Epidemiologia delle infezioni virali del sistema nervoso centrale nella regione Puglia

Epidemiologia delle infezioni virali del sistema nervoso centrale nella regione Puglia Agata Calvario, Maria Scarasciulli UOC Microbiologia e Virologia, Azienda Ospedaliero Universitaria Policlinico di Bari Questo lavoro è stato in parte presentato al Convegno Il Laboratorio nelle malattie del sistema nervoso, 6-7 Giugno 2013, Vicenza. ABSTRACT Epidemiology of viral infections of central nervous system (CNS) in the Puglia region. After reviewing the available literature to identify diagnostic criteria employed to establish viral etiologic agents possibly involved in CNS disorders, an operative algorithm was developed according to the clinical as well as environmental evidence. Results obtained along a period of 6 years (2006-2012) by molecular biology tests on 1984 cerebrospinal fluids from patients suffering from CNS disorders are reported. INTRODUZIONE Le infezioni virali del sistema nervoso centrale (SNC) sono considerate tra le patologie più gravi in termini di diagnosi, cura e trattamento del paziente. Sono, infatti, tra le poche che richiedono esami in regime di urgenza diagnostica al fine sia di stabilire con rapidità la natura dell'agente eziologico che di instaurare la terapia idonea. In considerazione della varietà dei quadri clinici e degli agenti coinvolti, il panorama eziologico ambientale deve essere tenuto presente al fine di permettere l uso di opportuni algoritmi diagnostici che accelerino e ottimizzino la ricerca virologica (1). La peculiare natura del campione di liquido cefalorachidiano (LCR), ovvero la frequente esiguità e l irripetibilità del prelievo, impongono che ogni procedura sia rigorosa e personalizzata al caso in esame. Anche la conoscenza della storia naturale del virus ricercato, delle possibilità e dei limiti dei metodi diagnostici disponibili è di vitale importanza, poiché l accuratezza e la sensibilità dei test sono condizionate dall appropriatezza dei campioni impiegati e dalla scelta del metodo più opportuno, sulla base dello stato clinico e delle caratteristiche virali. Da questo punto di vista, l'avvento delle metodiche molecolari ha dato un impulso straordinario alla diagnosi delle malattie del SNC, anche se ancora ~50% dei casi resta non diagnosticato (2). Dal momento che la corretta diagnosi porta a un beneficio di tipo terapeutico, gestionale e di esito finale per il paziente, ogni sforzo deve essere fatto per il suo raggiungimento, partendo dal presupposto che il solo esame clinico non può escludere a priori il coinvolgimento di un agente eziologico virale. Altro fattore importante da considerare è la componente immunologica del processo infettivo, che può alterare e aggravare il quadro clinico, come nel caso di encefaliti post-infettive o post-vaccinali. Illustriamo in questo lavoro i dati epidemiologici delle infezioni virali del SNC, raccolti in un periodo di 6 anni in regione Puglia, mediante un algoritmo diagnostico da noi messo a punto e condiviso con i clinici, che consente l approccio alla diagnosi secondo un percorso consolidato e in accordo con le necessità sopra riportate. MATERIALI E METODI Negli anni 2006-2012 sono stati analizzati 1984 campioni di LCR di pazienti in fase acuta di malattia provenienti dai principali nosocomi della regione Puglia e alcuni anche extraregionali. I pazienti, 1020 maschi e 964 femmine, dei quali 1796 (90,5%) immunocompetenti e 188 (9,5%) con deficit immunitari, erano ospedalizzati in reparti di neurologia, rianimazione, malattie infettive, pediatria ed ematologia; presentavano all ingresso diagnosi di encefalite, meningite, meningoencefalite, mielite, poliradicoloneurite, cerebellite, acute disseminated encephalomyelitis (ADEM), malattia demielinizzante, sclerosi multipla e lesioni cerebrali. La distribuzione per classi di età era rappresentata Corrispondenza a: Agata Calvario, UOC Microbiologia e Virologia, Azienda Ospedaliero Universitaria Policlinico Bari, Piazza Giulio Cesare 10, 70124 Bari. Tel. 0805593640, Fax 0805593640, E-mail agata_calvario@libero.it Ricevuto: 05.06.2013 Revisionato: 19.09.2013 Accettato: 25.09.2013 biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 3 203

