Tesi di Laurea Triennale Anna Pezzutto
Glicoproteine transmembrana eterodimeriche (α/β) 18 subunitàαe 8 β che si possono assemblare in 24 diversi eterodimeri Mediano interazioni cellula-cellula e cellula-matrice ancorandosi internamente al citoscheletro Trasducono numerose vie di segnalazione RECETTORI INTEGRINICI Ruolo chiave in vari processi fisiologici e patologici mediando fenomeni cellulari quali l adesione, la migrazione e vasculo-/ angio- genesi Il legame al ligando dipende da: stato conformazionale esteso (attivo) o genuflesso (inattivo) presenza di cationi divalenti (Ca 2+, Mg 2+ Mn 2+ ) Sequenze consenso lineari basate su Acido Aspartico o Acido Glutammico legano la maggior parte delle integrine
INTEGRINA α 4 β 1 (VLA-4) Eterodimero composto dalla subunitàα 4 (155 kda) e dallasubunitàβ 1 (150 kda) Pattern di espressione prevalentemente leucocitario Coinvolta in: trafficking leucocitario adesione emigrazione cellulare in vivo sviluppo di malattie infiammatorie ed autoimmunitarie sviluppo di metastasi ruolo emergente nell angiogenesi Principali ligandi: VCAM-1 e Fibronectina (splicing variant) SEGMENTO CS1 (25 aa) DELPLVTLPHPNLHGPEILDVPST PEPTIDE CS1 (8 aa) EILDVPST α 4 β 1 riconosce e lega il motivo LDV localizzato nel Connecting Segment 1 (CS-1) derivante da splicing alternativo del connecting segment di tipo III (IIICS) della Fibronectina
EMILIN1 Elastin Microfibril Interface Located protein Glicoproteina non collagenica della matrice extracellulare del peso molecolare di 115 kda Espressa abbondantemente nei tessuti ricchi di elastina (vasi sanguigni, tessuti connettivi, pelle, cuore, polmoni, milza, rene) Elastogenesie mantenimento della morfologia delle cellule del tessuto vascolare (Zanetti et al, 2004); coinvolgimento nella struttura e funzione dei vasi linfatici(danussi et al, 2008) Omeostasi della pressione sanguigna: regolazione della maturazione del TGF-β (Zacchigna et al, 2006) Trimerizzazione di EMILINA1 (Mongiat et al,2000); adesione, migrazione e proliferazione cellulari mediate dall integrinaα 4 β 1 (Spessotto et al, 2003; Spessotto, Danussi et al, 2006 e 2011)
IL DOMINIO gc1q DI EMILINA1 Funzione Struttura Organizzazione omotrimerica Localizzazione C-terminale 151 (anziché140) residui aa 9(anziché 10) β-strand La presenza di un loop flessibile, non strutturato, risultante da un inserzione di 10 aa unica di EMILINA1 e 2, localizzato all apice del trimero a monte dello strand mancante Tra i membri della superfamiglia C1q-TNF, il gc1q di EMILINA1 (e di EMILINA 2) è l unico capace di interagire con l integrina α 4 β 1 L interazione è efficiente: basse concentrazioni di ligando forte adesione e migrazione cellulare
IL DOMINIO gc1q DI EMILINA1 Interazioni con l integrina α 4 β 1 Usando un approccio di mutagenesi diretta è stato dimostrato che il sito di legame ad α 4 β 1 è localizzato a livello del loop flessibile (Y927-G945) DI INTERAZIONE all apice della CON struttura α 4 βtrimerica 1 : e che è assolutamente dipendente dal residuo E933 INEDITA MODALITA DI INTERAZIONE CON Per la prima volta viene riportato un sito di legame per l integrina su un complesso omotrimerico Legame integrinico più complesso rispetto ai canonici peptidi lineari contenenti sequenze consenso L utilizzo di sistemi batterici bicistronici ha permesso di dimostrare che l interazione tra EMILINA1 e integrina α 4 β 1 necessita la presenza di tre specifici residui di Acido Glutammico (E933) del trimero, uno per ciascun monomero (Verdone et al, 2008)
