Facoltà di Medicina e Chirurgia Corso di Fisica Strumentale er Tecnici di Laboratorio Biomedico e Tecnici di revenzione ambientale e sui luoghi di lavoro Prof. R. Rolandi Il microscoio ottico Lo scoo di uesta arte del corso è di descrivere i rincii fisici del funzionamento del microscoio ottico. Il microscoio ottico è uno strumento che ingrandisce l immagine visiva di un oggetto. Il modo con cui uno strumento ottico forma l immagine di un oggetto viene descritto in rima arossimazione dall ottica geometrica. Ottica geometrica La luce è una radiazione elettromagnetica che è descritta in fisica classica come un onda che si roaga nel vuoto con una velità c = 298 000 km/ora. L'onda elettromagnetica è una erturbazione del camo elettromagnetico, che si roagano nello sazio. In ottica geometrica la luce è descritta come un insieme di raggi rettilinei. Tali raggi sono erendicolari al fronte dell'onda elettromagnetica. Il concetto di raggio luminoso è intuitivo, ma er averne un'idea concreta, anche se arossimata, basta ensare all'effetto della luce che enetra da una iccola aertura in una stanza buia e olverosa. L'ottica geometrica descrive la roagazione della luce in maniera arossimata. La descrizione è tanto iù vera uanto iù sono risettate le seguenti condizioni, dette condizioni di Gauss: 1) La roagazione della luce avviene in mezzi omogenei. In tali mezzi i raggi si mantengono rettilinei. 2) La lunghezza d'onda della radiazione imiegata è iccola risetto alle dimensioni lineari degli strumenti ottici. 3) Se gli strumenti ottici (lenti, secchi) hanno suerficie sferica le dimensioni lineari della zona della suerficie investita dalla radiazione luminosa devono essere molto iù iccole del raggio di curvatura della suerficie 4) I raggi che investono le suerfici ottiche devono essere uasi aralleli all'asse ottico, devono cioè essere arassiali. 5) La radiazione deve essere monromatica. Le condizioni 3, 4 e 5 non sono risettate nei iù comuni sistemi ottici, basti ensare che in genere si usa luce bianca che non è ovviamente monromatica, e danno origine ad aberrazioni che in genere vengono comensate con accorgimenti costruttivi. Le leggi fondamentali dell'ottica geometrica sono le leggi della riflessione e della rifrazione. Nella arte sueriore della figura 1 è rirodotto un eserimento didattico in cui un raggio di luce, reso visibile da articelle in sosensione (nebbia), incide sulla suerficie iana di un oggetto di vetro, viene deviato e rede all'interno dell'oggetto. Nella arte inferiore della stessa figura l'eserimento viene schematizzato: θ 1 è l'angolo di incidenza, θ' 1 è l'angolo di riflessione, θ 2 è l'angolo di rifrazione. Tenendo conto delle notazioni usate nella figura le leggi della riflessione e della rifrazione si enunciano nel seguente modo.
1) Il raggio incidente, uello riflesso e uello rifratto giacciono sullo stesso iano. In uesto caso nel iano del foglio. 2) L'angolo di incidenza e uello di riflessione sono uguali. 3) Tra l'angolo di incidenza e uello di rifrazione c'è la relazione: sinθ1 = n1,2 1) sinθ2 dove n 1,2 è l'indice di rifrazione del secondo mezzo risetto al rimo. Se il rimo mezzo è il vuoto n 1,2 rende il nome di indice di rifrazione assoluto e si indica semlicemente con n. Se n 1 è l'indice di rifrazione assoluto del mezzo 1 e n 2 l'indice di rifrazione assoluto del mezzo 2, l'indice di rifrazione del secondo mezzo risetto al rimo è: n 2 n 1,2 = 2) n1 Per dimostrarlo ensate ad un raggio che viaggia nel mezzo 1, viene rifratto alla suerficie di searazione tra il mezzo 1 e il vuoto (suorre l'angolo di rifrazione θ 0 ) incide sulla suerficie di searazione tra il vuoto e il mezzo 2 e si roaga nel mezzo 2. Considerare le due suerfici di searazione arallele. Osserviamo che se Figura 1 n 2 > n 1, cioè il secondo mezzo è iù denso del rimo, θ 2 è maggiore di θ 1 Anche se non ci servirà direttamente in uesta introduzione alla microscoia è bene saere che l'indice di rifrazione assoluto è il raorto tra la velità della luce nel vuoto e uella nel mezzo, cioè: c = v n 3) L'indice di rifrazione diende dalla lunghezza d'onda (disersione della luce). In tutta uesta Figura 2 trattazione noi suorremo di avere a che fare con luce monromatica (vedi condizioni di Gauss).
