Valutazione e analisi dei dati molecolari 1
21/11/14 Valutazione dei pattern molecolari evidenziati da una delle tecniche di MM traduzione in problema biologico una volta effettuato lo scoring delle bande dai gel i dati sono pronti per essere analizzati in vari modi grazie a software specifici PDF allegato: software for population genetic analyses of molecular marker data Tre principali applicazioni: Tipizzazione e identificazione varietale Caratterizzazione e dissezione della variabilità genetica Costruzione di mappe genetiche e mappaggio genico 2
Robustezza e riproducibilità Alcune delle classi di marcatori più utilizzate (specialmente i RAPD) sono stati criticati per la loro mancanza di robustezza ed affidabilità. Infatti molte riviste non prendono più in considerazione i lavori fatti con i RAPD Recentemente questi problemi sono stati notati per molte classi di marcatori dimostrando che nessuna di esse è perfetta Reliability Al fine di aumentare l affidabilità del dato, molti autori propongono la ripetizione dei vari step dei protocolli (amplificazione ed elettroforesi) per 2 o 3 volte Lo scoring è meno riproducibile del resto, per cui è importante avere due persone che fanno lo scoring in maniera separata Competitive priming = problema dei RAPD che porta all insorgenza di false bande Artefatti dovuti a frammenti riarrangiati a causa di annealing nested e all interazione all interno e fra filamenti di DNA durante la PCR Tra i dominanti gli AFLP sono più affidabili dei RAPD grazie alle condizioni di temperatura più stringenti Differenze nel profilo di amplificazione AFLP tra radici e foglie di uno stesso genotipo ha permesso di evidenziare l importanza della qualità del DNA da analizzare cosi come la dipendenza dal pattern di metilazione dei vari organi 3
Ma in genere questo non è un problema perché difficilmente queste tecniche vengono utilizzate per comparazioni tra laboratori Per contro gli SSR sono considerati il metodo da scegliere per questo scopo Gli SSR vengono considerati molto riproducibili Band homology co-migrazione I marcatori multi-locus sono stati utilizzati in moltissimi studi sulla similarità genetica Assunto: bande che co-migrano rappresentano uno stesso tratto cromosomico Ma non è sempre così.. Si ha Size homoplasy quando 2 o + bande della stessa lunghezza e ottenute con una stessa combinazione di primer, non hanno origine comune Molto comune per i RAPD osservato, però, anche con AFLP per frammenti piccoli molto frequente per SSR a causa dell alto tasso mutazionale e può divenire un problema quando gli SSR si usano per studi fra inter-specifici (es Arabis e Arabidopsis) 4
Band linkage and neutrality Un problema comune a tutti i marcatori è la possibilità che marcatori trattati come indipendenti, in realtà possono essere linked (associati) quindi.. I loro alleli non vengono trasmessi indipendentemente ma a mò di aplotipo Evitabile facendo uno screening delle bande in una popolazione di mappaggio Queste due bande in uno studio di genetica di popolazione tenderebbero a sovrastimare la similarità fra gli individui Fragment sizing and matching Per valutare e comparare i dati molecolari provenienti da campioni diversi è necessario che: bande singole di ciascun campione vengano rilevate individualmente e venga loro assegnata un etichetta (di solito si fa con il peso molecolare) 5
..poi vanno individuate le bande co-migranti (MATCHING) nelle varie corsie (lane) PROBLEMI LEGATI AL FRAGMENT SIZING AND MATCHING Lo scoring va fatto con precisione ed accuratezza e dipenda da: Qualità del DNA Completezza della restrizione Condizioni di elettroforesi Intensità media del segnale Le condizioni di elettroforesi sono molto importanti In quanto la mobilità dei frammenti potrebbe risultare ineguale nel gel Un esempio è dato dal cosiddetto SMILE Lo shift delle bande può causare errori nel band matching Si può ovviare replicando i campioni (cioè due amplificazioni per ogni campione di partenza) e aggiungere il LADDER Quando possibile far correre i campioni da comparare in lane adiacenti Cambio di fluorocromo determina diversa mobilità 6