SCIENTIFIC PAPERS dal 16,3% di pazienti pediatrici (n=323, 0-14 anni), dal 74,7% di pazienti in età adulta (n=1483, 15-65 anni) e dal 9,0% di pazienti anziani (n=178, >65 anni). La percentuale di pazienti immunodepressi era, rispettivamente, 0,8%, 8% e 0,7% nelle tre classi di età considerate. Riguardo ai pazienti pediatrici, 307/323 (95%) erano immunocompetenti e 16/323 (5%) immunocompromessi, di cui 15/16 con patologie oncoematologiche e 1/16 HIV positivo. La maggior parte delle indagini virologiche sono state eseguite su campioni di LCR, raccolti prima dell inizio della terapia, in associazione a campioni di siero/plasma (n=1234) e/o sangue intero (n=453) o talora ad altri campioni da sedi differenti, suggeriti dal quadro clinico ipotizzato, per un totale di 3847 campioni analizzati. Per 64 pazienti l analisi di LCR è stata ripetuta dopo circa una settimana per confermare la diagnosi o monitorare il decorso della malattia. I campioni erano avviati alla ricerca virologica secondo l algoritmo mostrato nella Figura 1: in prima istanza erano ricercati i 7 virus erpetici [herpes simplex virus 1 (HSV1), herpes simplex virus 2 (HSV2), citomegalovirus (CMV), Epstein-Bar virus (EBV), human herpes virus 6 (HHV6), varicella-zoster virus (VZV) e human herpes virus 7 (HHV7)] e l enterovirus; in caso di negatività e sulla base di notizie clinico-anamnestiche dettagliate, la ricerca veniva estesa agli altri agenti virali, elencati nella Figura 1, con la sola eccezione di Tick- Borne virus, la cui ricerca veniva eseguita dall Istituto Superiore di Sanità, qualora le notizie epidemiologiche ne suggerissero la determinazione. I campioni acellulari (LCR, siero, plasma, tamponi, gargarizzati) e cellulari (sangue intero, biopsie) erano avviati a estrazione di DNA/RNA virale con sistema automatico X-tractor Gene (Corbett Robotics, Diatech) mediante kit Helix DNA/RNA plus (Nanogen Advanced Diagnostics). Ai campioni acellulari erano aggiunti 10 µl di CPE (controllo positivo di estrazione) - DNA/RNA (Nanogen Advanced Diagnostics), che consentivano di garantire l idoneità del campione in esame. Il DNA/RNA ottenuto era quindi risospeso in un volume finale di 150 µl con tampone di eluizione. L amplificazione genomica è stata eseguita con tecnica polymerase chain reaction (PCR) real-time mediante sistema ABI PRISM 7300 (Applied Biosystems), con l impiego di kit commerciali (Nanogen Advanced Diagnostics). Le sonde specifiche per ciascun virus, di seguito riportate, erano marcate con fluoroforo fluorescein amidite (FAM) e bloccate da minor groove binder-nonfluorescent quencher (MGB- NFQ): CMV [esone 4 del gene Major Immediate Early Antigen (MIEA)], EBV [proteina Epstein Barr nuclear antigen 1 (EBNA-1)], HSV1 [glicoproteina D, regione unique short 6 (US6)], HSV2 (glicoproteina G, regione US4), HHV6 [ open reading frame (ORF) 13R], HHV8 (proteina del capside), VZV ( major DNA binding protein, ORF 29), poliomavirus BK (BKV) ( large T antigen ), enterovirus [5' UTR ( untranslated region )]. Il dosaggio quantitativo del DNA virale era ottenuto mediante curva standard impiegando quantità note di plasmide (10 5, 10 4, 10 3 e 10 2 copie). Acqua bidistillata sterile è stata utilizzata come controllo negativo. La sensibilità analitica permetteva di identificare la presenza di 10 molecole di DNA/RNA bersaglio in 5 µl di estratto. I risultati erano espressi come copie di genomi virali/ml campione (gv/ml). La nested PCR era impiegata per l amplificazione dei rimanenti virus di seguito