CITOGENETICA E LA DISCIPLINA CHE STUDIA I CROMOSOMI E LE LORO ALTERAZIONI NUMERICHE E STRUTTURALI http://learn.genetics.utah.edu/content/chromosomes/ u filamenti di DNA e proteine u portatori di informazioni COSA SONO I CROMOSOMI? u ogni cromosoma deve contenere 3 elementi essenziali: centromero, telomeri, origini di replicazione u il DNA è ripiegato secondo un pattern preciso http://www.biology.arizona.edu/human_bio/activities/ karyotyping/karyotyping2.html u il cromosoma che analizziamo è quello metafasico EACH CHROMOSOME CONTAINS 3 ELEMENTS Il cromosoma va incontro a cambiamenti durante il ciclo cellulare Il DNA del cromosoma si ripiega in maniera ordinata 2 nm INTERPHASE CHROMATIN IS PREDOMINANTLY IN THE FORM OF A 30 nm FIBER a c c o r c i a m e n t o x 7 x 6 x 40 x 5 11 nm 30 nm 300 nm 700 nm s p e s s o r e MAR: matrix associated region 1400 nm SAR: scaffold attachment region 1
12/04/15 INTERPHASE CHROMATIN IS PREDOMINANTLY IN THE FORM OF A 30 nm FIBER INTERPHASE CHROMATIN IS PREDOMINANTLY IN THE FORM OF A 30 nm FIBER MAR: matrix associated region SAR: scaffold attachment region 3-20 kb 100-300 kb (TTAGGG) Telomere Associated Repeats (TAR) Unique DNA Unique Telomere FISH Probe LA CITOGENETICA MODERNA NASCE 60 ANNI FA LA CITOGENETICA MOLECOLARE 30 ANNI FA 1879 - cromosomi osservati al microscopio 1888 - coniato il termine cromosoma 1923 - determinato il N di 48 cromosomi umani 1956 - il N viene corretto a 46 1958 - definita la trisomia del 21 1986 - introdotta la tecnica FISH 1992 introdotta la tecnica CGH 1997 introdotta la tecnica CGH array 2
TAPPE PRINCIPALI NELLA PREPARAZIONE DEL CARIOTIPO 1. COLTIVARE LE CELLULE sangue periferico fitoemoagglutinina (stimola la crescita) Come si procede? colchicina (ultimi 30 ) Ipotonica (20 ) 2. BLOCCARLE IN METAFASE 3. ROMPERLE MEDIANTE SHOCK OSMOTICO 4. FISSARE I CROMOSOMI 5. ESSICCARE 6. COLORARE terreno di coltura fissativo pellet risospeso proliferazione 48-96h fissativo centrifugazioni (2-3) centrifugazione risospensione in poco fissativo pellet risospeso centrifugazione allestimento del preparato PIASTRA METAFASICA (bandeggio G) CARIOGRAMMA CARIOTIPO = corredo cromosomico di un individuo (numero di cromosomi ed eventuali anomalie) CARIOGRAMMA = immagine fotografica dei cromosomi metafasici disposti ordinatamente Come si riconoscono i cromosomi? I cromosomi vengono identificati in base: (1) alla loro lunghezza (2) alla posizione del centromero (3) al bandeggio 3
Struttura del cromosoma sub-metacentrico acrocentrico telomeri satelliti telomeri braccio P centromero centromero centromero braccio Q braccio Q braccio Q telomeri telomeri telomeri LA COLORAZIONE DEI CROMOSOMI: IL BANDEGGIO BANDE METODO DI COLORAZIONE G GTG, GAG GIEMSA (dopo trattamento con enzimi proteolitici o soluzioni saline) Q QF, QFQ, QFH QUINACRINA R RHG,RH,RF GIEMSA (dopo trattamento con soluzione RB,RBG,RBA salina calda o arancio di acridina o BrdU combinato con Giemsa o acridina) C CB, CBG GIEMSA (dopo trattamento con idrossido di bario) Ag-NOR, Perche i cromosomi si presentano bandeggiati? CARIOGRAMMA bandeggio G Fissati su un vetrino e colorati con colorante Giemsa assumono un aspetto a strisce perche vengono colorate le regioni di DNA piu ricche in Adenina e Timina. 4
12/04/15 CARIOGRAMMA bandeggio Q Ideogramma dei cromosomi umani Il cromosoma 8 a diverse risoluzioni di bandeggio In base alle dimensioni, i cromosomi umani sono stati numerati da 1 a 22. Esiste, inoltre, una coppia di cromosomi, X e Y, che determina il sesso. 450 bande IDEOGRAMMI DEL CROMOSOMA 1 600 bande 850 bande CARIOGRAMMA bandeggio G 10mm 200 Mb di DNA 5
Cariotipo femminile a 500 bande Cariotipo maschile a 600 bande A cosa serve l analisi del cariotipo? A rivelare alterazioni cromosomiche costituzionali Diagnosi prenatale Diagnosi postnatale A rivelare alterazioni cromosomiche somatiche Diagnosi onco-ematologica DIAGNOSI PRENATALE A chi: Alle gestanti con aumentato rischio di avere un figlio con cromosomopatia Quando: dalla 10a alla 21a settimana di gestazione Come: Con un prelievo di villi coriali (10-11w), liquido amniotico (16-18w), sangue fetale (19-21w). DIAGNOSI POSTNATALE A chi: Ai soggetti, adulti o bambini con: Ritardo mentale e/o dismorfismi Sospetto clinico di trisomia, microdelezione