Fare lo scoring solo delle bande certe (evitare quelle dubbie) Le bande che non è possibile analizzare con la stessa accuratezza in tutto il gel devono essere eliminate Frammenti co-migranti di diversa intensità non devono essere trattati come stessa banda (anche se un fattore 2 potrebbe essere sinonimo di omo/eterozigote) equipment I fingerprint possono essere letti manualmente dal ricercatore oppure con l ausilio di specifici software Manuale: di solito è limitato allo screening di lastre autoradiografiche o fotografie 7
Recentemente una serie di analizzatori d immagine sono stati approvati per l uso in biologia molecolare Es: Gel Quantifier Image Immagine iniziale: Riconoscimento automatico delle lanes: Lane straightening Standards Line Up Removing "Smiles Standards Setting 8
21/11/14 Lane Profiles Data Table ABI GeneScan Lane tracking 9
Scoring automatico Utilizzo di: in-lane molecular weight F C F 1 F 1 Le impronte digitali hanno svolto per decenni un ruolo centrale nei casi di accertamento di identità degli individui si basa sul presupposto che non esistono due individui con impronte identiche si basa sul presupposto che non esistono due individui con impronte identiche Il genoma umano contiene 3x10 9 coppie di basi Il tasso di mutazione è 10-4 e 10-6 Numerose sostituzioni sono silenti (avvengono in zone non codificanti) e quindi tendono ad accumularsi nel genoma durante il corso dell evoluzione 10
Recentemente è stato dimostrato che il genoma umano contiene un gran numero di differenti tipi di polimorfismi del DNA che possono essere usati in casi di attribuzione di paternità Questi polimorfismi possono determinare DNA fingerprint l impronta del DNA Il miglioramento genetico vegetale è da sempre basato sull individuazione e l impiego della variabilità genetica I breeder devono prendere molte decisioni importanti durante i veri step 11
Primo: nel decidere i parentali più appropriati da incrociare e poi. poi nella strategia di selezione utilizzata per identificare gli individui migliori all interno della progenie dell incrocio 12
21/11/14 Ad es. grandi programmi di breeding per le colture annuali possono richiedere lo screening di centinaia di migliaia di linee per produrre ogni paio di anni una sola nuova varietà I field trials possono essere molto dispendiosi e la valutazione di alcuni carattere (es. qualità e stabilità produttiva) difficili da valutare Negli ultimi decenni i marcatori molecolari si sono dimostrati molto utili nel rimpiazzare i saggi biologici L uso dei MM per seguire determinati loci o regioni genomiche è ormai di routine nei programmi di breeding Si conosce la localizzazione cromosomica di molti loci per la resistenza a malattie, tolleranza a stress e per i caratteri di qualità 0 8 12 23 34 66 71 99 103 107 109 Part h. EAG ECA C\MCA A C\M AAT \115 \186 EAG A\M CTG \145 EAG A\M C AC \303 Non solo nelle piante...ma anche in molti animali EC C ECC A\MACA A\M \4 ACT 58 \134 EAG ECA C\MCT ECC C\MAC G\122 AS1 A\MAC A\115 \MA CT\8T\109 2 Per essere utile, un marcatore molecolare deve essere strettamente associato al locus di interesse 13
Scelta della giusta metodologia nella scelta della metodologia da applicare nei propri studi molti sono i punti da considerare: Che tipo di informazione si vuole ottenere? E importantissimo scegliere la giusta tecnica in modo da ottenere la giusta informazione. Per ottenere informazioni sulla genealogia di una popolazione o sulle relazioni filogenetiche, dovrebbero ottenersi delle sequenze o utilizzare metodi basati sulla restrizione del genoma Discriminazione a quale livello tassonomico la variazione genetica viene misurata (entro popolazione, fra specie, fra generi?) il metodo che si sta scegliendo ci permette di avere informazioni dettagliate sul tipo di discriminazione che vogliamo ottenere? Numero di loci vengono richieste informazioni su pochi o molti loci? RFLP, isoenzimi etc danno informazioni su pochi loci mentre RAPD, AFLP etc. danno una panoramica allargata a moltissimi loci. Costo gli isoenzimi sono i più economici seguiti da RAPD e RFLP. Gli AFLP, SAMPL, S-SAP e I metodi basati sul sequenziamento sono i più costosi. Se le sonde, o i primer specifici, non sono precedentemente disponibili, tecniche come SCAR e SSR risultano altamente costose perchè coinvolgono lo sviluppo di primer/sonde prima di poter essere applicate. Velocità I metodi basati sulla PCR danno sicuramente risultati più rapidi laddove i primer sono gia disponibili. I metodi basati sull ibridazione sono invece più lenti. 14
