INTRODUZIONE AL LABORATORIO BIOTEC CLASSI QUINTE LICEO SCIENTIFICO «I.VERSARI» CESANO MADERNO
OGM: organismo il cui materiale genetico è stato trasformato in modo diverso da quanto avviene in natura Impiego di tecniche di ingegneria genetica (isolamento, modifica, trasferimento da un organismo all altro di sequenze di DNA) Il gene trasferito è un Transgene: rende l organismo ospite capace di esprimere un nuovo carattere. Universalità codice genetico ( tutti gli organismi possono essere OGM) Introduzione MIRATA di nuove caratteristiche
Tecnica DNA ricombinante 1. ISOLAMENTO DEL GENE ESOGENO a) Estrazione di mrna e sintesi cdna b) Isolamento e purificazione del gene dal DNA genomico 2. PREPARAZIONE DEL VETTORE 3. TRASFERIMENTO DEL GENE ALL ORGANISMO OSPITE 4. IDENTIFICAZIONE E SVILUPPO ORGANISMO OGM
Esistono due metodi per isolare geni di interesse In vivo (1973) In vitro (1983) Clonaggio genico PCR (polymerase chain reaction)
ISOLAMENTO DEL GENE a) Estrazione di mrna transcrittasi inversa- cdna Per preparare i cdna a partire da mrna, si utilizza un enzima virale: la trascrittasi inversa (RT). Questa polimerasi, la cui scoperta fruttò il premio Nobel per la Medicina nel 1975 a David Baltimore e Howard Temin, è l unico enzima esistente in grado di generare una copia di DNA a partire da una stampo di RNA e viene usato dai retrovirus come HIV per la replicazione del loro genoma.
Le biblioteche di cdna: conversione degli mrna in cdna (II) La trascrittasi inversa copia il singolo filamento dell mrna, generando un doppio filamento ibrido DNA/RNA. 6
Le biblioteche di cdna: conversione degli mrna in cdna (III) La trascrittasi inversa è in grado di degradare il filamento a RNA, esponendo la singola elica di DNA. 7
Le biblioteche di cdna: conversione degli mrna in cdna (IV) La trascrittasi inversa sintetizza il filamento complementare di DNA, generando un cdna a doppia elica. 8
ISOLAMENTO DEL GENE b) Isolamento del gene direttamente da DNA genomico ENZIMI DI RESTRIZIONE : le endonucleasi di restrizione sono enzimi batterici in grado di legarsi a specifiche sequenze del DNA (generalmente di 4 6 paia di basi) e tagliare la doppia elica all interno della sequenza bersaglio.
Le biblioteche di cdna: gli enzimi di restrizione (II) Il taglio genera estremità che possono essere piatte oppure sporgenti, nel qual caso si definiscono coesive (sticky ends). 10
Gli Enzimi di restrizione Le deossiribonucleasi II (sito-specifiche) sono una classe di enzimi, appartenente alla classe delle idrolasi, che catalizzano il taglio endonucleolitico del DNA per dare frammenti specifici a doppia elica con fosfati terminali al 5'. Questi complessi proteici sono in grado di rompere i legami fosfodiesterici del DNA a doppio filamento La scoperta degli enzimi di restrizione è dovuta a Werner Arber, microbiologo svizzero, insieme a Daniel Nathans e Hamilton Smith. Nel 1978 i tre ricevettero il Premio Nobel in medicina. Ciascun enzima di classe II possiede una propria sequenza bersaglio (detta anche sequenza consenso), che riconosce e taglia. Questa sequenza, solitamente di 4-8 paia di basi, è detta sito di restrizione e permette di tagliare il DNA a livello di quel sito. Si tratta di siti con sequenze palindromiche: se lette secondo la stessa polarità, sono identiche nei due filamenti
In gene esogeno deve essere trasferito all organismo ospite affinchè possa essere trascritto e tradotto nella proteina di interesse. VETTORE Deve possedere un PROMOTORE cioè una sequenza in grado di favorire l attacco della RNA pol e dare inizio alla trascrizione. PROMOTORE
