NEUROSCIENCE INSTITUTE CAVALIERI OTTOLENGHI Regione Gonzole, 10 10043 Orbassano (Turin) Italy Progetti relativi all Atrofia Muscolare Spinale e ai traumi del midollo spinale, in corso di studio presso il Laboratorio di Sviluppo e patologia del cervello del Prof. Vercelli ATROFIA MUSCOLARE SPINALE Da alcuni anni, presso il Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi di Orbassano (TO), il gruppo del Prof. Vercelli sta studiando l Atrofia Muscolare Spinale (SMA) utilizzando un modello sperimentale murino della malattia (SMA di tipo II), al fine di indagare i meccanismi di morte neuronale nel midollo spinale e nel cervello di questi animali e sviluppare potenziali strategie terapeutiche. I nostri sforzi si concentrano nello studio 1) dei meccanismi molecolari e cellulari con cui i motoneuroni, le cellule nervose che controllano il movimento, degenerano e muoiono, 2) di molecole che possono rallentare la morte dei motoneuroni e proteggerli e 3) di molecole che possono prevenire l atrofia dei muscoli che caratterizza la malattia. I primi studi hanno portato alla pubblicazione di un lavoro intitolato Selective vulnerability of spinal and cortical motor neuron subpopulations in delta7 SMA mice ( Vulnerabilità selettiva di sottopopolazioni di motoneuroni spinali e corticali in topi SMA delta7 ), sulla rivista internazionale PlosOne, in collaborazione con il gruppo del Dott. Battaglia: abbiamo osservato una perdita progressiva dei motoneuroni spinali, già in fase presintomatica, con un maggiore coinvolgimento dei motoneuroni che innervano i muscoli prossimali (quelli cioè più vicini al tronco, come deltoide e bicipite) rispetto ai distali (avambraccio). Inoltre abbiamo descritto una riduzione selettiva dei neuroni piramidali giganti del V strato della corteccia motoria (i primi neuroni della via motoria), mai descritta precedentemente.
Stiamo quindi approfondendo tali studi, indagando più a fondo le anomalie della corteccia cerebrale dei topi affetti SMA, al fine di comprendere meglio le manifestazioni anatomopatologiche della malattia. Tramite l uso di traccianti neuronali e tecniche di impregnazione argentica, stiamo dettagliatamente valutando la degenerazione dei neuroni corticali (corticospinali e callosali) localizzati nel V strato della corteccia sensorimotoria di topi malati e di controllo. Mediante l uso di software dedicati, possiamo analizzare la dimensione del corpo cellulare, l estensione e la ramificazione dei dendriti, la densità e la morfologia delle spine dendritiche, mettendo in luce le alterazioni presenti. Stiamo inoltre valutando la neuroinfiammazione in prossimità sia dei motoneuroni spinali che corticali, poiché tale fenomeno potrebbe essere un potenziale target terapeutico nella SMA. Ulteriori analisi sono in corso per valutare altri aspetti, quali la mielinizzazione e la dimensione delle fibre nervose. Intendiamo inoltre valutare le alterazioni a carico dell ippocampo, valutando come la carenza di SMN possa colpire anche questa regione. Tale lavoro evidenzia che la patogenesi della SMA è probabilmente più complessa del previsto, in quanto in grado di colpire non solo le cellule del midollo spinale, ma anche altre popolazioni neuronali. Lo scopo dello studio è dunque quello di approfondire le attuali conoscenze sulle caratteristiche neuropatologiche della SMA. Il laboratorio è inoltre molto interessato a comprendere i meccanismi di morte neuronale che colpiscono i motoneuroni. Recentemente gli interessi del gruppo sono stati rivolti verso lo studio dell autofagia, un importante processo fisiologico per eliminare organuli danneggiati/invecchiati e proteine anomale. L ipotesi è che vi sia un rapporto tra l autofagia e la degenerazione dei motoneuroni. Utilizzando il modello murino di SMA intermedia di cui disponiamo, abbiamo valutato mediante analisi istologiche, molecolari e comportamentali se il fenomeno autofagico sia implicato nello sviluppo/progressione della patologia. Sembra infatti che i neuroni dei topi malati esprimano un numero molto più elevato di marker autofagici rispetto ai topi sani. Ciò è stato recentemente confermato anche in microscopia elettronica, in collaborazione con il Prof. Puyal (Univ. Losanna): abbiamo infatti osservato la presenza di vescicole autofagiche nel corpo cellulare e nei neuriti dei motoneuroni malati. Somministrando un inibitore dell attività autofagica (3 metiladenina), abbiamo osservato una significativa riduzione della morte dei motoneuroni e un conseguente ritardo nella comparsa dei deficit motori. Inoltre l inibizione dell autofagia sembra indurre anche una riduzione dell apoptosi, una forma di morte cellulare programmata, dimostrando come i due processi siano strettamente correlati. Ormai ultimato, il lavoro è in fase di stesura per la pubblicazione: lo studio farebbe luce su un nuovo meccanismo patologico coinvolto nella SMA, suggerendo che anche l autofagia potrebbe rappresentare un bersaglio terapeutico promettente nel ritardare la progressione della malattia.