Lenti Le lenti sono oggetti che servono a deviare i raggi di luce. Sono erciò fatte con materiali il cui indice di rifrazione è diverso da uello dell aria e hanno due suerfici di cui almeno una è curva. Infatti è facile vedere che un vetro a facce iane e arallele, ad esemio uello di una finestra, non devia un raggio di luce, ma lo sosta arallelamente a se stesso. Nella nostra trattazione ci limiteremo a considerare lenti sferiche, cioè lenti le cui facce sono calotte sferiche. Una delle due facce uò essere anche iana. La retta congiungente i centri di curvatura delle due calotte sferiche è detta asse ottico. Le lenti convergenti trasformano un fascio di raggi aralleli all asse ottico in un fascio di raggi che convergono verso lasse ottico. Le lenti divergenti trasformano un fascio di raggi aralleli all asse ottico in fascio i cui raggi divergono dall asse ottico. Noi considereremo solo lenti sottili, ossia lenti il cui sessore sia trascurabile risetto ai raggi di curvatura Figura 3 delle due suerfici. In Figura 3 sono rirodotte le sezioni di alcuni tii di lenti. Una lente è caratterizzata dalla distanza fale che è la distanza dal iano della lente, suosta infinitamente sottile, di due unti detti fuhi, disosti simmetricamente risetto al iano della lente. Nei fuhi convergono i raggi aralleli all asse ottico (lente convergente) o i loro rolungamenti (lente divergente). La distanza fale diende dal materiale di cui è fatta la lente, dal mezzo in cui è immersa le lente, e dai raggi di curvatura delle suerfici della lente secondo l euazione: f n n n = 1 1 2 4) 2 1 r r r r 2 1 dove n 1 e n 2 sono gli indici di rifrazione del mezzo in cui è immersa la lente e uello del materiale di cui è fatta la lente. In uesto corso non useremo uesta euazione, ma va sottolineato che i raggi di curvatura ossono essere ositivi o negatici in accordo alla convenzione usata nella trattazione dei diottri sferici 1. La distanza fale uò uindi essere ositiva o negativa. E ositiva er le lenti convergenti e negativa er le lenti divergenti. Costruzione geometrica delle immagini nelle lenti sottili Quando le condizioni di Gauss vengono risettate, una lente sottile fa corrisondere, a unti luminosi osti su un iano erendicolare all asse ottico, unti immagine anch essi osti su un iano erendicolare all asse ottico (ortoscoia della lente). I due iani sono detti iani coniugati. In Figura 4 si vede come una lente convergente forma l immagine di una candela. La costruzione geometrica dell immagine si fa sulla base delle due seguenti regole: a) I raggi diretti verso il centro ottico della lente, che è l intersezione dell asse della lente con l asse ottico, non vengono deviati. b) I raggi aralleli all asse ottico sono deviati dalla lente in modo tale che essi stessi o i loro rolungamenti assino er il fuo. Le lenti convergenti deviano i raggi aralleli verso il fuo osto dalla arte oosta a Figura 4 uella da dove roviene il raggio. Le lenti 1 Il diottro sferico è formato da una suerficie sferica che seara due mezzi con diversi indici di rifrazione. Si considera ositivo il raggio di curvatura se il centro di curvatura è osto dalla arte oosta a uella da cui arrivano i raggi luminosi.