SCOPO DELLA TESI Comprendere i meccanismi molecolari e gli effetti biologici dell'interazione tra EMILINA1e il recettore cellulare integrinico α 4 β 1 utilizzando come termine di confrontoil peptide CS1 della fibronectina,un ben noto interattore del medesimo recettore. Il lavoro di tesi è organizzato in due parti principali: 1.Generazione di molecole chimeriche del dominio gc1q di EMILINA1e analisi dellastechiometria di legame 2.Caratterizzazione degli effetti specifici dell'interazione tra C1q di EMILINA1e l'integrina α 4 β 1 in fenomeni biologici quali adesione, migrazione e formazione di tubuli in vitro, paragonandoli a quelli osservabili utilizzando il frammento CS1
GENERAZIONE DI CHIMERE gc1q -CS1 CS1-BSA COUPLING: 1:3/1:10 peso:peso APPROCCIO MOLECOLARE: +
GENERAZIONE DI CHIMERE gc1q -CS1 Dominio chimerico C1q -CS1.25 Dominio chimerico C1q CS1.8 SDS PAGE 4-20% frammento CS1.25 frammento CS1.8 POSSIBILI VANTAGGI Superamento dei problemi di stechiometria incontrati Possibilità di testare l intera sequenza CS1 Opportunità di confrontare proteine con un backbone identico POSSIBILI SVANTAGGI Le proteine chimeriche potrebbero presentare un folding scorretto/inatteso
VALUTAZIONE DEL FOLDING PROTEICO CURVE DI MELTING SDS FREE 12% PAGE Dominio C1q - CS1.25 Dominio C1q CS1.8 L inserimentodi CS1.25e CS1.8nel backbonec1q di EMILINA1, non alteranéfoldingnéstabilitàtermica del gc1q wt; tutti i domini chimerici vengono riconosciuti dalle immunoglobuline impiegate SDS FREE 12% PAGE si trovano nella conformazione SAGGIO spaziale ELISA corretta;possono quindi essere considerati molecole idealiper esperimenti in cui si vogliano confrontarele 556 Ab policlonale (40 caratteristiche ng/well) di legame all integrina α 4 β 1 da parte del gc1q e del CS1 1H2G8 Ab monoclonale (0,5 µg/well)
VALUTAZIONE DELL INTERAZIONE DEI DOMINI CHIMERICI CON L INTEGRINA L α 4 β 1 gc1q CS1.25 SAGGIO CAFCA CON CELLULE JURKAT Forte adesione C1q wt mediata Perdita di capacità adesiva della chimera CS1.25 mutata in D Differenza molare tra chimera CS1 e molecola BSA-CS1 gc1q CS1.8 Forte adesione C1q wt mediata Alcuna differenza riscontrata tra l isoforma wt e mutata della chimera CS1.8
SCOPO DELLA TESI Comprendere i meccanismi molecolari e gli effetti biologici dell'interazione tra EMILINA1e il recettore cellulare integrinico α 4 β 1 utilizzando come termine di confrontoil peptide CS1 della fibronectina,un ben noto interattore del medesimo recettore. Il lavoro di tesi è organizzato in due parti principali: 1.Generazione di molecole chimeriche del dominio gc1q di EMILINA1e analisi della stechiometria di legame 2.Caratterizzazione degli effetti specifici dell'interazione tra C1q di EMILINA1 e l'integrina α 4 β 1 in fenomeni biologici quali adesione, migrazione e formazione di tubuli in vitro, paragonandoli a quelli osservabili utilizzando il frammento CS1
RISPOSTE DI CELLULE H-END H E HUVEC CONSEGUENTI ALL INTERAZIONE TRA α 4 β 1 E DOMINI gc1q CS1.25 PERCHE UN MODELLO BASATO SU CELLULE ENDOTELIALI? Studi recenti hanno descritto il ruolo emergente dell interazione α 4 β 1 -VCAM-1/FN nella maturazione dei vasi sanguigni e nella neoangiogenesi. Abbiamo considerato l ipotesi che interazioni tra EMILINA1/CS1 e α 4 β 1 possano essere coinvolte nella neoangiogenesi con meccanismi simili Analisi FACS di cellule H-END 73 e HUVEC CELLULE H-END 73 Livelli di espressione opposti per le due linee cellulari: CELLULE HUVEC M1 M1 Marker % Gated Median All 100.00 340.00 M1 78.28 356.00 L espressione dell integrina α 4 β 1 in cellule endoteliali dipende apparentemente dalla loro origine, è variabile e instabile, legata alla fase di crescita e alla vitalità cellulari Marker % Gated Median All 100.00 241.00 M1 0.60 490.00