Un ulteriore argomento di studio riguarda i mirna, piccole molecole di RNA con funzione regolatrice, coinvolte in quasi tutti i processi biologici. Nella Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), una malattia del motoneurone molto diversa dalla SMA ma che analogamente colpisce in maniera selettiva i motoneuroni, è stato dimostrato che il mirna206 (un mirna specifico dei muscoli scheletrici) è altamente espresso in caso di malattia, in un estremo tentativo compensatorio (Williams et al., Science, 2009): inoltre l'assenza del mirna206 in topi affetti da SLA accelera la progressione della malattia, lasciando ipotizzare che esso svolga un ruolo fondamentale nella corretta comunicazione tra il motoneurone e il muscolo a livello della giunzione neuromuscolare (la struttura con cui le fibre nervose provenienti dal midollo spinale prendono contatto con i muscoli). Abbiamo recentemente pubblicato un lavoro intitolato Expression of muscle-specific mirna 206 in the progression of disease in a murine SMA model ( Espressione del mirna 206 muscolo-specifico nella progressione della malattia in un modello murino di SMA ) sulla rivista internazionale PlosOne. Abbiamo dimostrato che anche nel nostro modello sperimentale viene attivata la via di segnale del mirna 206 precedentemente descritta nella SLA: esso avrebbe un probabile ruolo compensatorio nella reinnervazione, agendo come un meccanismo di sopravvivenza endogeno, purtroppo non sufficiente per prevenire la progressione della malattia. Tale mirna agisce inibendo o contrastando l'attività dell'istone deacetilasi 4 (HDAC 4): tra le più promettenti strategie farmacologiche per la SMA (già in trial clinico), vi è proprio l impiego di inibitori delle HDAC, in grado di determinare un effetto neuroprotettivo sui motoneuroni. Agire sul mirna206 significherebbe agire a monte della cascata del segnale, influenzando in maniera selettiva una HDAC coinvolta nella rigenerazione muscolare. Attualmente stiamo cercando di manipolare in vivo l espressione del mirna 206 tramite utilizzo di virus adenoassociati oppure mediante l uso di molecole che ne stimolino o inibiscano l espressione (mirna mimics o mirna inhibitors). Gli effetti della terapia saranno valutati dal punto di vista istologico (conta dei motoneuroni, analisi della neuroinfiammazione), molecolare (espressione del mirna e delle altre molecole da esso regolate) e comportamentale (test per monitorare le performance motorie degli animali). Infine, un ultimo argomento di studio riguarda le anomalie a carico delle giunzioni neuromuscolari: nel lavoro Expression of muscle-specific mirna 206 in the progression of disease in a murine SMA model abbiamo svolto una dettagliata analisi della morfologia delle placche neuromuscolari, valutandone dimensioni, struttura, innervazione, distribuzione e accumulo di neurofilamento (un noto marker patologico della SMA): le placche dei topi SMA risultano infatti più piccole e immature, maggiormente denervate e cariche di neurofilamento. Tra le numerose molecole che partecipano alla sviluppo delle giunzioni neuromuscolari, vi è l agrina e abbiamo deciso di studiarne il coinvolgimento nella patogenesi della SMA. Il nostro modello murino presenta infatti un ridotta quantità di agrina, segno quindi di un alterazione nel sistema. In collaborazione con la ditta svizzera Neurotune, abbiamo testato una terapia di rimpiazzo dell agrina mancante. Il trattamento ha permesso di migliorare le performance motorie degli animali trattati e di estendere la loro sopravvivenza di alcuni giorni. Inoltre l analisi istologica ha mostrato come il trattamento