Figura 5 divergenti li deviano in modo tale che i rolungamenti dei raggi deviati assino er il fuo osto dalla stessa arte da dove rovengono i raggi (Figura 5). In Figura 6 è mostrata la costruzione dell immagine A B dell oggetto AB er una lente convergente. Il iano della lente, che è erendicolare al foglio ed è indicato in figura da una linea tratteggiata, divide lo sazio in due semi-sazi. Quello che contiene l oggetto è lo sazio oggetto, uello oosto è lo sazio immagine. Vedremo uando considereremo la lente di ingrandimento che non semre l immagine si forma nello sazio immagine. Tra la distanza dell oggetto dalla lente, la distanza dell immagine dalla lente e la distanza fale esiste una relazione che rende il nome di euazione dei unti coniugati che, usando le notazioni mostrate nella figura 5, si scrive: 1 + Per una lente divergente f è negativo. Quando l immagine si forma nello sazio oggetto è negativo (immagine virtuale). Nel caso descritto in Figura 6, e f sono entrambi ositivi. Si osservi 1 = 1 f 5) O Figura 6 che le linee che formano l immagine seguono il ercorso dei raggi reali. Questo vuol dire che se si mette uno schermo all altezza del iano che contiene A B si uò osservare l immagine sullo schermo e se al osto dello schermo ci fosse una ellicola fotografica, uesta rimarrebbe imressionata. Notate che er ogni unto dell oggetto si devono considerare solo due raggi er costruire il corrisondente unto immagine. Osserviamo che lo schema della costruzione dell immagine è simmetrico risetto il iano della lente, er cui le cose non cambierebbero se si invertisse l immagine con l oggetto, ossia si considerassero i raggi artenti da A B anziché da AB. Inoltre la costruzione ha simmetria cilindrica, cioè AB e A B e lo schizzo della lente ossono essere ensati come le tracce sul iano del foglio di una sezione ualsiasi di dischi erendicolari al foglio. Si definisce ingrandimento assoluto della lente il raorto tra le dimensioni lineari dell immagine e uelle dell oggetto. Dalla similitudine dei triangoli ABO e A B O si dimostra che :
A'B' G = = AB 6) G è definito come il raorto tra due lunghezze, uindi deve essere un numero ositivo, ertanto, che come abbiamo visto uò essere anche negativo, si rende in valore assoluto. Usando l euazione dei unti coniugati si ottiene: f 7) G = f che fornisce l ingrandimento assoluto in funzione della distanza dell oggetto dalla lente e della distanza fale della lente. Si definisce ingrandimento lineare o semlicemente ingrandimento la uantità: f M = = 8) f Questa uantità uò essere ositiva o negativa e risetto a G contiene in iù l informazione sul tio di immagine. Infatti M è ositivo uando è negativo e è negativo uando l immagine è virtuale, cioè si forma nel semiiano oggetto. Si uò facilmente vedere inoltre che l immagine in uesto caso è diritta. M è negativo uando è ositivo, cioè l immagine si forma nello sazio immagine, è reale e caovolta. E il caso descritto in Figura 6. Esaminando la Figura 6 e tenendo resente la definizione di ingrandimento si vede che le dimensioni dell immagine e la sua natura cambiano cambiando la distanza dell oggetto dalla lente. Lente di ingrandimento o microscoio semlice. Nel caso in cui l oggetto sia osto tra il fuo e una lente convergente l immagine si forma nel semiiano oggetto e è negativo. Essendo minore di f che è f ositivo, I risulta essere negativo e maggiore di 1. L immagine è erciò virtuale, diritta e ingrandità (Figura 6) Osserviamo, in Figura 6, che l immagine è costruita con il rolungamento dei raggi non con i raggi reali. Questo vuol dire che se si mettesse uno schermo dove si forma l immagine uesta non sarebbe raccolta dallo schermo e una lastra fotografica non ne sarebbe imressionata. Per uesto si chiama immagine virtuale. L chio dell osservatore osto nello sazio immagine è colito da raggi deviati dalla lente in modo tale che sembrano venire da A B anziché da Figura 6 AB er cui erceisce un oggetto ingrandito. Una lente convergente usata in ueste condizioni è una lente di ingrandimento o microscoio semlice. Poiché una lente di ingrandimento fa vedere un oggetto iù grande è imortante saere di uanto iù grande. Questa informazione è fornita dall ingrandimento visuale. Per definire uesto arametro dbiamo fare ualche considerazione su come funziona l chio. Occhio e camera oscura Dal unto di vista ottico l chio degli animali sueriori è una camera di forma grosso modo sferica formata da una arete oaca in cui vi è un aertura. L aertura è cuata da una lente (cristallino)