riportati, secondo le indicazioni della ditta produttrice (Nanogen Advanced Diagnostics): John Cunningham virus (poliomavirus) (JCV) (gene codificante il large T antigen ), influenza ( gene matrix ), parvovirus [regione viral protein 1 (VP1)], HHV7 (proteina del capside regione U57), adenovirus (proteina maggiore del capside) e virus respiratorio sinciziale (VRS) (proteina di fusione). RISULTATI Tick-Borne virus Parvovirus Influenza Figura 1 Algoritmo operativo per le infezioni virali del sistema nervoso centrale. HSV1, herpes simplex virus 1; EBV, Epstein-Bar virus; HHV7, human herpes virus 7; HSV2, herpes simplex virus 2; HHV6, human herpes virus 6; CMV, citomegalovirus; VZV, varicellazoster virus; ADV, adenovirus; VRS, virus respiratorio sinciziale; JCV, John Cunningham virus (poliomavirus); HHV8, human herpes virus 8; BKV, poliomavirus BK. Dei 1984 campioni di LCR analizzati con metodiche molecolari 293/1984 (14,8%) sono risultati positivi: 250/293 (85,3%) provenivano da pazienti immunocompetenti e 43/293 (14,7%) da soggetti immunocompromessi. I virus più frequentemente ritrovati appartenevano alla classe herpes, in ordine di prevalenza HSV1, EBV, VZV, HHV7, HHV6 e CMV, quest'ultimo con pari frequenza dell enterovirus. A seguire, erano identificati BKV, HSV2, HHV8, JCV e parvovirus/ influenza virus. In 23 pazienti era riscontrata coinfezione, con associazioni tra HSV1, EBV, HHV6, VZV e altri virus erpetici. Nei pazienti immunodepressi HIV positivi (n=15), le positività hanno riguardato, nell ordine, VZV, EBV, BKV, CMV e 2 casi di coinfezione (HHV6-CMV, VZV-EBV). Nei pazienti immunodepressi non HIV (n=28) sono stati ritrovati, nell ordine, EBV, HHV6, 5 coinfezioni (EBV- 204 biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 3

Tabella 1 Virus identificati nel corso dell indagine Soggetti immunodepressi Soggetti immunocompetenti HIV positivi HIV negativi Totale Herpes simplex virus 1 47 1 1 49 Epstein-Bar virus 36 3 6 45 Varicella-zoster virus 33 4 3 40 Human herpes virus 7 37 0 1 38 Human herpes virus 6 30 0 5 35 Citomegalovirus 13 2 4 19 Enterovirus 19 0 0 19 Poliomavirus BK 7 2 2 11 Herpes simplex virus 2 7 0 0 7 Human herpes virus 8 3 0 0 3 John Cunningham virus 1 0 1 2 Influenza 1 0 0 1 Parvovirus 0 1 0 1 Coinfezioni 16 2 5 23 Totale 250 15 28 293 HHV6, EBV-HHV7, EBV-VZV, HHV6-HHV7, HHV6- VZV), CMV e VZV (Tabella 1). Nei pazienti pediatrici, gli LCR positivi sono stati 58 (19,8%), di cui 52 (89,6%) provenienti da soggetti immunocompetenti. Le positività nei pazienti immunocompetenti sono state, in ordine decrescente: HHV7 (25,8 %), enterovirus (19,2%), EBV (17,3%), HHV6 (13,5%), HSV1 (9,6%), VZV (3,8%), CMV e coinfezioni (3,8%). Nella coorte dei pazienti pediatrici oncoematologici, HHV6 è stato il virus ritrovato più frequentemente. Nel 33,4% di tutti i casi positivi è stata osservata contemporanea positività sia in LCR che nel campione ematico; nell ambito dei LCR negativi, in 202 casi (202/1691=11,9%) è risultato positivo solo il campione ematico. Confrontando le diagnosi di ingresso con le positività riscontrate, la patologia predominante nei pazienti immunocompetenti è risultata l encefalite associata, in ordine decrescente, a HSV1, HHV7, EBV, VZV e HHV6; nei pazienti immunocompromessi la patologia predominante è risultata la meningite, anche se numerosi sono stati i casi con altre diagnosi (Tabelle 2 e 3). Tutte le positività per HHV6 in LCR sono state indagate per HHV6 cromosoma integrato (CIHHV6), analizzando campioni di siero, sangue intero e, talvolta, di bulbo pilifero. 