr, Phe and His operons

16 Il batteriofago λ E un batteriofago che infetta Escherichia coli. E costituito dal genoma di DNA lineare a doppio filamento lungo circa paia di basi avvolto dentro un capside proteico su cui è innestata una coda, le cui proteine terminali servono a riconoscere la membrana della cellula infettabile al cui interno inietta il suo DNA, che subito dopo assume la forma circolare covalentemente chiusa. Successivamente, a seconda delle condizioni della cellula infetta può adire al ciclo litico, che porta alla produzione di numerose particelle fagiche figlie che si liberano all esterno provocando la lisi del batterio, oppure può adire al ciclo lisogeno, in cui il suo genoma si integra in quello del batterio e rimane quiescente per un numero indefinito di replicazioni batteriche, per poi deintegrarsi in risposta a determinate condizioni ambientali e riprendere il ciclo litico.

17 La doppia vita del batteriofago λ

19 t R t L sib About 10 less well known genes

20 Il primo evento dopo l infezione, ovvero l iniezione del DNA fagico nella cellula di E. coli, è la circolarizzazione del genoma mediante i terminali cos (cohesive ends).

21 I primi geni trascritti sono N e cro. La proteina N è un antiterminatore che consente all RNA polimerasi batterica di ignorare i segnali di terminazione t l, t r1 e t r2, e di esprimere anche le proteine CII, O, P, Q, CIII, xis e int.

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