munita di diaframma (l iride). Sulla calotta sferica oosta all aertura, dove si forma l immagine vi è la retina. La retina è l euivalente della lastra fotografica o meglio del sistema di sensori delle macchine fotografiche digitali. E comosta da cellule fotosensibili (coni e bastoncelli) che Figura 7 trasformano il segnale luminose in segnale elettrico, lo inviano al cervello che costruisce l immagine 2. Il rinciio base del funzionamento dell chio è lo stesso della macchina fotografica ed è uello della camera oscura. La camera oscura è semlicemente una camera a areti oache con una sola iccola aertura. I raggi rovenienti da un oggetto ed entranti nella camera attraverso l aertura formano sulla arete della camera un immagine caovolta dell oggetto. La nitidezza e la luminosità dell immagine diende dalle dimensioni dell aertura. Sino a uando sono risettate le condizioni dell ottica geometrica, ossia le dimensioni lineari dell aertura sono molto maggiori della lunghezza d onda della luce usata, tanto iù iccola è l aertura tanto iù nitida e meno luminosa è l immagine. Infatti, come si vede in Figura 7, da uno stesso unto, artono iù raggi che attraversano il foro e incontrano la arete in unti diversi, er cui un unto luminoso viene trasformato in una zona luminosa estesa. Tanto iù iccolo è l aertura tanto iù si restringe il fascio di raggi che, artendo dallo stesso unto, assano attraverso l aertura. La zona luminosa rimicciolisce e diminuisce anche la luminosità comlessiva dell immagine. Per avere immagini nitide e luminose si one, al osto dell aertura, una lente convergente che aumenta il numero di raggi che entrano nella camera e che convergono nello stesso unto. La lente erò, er la legge dei unti coniugati, forma l immagine nitida solo ad una distanza che diende dalla sua distanza fale e dalla distanza dell oggetto. Perciò lo schermo dove si raccoglie l immagine non uò essere osto a una distanza ualsiasi dall aertura. Se la lente ha distanza fale fissa si deve cambiare la distanza dello schermo dalla lente a seconda della distanza dell oggetto. Questo è il caso delle macchine fotografiche. L oerazione di messa a fuo consiste rorio nel regolare la distanza tra la lente e la ellicola erché uesta venga a coincidere con il iano immagine definito dalla legge dei unti coniugati. Nell chio invece la messa a fuo avviene cambiando la distanza fale della lente (cristallino). Infatti aositi muscoli cambiano i raggi di curvatura delle suerfici del cristallino. Ingrandimento visuale La geometria della formazione dell immagine sulla retina è mostrata in figura 8. B O M 2ω δ N Figura 8 A d 2 Per una descrizione dell chio umano elementare ma meno sommaria di uella fatta ui vedere er esemio il sito web: htt://web.tiscali.it/no-redirect-tiscali/mineman/didattica/did2000/fisica4/ottica in uesto sito c è la ossibilità di fare un eserimento virtuale sulla costruzione delle immagini.
L oggetto AB è osto alla distanza d dall chio. L immagine MN si forma sulla arete osteriore dell chio a distanza δ dal cristallino. I raggi BN e AM sono i raggi assanti er il centro ottico del cristallino. Si dice che l oggetto è visto sotto l angolo 2ω. Nella figura er ragioni grafiche l angolo 2ω è abbastanza grande, ma in genere è iuttosto iccolo er cui si uò scrivere : AB 2ωd; MN 2ωδ 9) Se si introduce una lente di ingrandimento tra l oggetto e l chio la situazione diventa uella descritta in figura 9. B O M F B A 2ω δ N Figura 9 A d Ovviamente anche in uesto caso ossiamo scrivere: A B 2ω d ; M N 2ω δ 10) Si definisce ingrandimento visuale il raorto tra le dimensioni dell immagine che si forma sulla retina in resenza della lente e uelle dell immagine sulla retina senza lente: M' N' ω' I v = = 11) MN ω L ingrandimento visuale, I v, come è intuibile, è una funzione della osizione dell oggetto e della distanza fale della lente. Infatti dalle figure 8 e 9 si vede che: 2 ω d = AB e 2 ω d = A B Usando ueste relazioni nella definizione dell ingrandimento visuale e ricordando la definizione di ingrandimento assoluto si ha: I ω A B d d d = = G = v ω AB d d d = 13) L ingrandimento visuale si uò scrivere come funzione della distanza fale della lente se si riferisce alle condizioni in cui si ha la miglior visione dell chio e il massimo ingrandimento della lente. Dalla figura 8 si vede che l immagine sulla retina è tanto iù grande uanto iù l oggetto è vicino all chio. Ma è eserienza comune che uando un oggetto è troo vicino all chio la sua immagine è sfata. La minima distanza er cui un oggetto aare ancora a fuo rende il nome di 12)