11 LCR sono risultati positivi per CIHHV6 integrato, di cui 3 pediatrici (3/58 = 5,2%) e 8 provenienti da adulti (8/235 = 3,4%). La ricerca di Tick-Borne virus, quando eseguita, è risultata sempre negativa. DISCUSSIONE Dagli anni 80 nei pazienti con encefalite sottoposti a terapia antivirale è stato documentato il sensibile miglioramento delle sequele (3). Da allora le linee guida internazionali hanno posto l'accento sulla necessità di fare ogni sforzo per stabilire una diagnosi eziologica, soprattutto nelle encefaliti virali, che rappresentano i casi più frequenti di infezione del SNC e quelli che possono essere trattati terapeuticamente con maggiore successo (4). Con questi presupposti, dal 1999 abbiamo implementato la diagnostica delle infezioni del SNC introducendo metodiche di biologia molecolare che hanno via via sostituito le metodiche colturali, per gli innegabili vantaggi di tipo clinico-diagnostico, universalmente riconosciuti (5). Il primo effetto riscontrato è stato l'incremento considerevole della casistica, da poche decine a >100 pazienti per anno: un dato molto incoraggiante, che trovava ragione nel fatto che molti casi non diagnosticati con l impiego di tecniche tradizionali trovavano finalmente una causa eziologica con l approccio molecolare. Dal 1999 al 2002, avvalendoci della tecnologia multiplex herpes consensus, sono stati studiati 378 pazienti, 91% immunocompetenti e 9% immunocompromessi (6). Successivamente, in base all evoluzione tecnologica e alla rilevanza diagnosticoterapeutica, è stata introdotta la tecnologia PCR realtime, utilizzandola in parallelo, negli anni 2003-2004, a quella multiplex herpes consensus. Sulla base di questa esperienza, dal 2006 abbiamo introdotto un algoritmo operativo e una scheda dati anamnestica, condivisa con i clinici dell Azienda Ospedaliera biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 3 205

SCIENTIFIC PAPERS Tabella 2 Positività virali correlate alle patologie di ingresso nei pazienti immunocompetenti Encefalite Meningo encefalite Meningite Malattia demielinizzante Poliradicolo neurite Sclerosi multipla Cerebellite Mielite No diagnosi Altro Totale HSV1 27 11 1 3-1 - - 2 2 47 EBV 12 3 3 5 4 2-1 2 4 36 VZV 12 7 1-7 2 1-2 1 33 HHV7 18 5-3 3 1-2 - 5 37 HHV6 11 3-4 7 - - - - 5 30 CMV 1 1 1 2 3 - - - 1 4 13 Enterovirus 1 4 4-1 - - 9 - - 19 BKV 2 2 - - 2 - - - 1-7 HSV2 2 1 - - - 1 - - 1 2 7 HHV8 2 - - - - - - - - 1 3 JVC 1 - - - - - - - - - 1 Infuenza - - - - - - 1 - - - 1 Parvovirus - - - - - - - - - - 0 Coinfezioni 7 1 1 2-1 - - 1 3 16 Totale 96 38 11 19 27 8 2 12 10 27 250 HSV1, herpes simplex virus 1; EBV, Epstein-Bar virus; VZV, varicella-zoster virus; HHV7, human herpes virus 7; HHV6, human herpes virus 6; CMV, citomegalovirus; BKV, poliomavirus BK; HSV2, herpes simplex virus 2; HHV8, human herpes virus 8; JCV, John Cunningham virus (poliomavirus). Tabella 3 Positività virali correlate alle patologie di ingresso nei pazienti immunocompromessi Encefalite HIV Meningo encefalite Meningite Malattia demielinizzante Poliradicolo neurite Sclerosi multipla No HIV Cerebellite Mielite No diagnosi Altro Totale HSV-1 - - 1 - - - - - - 1 2 HSV-2 - - - - - - - - - - 0 CMV - - 2 - - 1 - - 1 2 6 EBV 1-2 - 2-1 - - 3 9 VZV 2 1 1-1 - 1 - - 1 7 HHV6 - - - 4 - - - - - 1 5 HHV7 - - - - - - - - - 1 1 HHV8 - - - - - - - - - - 0 BKV - - 2 - - - - - - 2 4 Enterovirus - - - - - - - - - - 0 Infuenza - - - - - - - - - - 0 Parvovirus - 1 - - - - - - - - 1 JCV - - - - - - - 1 - - 1 Coinfezioni 1-1 1-1 1 - - 2 7 Totale 4 2 9 5 3 2 3 1 1 13 43 Per abbreviazioni, vedere Tabella 2. Universitaria Policlinico di Bari, al fine di ottimizzare la diagnosi delle malattie virali del SNC, avvalendoci di un approccio multidisciplinare proposto e riconosciuto a livello internazionale (7). La scelta di esaminare sia campioni di LCR che di siero/plasma o sangue intero deriva dalla considerazione che in molti casi si hanno campioni ematici positivi con LCR negativo, soprattutto nei casi di ADEM in pazienti pediatrici oppure nei casi di encefalite post-infettiva o post-vaccinale. La ricerca contemporanea su diverse tipologie di campione è suggerita da vari autori (1, 4, 7). 206 biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 3