RISPOSTE DI CELLULE H-END 73 CONSEGUENTI ALL INTERAZIONE TRA α4β1 E DOMINI gc1q CS1.25 SAGGI DI TUBULIGENESI IN VITRO Le cellule endoteliali H-END 73 sono state cresciute su un coating di MATRIGEL, e sono stati aggiunti vari stimoli alla concentrazione di 10 µg/ml (C1q WT di EMILINA1, C1q Del(L932-G945) di EMILINA1, chimera C1q-CS1.25 WT o mutato)
RISPOSTE DI CELLULE H-END 73 CONSEGUENTI ALL INTERAZIONE TRA α4β1 E DOMINI gc1q CS1.25 SAGGI DI TUBULIGENESI IN VITRO Le cellule trattate con tutti gli stimoli a disposizione non hanno mostrato alcuna variazione per quanto riguarda la spontanea formazione di tubuli al pari di quanto avviene per il controllo negativo Ciò suggerisce che l interazione dell integrina α4β1 con tutti i ligandi testati non interferisce nei fenomeni di tubuligenesi in vitro
Le cellule endoteliali H- END 73 sono state incubate in terreno senza siero contente diversi stimoli alla concentrazione di 10 µg/ml (C1q WT di EMILINA1, C1q Del(L932- G945) di EMILINA1, chimera C1q- CS1.25 WT o mutato) e monitorate per 24 ore. SAGGI DI WOUND HEALING
CONCLUSIONI E possibile mutagenizzare il dominio gc1q di EMILINA1 sostituendo il loop destrutturato senza alterare le caratteristiche strutturali e funzionali del backbone trimerico In esperimenti di adesione il dominio gc1q di EMILINA1 è in grado di legare cellule Jurkat con efficienza fino a 10 3 superiore rispetto al CS1 Con le H-END 73, pur esprimenti l integrina α 4 β 1 non è stato possibile ottenere adesione né tantomeno effetti in saggi funzionali quali tubuligenesi e riparo di ferite MANCATA INTERAZIONE che potrebbe essere spiegata con: una scarsa o nulla attivazione dell integrina stessa in questo tipo cellulare una bassa espressione dell integrina su questa linea rispetto alle cellule Jurkat una combinazione dei due fattori
PROSPETTIVE FUTURE Futuri esperimenti utilizzando saggi con cellule endoteliali in un contesto più fisiologico, quali ad esempio quelli su tessuto aortico ex vivo (aortic ring assay), potranno aiutare a superare le difficoltà incontrate e a chiarire un eventuale ruolo specifico del dominio gc1q nei processi di sviluppo e maturazione vasali.
GENERAZIONE DI ETEROTRIMERI DEL TIPO gc1q Del(L932-G945) -CS1.25 WT / MUT PURIFICAZIONE Ni -NTA La composizione del trimero gc1q di EMILINA1 èstata alterata preparando eterotrimericon diversi monomeri gc1qdel(l932- G945) e gc1q-cs1 WT o mutato. Per questo èstato usato un sistema batterico bicistronico L HIS-TAGfuso al mutante permette la purificazione selettiva dei trimeri contenenti almeno un monomero gc1q deleto SAGGIO CAFCA CON CELLULE JURKAT 3 HIS 2 HIS 1 HIS His-C1q Del / C1q-CS1.25 WT His-C1q Del / C1q-CS1.25 mutato SDS PAGE 4 20 % Solo uno dei tre frammenti CS1 va a fornire la sequenza lineare attiva per il legame ad un unica molecola integrinica
RISPOSTE DI CELLULE H-END H 73 CONSEGUENTI ALL INTERAZIONE TRA α 4 β 1 E DOMINI gc1q CS1.25 SAGGIO CAFCA CON CELLULE H-END 73 Le cellule H-END 73 non presentano alcuna capacità di adesione in presenza di tutte le forme saggiate del dominio gc1q, nemmeno per il trimero nativo wild type La fibronectina, usata come controllo positivo, è, invece, capace di fornire un alta percentuale di legame per le H-END 73 fino a concentrazioni ridotte (1,1 µg/ml)