2. PREPARAZIONE DEL VETTORE Requisiti di un buon vettore Deve essere in grado di replicarsi nella cellula ospite Deve avere un gene marcatore (es gene per la resistenza agli antibiotici) Si usano soprattutto i PLASMIDI Il vettore viene tagliato impiegando lo stesso enzima di restrizione usato per il frammento di interesse. Questo genera estremità compatibili La Ligasi salda il frammento al plasmide TALE ENZIMA LEGA COVALENTEMENTE L ESTREMITA 5 FOSFATO DI UNA BASE CON L ESTREMITA 3 FOSFATO DELLA BASE SUCCESSIVA
I vettori di clonaggio I vettori plasmidici contengono un origine di replicazione per potersi duplicare insieme al DNA cellulare, un gene marcatore (resistenza ad un antibiotico) per poter selezionare le cellule che li contengono e siti di taglio unici per enzimi di restrizione. 15
Il sito di clonaggio, in cui viene inserito il segmento di DNA esogeno, è chiamata POLYLINKER o zona di clonaggio multiplo. Contiene un tratto di DNA con sequenze uniche riconosciute come siti di taglio da parte di diversi enzimi di restrizione
polylinker sequenze uniche di riconoscimento per diverse endonucleasi di restrizione che permettono l inserzione del DNA eterologo questo elemento facilita il lavoro di clonaggio permettendo di utilizzare l'enzima di restrizione più conveniente.
Unione del frammento di DNA al vettore Il vettore ricombinante
Trasferimento del gene esogeno all organismo ospite Trasformazione batterica: bisogna favorire l ingresso del plasmide nella cellula ospite Metodo biolistico Elettroporazione Sistemi biologici (batteri/virus)
Introduzione del DNA nella cellula ospite Trasformazione: CaCl2 In E.coli Elettroporazione Impacchettamento e infezione fagica Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato In cellule di eucarioti superiori Liposomi Elettroporazione Microiniezione DNA gun
Identificazione e sviluppo organismo modificato Le cellule geneticamente modificate (ovvero contenenti il vettore) acquisiranno la resistenza all antibiotico portata dal vettore stesso, quindi le cellule sopravvissute conterranno tutti i cdna. Ogni singola cellula originerà un clone di un singolo cdna. L insieme dei cloni sarà la biblioteca a DNA.
Identificazione di un gene di interesse: il Southern Blotting (I) Per identificare il clone della biblioteca che contiene il cdna del gene di nostro interesse si può utilizzare il metodo del Southern Blotting, chiamato così dal suo inventore: Edwin M. Southern. Edwin Southern Immagine:Jane Gitschier (Plos Genetics) 22
Identificazione di un gene di interesse: il Southern Blotting (II) Il Southern Blotting si compone di tre fasi principali: Elettroforesi sul gel di agarosio del cdna separato dal vettore plasmidico estratto dai cloni, dopo digestione con endonucleasi di restrizione. Trasferimento dei frammenti di DNA dal gel ad una membrana di nitrocellulosa. Ibridazione della membrana con un frammento di DNA complementare al cdna di interesse marcato radioattivamente e rilevazione del segnale su lastra fotografica. 23
Elettroforesi su gel di agarosio (I) Il DNA plasmidico (vettore) estratto dai cloni viene digerito con gli stessi enzimi di restrizione usati per il clonaggio. In questo modo il cdna viene separato dal vettore. Poi si prepara una miscela di agarosio all 1% in un opportuno tampone. L agarosio è un polimero naturale che solidifica in un gel a temperatura ambiente. Una vasca piena di gel di agarosio solidificato. Immagine: Joseph Elsbernd via Wikimedia Commons 24
Elettroforesi su gel di agarosio (II) Nel gel vengono lasciate delle fessure (pozzetti) in cui si deposita la miscela contenente vettore e cdna digeriti. 25
Elettroforesi su gel di agarosio (III) Applicando un campo elettrico, il DNA (carico negativamente) migra verso il polo positivo e le molecole si separano in base al peso molecolare (P.M.) secondo la relazione 1/log10 (P.M.). Il vettore (più pesante) correrà più lentamente del cdna (più leggero). 26
Le molecole lineari di dsdna migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.