o comunque di malattia cromosomica Alle coppie con problemi di infertilita In soggetti con patologia onco-ematologica per riconoscere mutazioni somatiche Come: Con un prelievo di sangue periferico in eparina QUALI SONO LE ALTERAZIONI RILEVABILI CON L ANALISI CITOGENETICA ANOMALIE NUMERICHE DEI CROMOSOMI POLIPLOIDIE > corredo cromosomico multiplo dell aploide (superiore al diploide) e.g. TRIPLOIDIA ANEUPLOIDIE > le più frequenti aberrazioni numeriche dovute a non-disgiunzione meiotica o post-zigotica monosomie degli autosomi sono incompatibili con la vita poche trisomie sono compatibili con la sopravvivenza aneuploidie dei cromosomi sessuali sono tollerate MOSAICISMI ANOMALIE STRUTTURALI DEI CROMOSOMI RIARRANGIAMENTI STRUTTURALI > delezioni, duplicazioni, traslocazioni, inserzioni, inversioni pericentriche e paracentriche, isocromosomi MARKERS CROMOSOMICI RINGS 6
Cariotipo triploide triploidia Frequenza alla nascita = 1/10.000 Frequenza negli aborti = 1/14 Cariotipo 69,XXY 57% Cariotipo 69,XXX 40% Cariotipo 69,XYY 3% Tipo I, corredo sovrannumerario paterno Feto microcefalico o normale Placenta ingrossata Tipo II, corredo sovrannumerario materno Ritardo di crescita Feto con macrocefalia relativa Placenta poco sviluppata Nati vivi Basso peso Asimmetria cranio-facciale e difetti di ossificazione del cranio Microftalmia, ipertelorismo, micrognazia Sindattilia cutanea, piedi torti Anomalie genitali, ipoplasia delle surrenali Cardiopatie Le aneuploidie I CROMOSOMI SONO CAUSA DI ANEUPLOIDIE CON FREQUENZE DIVERSE Nullisomia Monosomia Disomia Trisomia Tetrasomia Combinazioni delle prcedenti 7
Per comprendere le aneuploidie occorre ricordare mitosi e meiosi MALE AND FEMALE GAMETOGENESIS ARE DIFFERENT Males 1 primary spermatocyte 4 gametes Spermatogonia and stem cells renewed active production of sperm during life Females 1 primary oocyte 1 egg and 2 polar bodies Born with all oocytes ova released between the ages of 12-40 years SPERMATOGENESI E OOGENESI Female human embryo Stages in gonad 2 months gestation oogonia start meiosis 5 months arrest in meiosis I 6 months chromosomes held together by chiasmata By puberty 100,000 remain Maximum 300-400 mature Aneuploidy caused by Non-disjunction during meiosis Non-disjunction failure of homologous chromosomes to separate in anaphase I failure of sister chromatids to separate at meiosis II Anaphase lag Chromosomal loss via micronucleus formation caused by delayed movement of chromosome/chromatid during anaphase results in daughter cell deficient of that chromosome or chromatid 8
Parental origin of aneuploidy Paternal % Maternal % Trisomy 13 15 85 Trisomy 18 10 90 Trisomy 21 5 95 45,X 80 20 47,XXX 5 95 47,XXY 45 55 47,XYY 100 0 Chromosome abnormalities in humans Spermatozoa 10% Mature oocytes 25% Spontaneous miscarriage 50% Live births 0.5-1% Most due to maternal meiotic non disjunction Strongly related to maternal age Natural selection at work COSA E UN MOSAICISMO QUALI SONO LE ALTERAZIONI RILEVABILI CON L ANALISI CITOGENETICA E la coesistenza di linee cellulari con cariotipo alterato e linee cellulari con cariotipo normale in percentuale variabile. La gravità del fenotipo non è necessariamente legata alla percentuale di mosaicismo. COME SI RICONOSCE UN MOSAICISMO A BASSA PERCENTUALE L analisi citogenetica di almeno 12 cloni cellulari in diagnosi prenatale e di almeno 20 cellule in postnatale permette di escludere mosaici superiori al 23% con un livello di confidenza di 0,95. ANOMALIE STRUTTURALI DEI CROMOSOMI RIARRANGIAMENTI STRUTTURALI > delezioni, duplicazioni, traslocazioni, inserzioni, inversioni pericentriche e paracentriche, isocromosomi MARKERS CROMOSOMICI RINGS DELETION DUPLICATION 9
TRANSLOCATIONS RECIPROCAL ROBERTSONIAN INSERTION INVERSION ISOCHROMOSOME RING 10
Quali sono le cause dei riarrangiamenti strutturali? Cariotipo con delezione 5p Sindrome Cri du Chat COSA SONO I MARKERS CROMOSOMICI? Sono piccoli frammenti cromosomici spesso non identificabili con tecniche di citogenetica classica. Si identificano con tecniche di ibridazione in situ (FISH) marker CONSULENZA: Effettuare cariotipo parentale per determinare se il marker è ereditato o de novo. Un marker de novo aumenta molto il rischio di fenotipo patologico RING?? marker 11