possa aumentare la dimensione dei muscoli trattati, riducendone l atrofia. Anche le giunzioni neuromuscolari hanno mostrato una migliore morfologia e un maggior livello di maturazione. Possiamo dunque dedurre dalle nostre osservazioni che l agrina sia coinvolta nella SMA e che la sua manipolazione abbia un effetto benefico a livello muscolare. Il lavoro, ormai ultimato, è in corso di sottomissione. TRAUMI DEL MIDOLLO SPINALE Da anni il gruppo del Prof. Vercelli è dedicato anche allo studio degli eventi cellulari e molecolari scatenati da un trauma spinale, e alla ricerca di possibili trattamenti per promuovere il recupero funzionale post-traumatico. In particolare abbiamo studiato l effetto del trapianto di cellule staminali (adulte o embrionali) in modelli murini di lesione spinale, dimostrando come la terapia cellulare sia in grado di modulare la neuroinfiammazione, stimolare la plasticità cellulare, indurre fenomeni rigenerativi, ridurre la dimensione dell area traumatizzata e migliorare le performance motorie (Boido et al., EJN, 2009; Boido et al., J Neurosurg Spine, 2011; Garbossa et al., Neurosurg Rev, 2012; Boido et al., World Neurosurg, 2012; Boido et al., Adv stem cells, 2014). Al fine di migliorare ulteriormente la sopravvivenza e l integrazione di tali cellule, e conseguentemente incrementare la rigenerazione delle fibre nervose, la dott.ssa Boido, in collaborazione con il gruppo del Prof. Ciardelli (Politecnico di Torino), sta testando dei biomateriali (idrogeli) nei quali le cellule possano essere incapsulate. Tali dispositivi saranno fondamentali per la formazione di un ponteguida per le fibre attraverso il sito di lesione, in grado di ripristinare i collegamenti persi e sostenere la ripresa funzionale. Stiamo quindi sviluppando e testando gli idrogeli in colture cellulari, per valutare la loro capacità di accogliere le cellule e di mantenerle vitali. Successivamente passeremo agli studi in vivo, in un modello murino di lesione midollare (contusione). Nella fase sub-acuta (cioè, quando la lesione non è ancora del tutto stabilizzata), inietteremo gli idrogeli con o senza cellule staminali nel midollo spinale lesionato. Verranno valutati il recupero funzionale, la rigenerazione e la neuroinfiammazione. Il progetto (finanziato dalla Fondazione CRT) mira dunque a identificare un innovativo approccio sperimentale per una patologia molto diffusa, ma priva di cura. Infine ci stiamo anche sta dedicando allo studio dei meccanismi molecolari che si attivano in seguito ad una lesione spinale, focalizzando in particolare l attenzione sui mirna, piccole molecole di RNA con funzione regolatoria, per certi aspetti ancora poco conosciute, ma di grande interesse, in quanto costituiscono un sistema interno di regolazione fisiologica del nostro organismo. Non studieremo un singolo mirna, ma famiglie di mirna con funzioni convergenti, attivati in seguito a lesione spinale. Inoltre, anziché valutare il midollo spinale, ci concentreremo sui mirna espressi
nel cervello da una singola popolazione cellulare, le cellule corticospinali, in quanto principali vittime e responsabili dei deficit motori conseguenti un trama midollare. Il progetto sarà svolto in collaborazione con il gruppo del Professor T. Dalmay (University of East Anglia, UK) che dispone di un avanzata tecnica di sequenziamento. Una prima analisi globale dei mirna della corteccia sensorimotoria (dove risiedono le cellule corticospinali di nostro interesse) è già stata già eseguita e stiamo ora selezionando i mirna di maggiore interesse. Nel frattempo stiamo valutando il migliore approccio sperimentale per eseguire lo stesso tipo di analisi, ma in maniera selettiva sulle cellule corticospinali. I mirna di maggiore interesse saranno in seguito manipolati (overespressione o inibizione) prima in vitro, e successivamente in vivo sui nostri modelli murini di trauma spinale. Torino, 18/11/2015 Prof. Alessandro Vercelli Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, Regione Gonzole 10, 10043 Torino tel 0116706617/7700 fax 011/2366617