Trasferimento (blotting) su membrana Il gel contenente il DNA separato, è sottoposto a un trattamento per denaturare il DNA, ovvero aprire i due filamenti. Il gel è poi appoggiato a una membrana di nitrocellulosa: il DNA migra dal gel alla membrana per capillarità o applicando un campo elettrico. La membrana, carica positivamente trattiene il DNA (a singola elica perché denaturato) carico negativamente. 28
Ibridazione (I) La membrana è immersa in una soluzione contenente un frammento di DNA a singola elica complementare al cdna di interesse e recante un atomo di fosforo radioattivo ( 32 P) all estremità 5.Grazie alla proprietà del DNA a singola elica di appaiarsi spontaneamente a una sequenza complementare (ibridazione) la sonda radioattiva si legherà al cdna di interesse. 29
. Ibridazione (II) Il segnale ad alta energia del 32 P viene catturato su una lastra fotografica, permettendo di identificare quale pozzetto conteneva il cdna cercato. Dato che in ogni pozzetto era stato caricato il DNA di un singolo clone, con questa procedura è possibile risalire al clone della biblioteca che contiene il cdna che cercavamo. 30
OGM perché?
Miglioramento genetico tradizionali moderne - Miglioramento genetico mediante incroci - Mutagenesi - Colture di cellule e tessuti - Utilizzo dei marcatori molecolari - Ingegneria genetica (OGM) Tutte tecniche che devono essere usate in sinergia e non in alternativa
Tramite incrocio si cambiando le combinazioni genotipiche sfruttando la variabilità genetica presente nella specie Tramite mutagenesi si può aumentare la variabilità genetica Con la tecnologia del DNA Ricombinante è possibile trasferire caratteri/geni da altre specie
PERCHE SI FANNO GLI OGM Nell elenco che segue sono indicati i settori produttivi e di ricerca in cui le biotecnologie trovano, o potrebbero trovare, varie applicazioni: - farmacologia e medicina (produzione di biofarmaci, molecole utili a fini terapeutici, vaccini e antibiotici, terapia genica, ecc ) -industria alimentare (modificazione del contenuto di zuccheri, amminoacidi, grassi ecc ) -chimica e farmaceutica (enzimi, additivi, alcol, acidi, solventi, detergenti, materie plastiche, reagenti diagnostici, ecc ) -agricoltura, zootecnia e veterinaria (miglioramento genetico per rendere resistenti alle malattie, ai pesticidi e agli stress ambientali, incremento della produzione, ecc ) - protezione ambientale (biorisanamento di ambienti contaminati, depurazione delle acque e dei reflui, ecc ) - energia (estrazione del petrolio presente nelle rocce mediante produzione di sostanze tensioattive che ne favoriscono la separazione, ecc )
Ingegneria genetica nelle piante Le cellule somatiche delle piante sono totipotenti, possono cioè essere indotte a rigenerare una pianta intera Trasformazione di cellule vegetali: per produrre piante transgeniche basta introdurre il gene di interesse in una cellula o pezzo di tessuto somatico che poi verrà stimolato con ormoni vegetali a produrre radici e germogli dando una pianta transgenica Agrobacterium tumefaciens: batterio capace di infettare molti tipi di piante e di produrre un tumore vegetale noto come galla del colletto
Esperimento Cusmibio OBTV: verificare la presenza del gene Bt (trnsgene) in un carico di Mais (Certificato no OGM) ANALISI Campionamento Estrazione DNA e amplificazione con PCR Elettroforesi Analisi risultati Geni spia: cloroplasti/zeina 6 provette (marcatore PM, cloroplasto, zeina, transgene, CP, CN, Blank) Confronto bande corsa elettroforetica