distanza della visione distinta. Ovviamente essa varia da ersona a ersona ma, er scoi ratici, si assume essere 25 cm. Il massimo ingrandimento assoluto della lente si ha uando = cioè, dalla legge dei iani coniugati, uando = f ( 3 ). In ueste condizioni, si uò trascurare la differenza tra d e, che è la distanza della lente dall chio e l ingrandimento visuale si riduce a: 0.25 I v = 14) f In uesto modo l ingrandimento visuale diventa solo funzione della distanza fale della lente. Il termine 1/f rende il nome di otere diottrico della lente, si indica con D e si misura in diottrie. La 14) si uò così scrivere come: Per cui una lente con un otere diottrico di 4 diottrie roduce un ingrandimento visuale di 1. 0.25 D I v = = 15) f 4 Il microscoio comosto Lo strumento chiamato comunemente microscoio è in realtà il microscoio comosto, erché formato da due lenti. Come si è visto nel microscoio semlice l ingrandimento visuale è inversamente roorzionale alla lunghezza fale e in linea di rinciio non ci sono limiti all ingrandimento ottenibile. Basterebbe usare lenti con distanze fali molto iccole er ottenere alti ingrandimenti visuali. In ratica erò a causa di diversi rlemi di costruzione e di uso si referisce usare il microscoio Figura 10 comosto. Il microscoio comosto, il cui schema ottico è raresentato in figura 10, è formato da due lenti convergenti. La rima uella iù vicino all oggetto in esame forma un immagine reale ed è chiamata biettivo. La seconda, iù vicina all chio dell osservatore, forma l immagine virtuale ingrandita ed è chiamata ulare. Come si vede in figura l biettivo forma l immagine reale A B dell oggetto AB. L immagine reale A B costituisce l oggetto er l ulare. La distanza tra biettivo e ulare è regolata in modo che l immagine A B si formi tra il fuo dell ulare e l ulare stesso che funziona come una lente di ingrandimento formando l immagine virtuale 3 Nella ratica l oggetto sarà osto molto vicino al fuo e l immagine si formerà a distanza molto grande dalla lente.
A B. In definitiva il microscoio comosto forma una immagine virtuale e ingrandita di un oggetto come la lente di ingrandimento 4. Dalla definizione di ingrandimento assoluto (e. 6) l ingrandimento assoluto del microscoio comosto risulta essere: In analogia con l ingrandimento visuale del microscoio semlice, l ingrandimento visuale del microscoio comosto è: A''B'' A''B'' A'B' G = = = G G 16) AB A'B' AB dove d è la distanza dell oggetto dall chio uando non vi è fraosto il microscoio e d è la distanza dell immagine virtuale dall chio in resenza del microscoio. Anche in uesto caso I d d = G G G 17) d' d' v = considerando le condizioni di visione ottimale si uò ottenere una esressione dell ingrandimento visuale indiendente dalla distanza dell oggetto. Usando l e. 6) er gli ingrandimenti assoluti si ottiene: I v d = 18) d' La condizione ottimale di visione in assenza di microscoio si ha uando l oggetto è osto alla distanza della visione distinta (0.25 m). Le condizioni ottimali di lavoro del microscoio si hanno uando l oggetto è osto vicino al fuo dell biettivo ( f ), l immagine rodotta dall biettivo si forma in rossimità del fuo dell ulare ( f + Δ, con Δ = distanza tra il fuo dell biettivo e il fuo dell ulare), così che l immagine virtuale si formerà molto ingrandita ad una distanza molto grande dall ulare (all infinito) er cui d. In ueste condizioni la e. 18 diventa: I v = 19) d d' 0.25( Δ + f f ) Da cui si vede che l ingrandimento visuale è tanto maggiore uanto maggiore è la distanza tra il fuo dell biettivo e uello dell ulare e uanto minore è la distanza dell oggetto dall biettivo. Questa non uò essere minore di f erché si formi un immagine reale. Quando f l immagine reale si forma molto distante dall biettivo er cui Δ >> f e la e. 19 diventa: I v = 20) d d' 0.25Δ f f 4 C è da notare che l immagine A B è diritta risetto al suo oggetto A B ma invertita risetto all oggetto reale AB.
In ueste condizioni ottimali di lavoro l ingrandimento visuale del microscoio diventa solo funzione dei arametri costruttivi del microscoio e uindi una caratteristica roria dello strumento. Negli strumenti moderni er alti ingrandimenti Δ è in genere di 16 cm, f uò essere di ualche millimetro (es. 0.5 cm) e f di ualche centimetro (es. 2.5 cm) er cui l ingrandimento visuale risulta essere di circa 300-400X. Nei microscoi da dissezione o stereomicroscoi, usati nei laboratori er maniolare iccoli camioni e che devono avere un largo camo visivo e grandi distanze di lavoro (f grande), gli ingrandimenti di solito non suerano 20-30X.