I dati di infezione virale del SNC raccolti in questo studio permettono alcune considerazioni relative al nostro panorama epidemiologico: 1) le infezioni del SNC sono per lo più a carico di pazienti adulti immunocompetenti; 2) in questi, l encefalite rappresenta la più frequente causa di malattia associata a infezione virale, anche se molti sono stati i casi privi di diagnosi neurologica d ingresso. Tale patologia è risultata associata a tutti i virus erpetici e, in maggior percentuale, a HSV1, EBV, VZV, HHV7 e HHV6; 3) così come riferito in letteratura, nella coorte dei pazienti immunocompetenti, HSV1 è risultato il virus più frequentemente identificato tra gli adulti; diversamente, tra i pazienti pediatrici la positività per HHV7 è stata quella prevalente, seguita da enterovirus; 4) riguardo ai pazienti immunodepressi, EBV è risultato il virus più frequentemente identificato, seguito da VZV e, alla pari, da HHV6 e CMV. Tali positività hanno riguardato in maggioranza pazienti adulti non HIV positivi, mentre la metà dei casi positivi per HHV6 era riferibile a pazienti pediatrici oncoematologici; rispetto a questi ultimi casi, critici per il management clinico-terapeutico, la presenza di CIHHV6 a livello ematico e bulbo pilifero ha consentito di distinguere un infezione primaria da una persistente (CIHHV6 positivo) per la quale la terapia antivirale non è raccomandata; 5) la ricerca virologica sui campioni di siero e sangue intero ha permesso di individuare la causa eziologica in casi di ADEM e di encefaliti post-infettive, soprattutto nei pazienti pediatrici; 6) la ricerca di Tick-Borne virus, quando eseguita, è risultata sempre negativa. Ciononostante, data la frequenza di viaggiatori provenienti da aree endemiche per le malattie altamente infettive e l incremento dell esposizione - causa dei cambiamenti climatici - ad artropodi vettori di malattie infettive emergenti, la ricerca di Tick-Borne virus su campioni in fase acuta e convalescente di malattia è altamente consigliabile. I dati del nostro studio risultano coerenti con quelli del sistema internazionale di validazione di sorveglianza delle encefaliti in tutti i gruppi di età (8). Tale risultato, soddisfacente sia da un punto di vista clinico che diagnostico, è stato possibile grazie all impiego di tecnologie avanzate e all approccio multidisciplinare alle problematiche in studio. CONFLITTO DI INTERESSI Nessuno. BIBLIOGRAFIA 1. Studahl M, Lindquist L, Eriksson BM, et al. Acute viral infections of the central nervous system in immunocompetent adults: diagnosis and management. Drugs 2013;73:131-58. 2. Jeffery KJ, Read SJ, Peto TEA, et al. Diagnosis of viral infections of the central nervous system: clinical interpretation of PCR results. Lancet 1997;349:313-7. 3. Whitley RJ, Alford CA, Hirsch MS, et al. Vidarabine versus acyclovir therapy in herpes simplex encephalitis. N Eng J Med 1986;314:144-9. 4. Tunkel AR, Glaser CA, Bloch KC, et al. The management of encephalitis: clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis 2008;47:303-27. 5. Steiner I, Budka H, Chaudhuric A, et al. Viral encephalitis: a review of diagnostic methods and guidelines for management. Eur J Neurol 2005;12:331-43. 6. Calvario A, Bozzi A, Scarasciulli ML, et al. Herpes Consensus PCR test: a useful diagnostic approach to the screening of viral diseases of the central nervous system. J Clin Virol 2002;25:S71-8. 7. Solomon T, Michael BD, Smith PE, et al. Management of suspected viral encephalitis in adults Association of British Neurologists and British Infection Association National Guidelines. J Infect 2012;64:347-73. 8. Jmor F, Emsley CAH, Fischer M, et al. The incidence of acute encephalitis syndrome in Western industrialised and tropical countries. Virol J 2008;5:134-46. biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 3 207