Impieghi I marcatori molecolari possono essere di grande utilità quando utilizzati per verificare il modo di riproduzione (sessuale vs. apomittico) verificare il sistema di unione (autofecondazione vs. fecondazione incrociata), identificare varietà coltivate per stimare le distanze genetiche sia per studi evoluzionistici e tassonomici che caratterizzare germoplasma Caratterizzazione individuale (genotyping) e varietale (DNA fingerprinting) Il primo esempio di DNA fingerprinting in pianta risale al 1988: basato su Southern e RFLP The data (lanes 22,23) show that hypervariable polymorphic patterns can be obtained for barley demonstrating the possibilities for characterizing inter-variety distinctions and identifying varieties 15
L entrata in scena dei metodi basati sulla PCR Rappresenta una pietra miliare nel campo del DNA fingerprinting Ha avuto inizio con due lavori pubblicati nel 1990 e uno nel 1991 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L uso di primer arbitrari si è dimostrata utile nel generare ampliconi anonimi che risultavano in banding pattern polimorfici Dopo alcuni anni sono stati introdotti gli AFLP Caratterizzazione individuale (genotyping) e varietale (DNA fingerprinting) Il fine ultimo del lavoro di miglioramento genetico è quello di ottenere varietà superiori, aventi le caratteristiche desiderate e rispondenti ad un ideotipo prefissato. Il termine varietà indica un insieme di piante coltivate contraddistinte per caratteri morfologici, fisiologici, citologici, chimici, molecolari, ecc. che quando riprodotte, per via sessuale o asessuale, nei modi indicati dal costitutore, conservano i loro caratteri distintivi D.U.S. testing (Distinctiveness, Uniformity, Stability). La nuova varietà deve quindi possedere caratteristiche peculiari che permettano di distinguerla da tutte le altre varietà della stessa specie già iscritte al Registro Nazionale o al Catalogo Comune Europeo delle varietà. 16
21/11/14 Le differenze possono essere di natura fisiologica (ad esempio, epoca di fioritura/spigatura o di maturazione, e presenza/assenza di determinati composti, principi nutritivi e specifiche resistenze) oppure morfologiche (ad esempio, presenza/assenza di peli o di reste, e colore delle foglie o dei fiori). I requisiti di distinguibilità, uniformità e stabilità possono essere verificati con relativa facilità nelle varietà fondate su singole linee pure (varietà di specie autogame) o su singoli genotipi (ibridi semplici, varietà di specie a propagazione vegetativa). Per caratterizzare le varietà di piante coltivate e quindi verificare la loro distinguibilità possono essere impiegati i marcatori biochimici (isoenzimi e proteine di riserva). Da più parti viene auspicato un maggiore uso dei marcatori biochimici e molecolari per la caratterizzazione varietale 17
Il secondo è, invece, basato sul fingerprinting al fine di individuare marcatori polimorfici discriminanti tra varietà in termini di presenza/assenza. In questo ultimo caso i marcatori più affidabili sono probabilmente gli RFLP ma quelli più informativi sembrano essere gli AFLP ed i più riproducibili gli SSR. esempio di caratterizzazione varietale basati sui profili elettroforetici generati dai prodotti di amplificazione. Il DNA fingerprinting è stato introdotto la prima volta nell analisi del genoma vegetale nel 1988 Ryskov et al. distinguono 2 genotipi di orzo utilizzando una sonda M13 su DNA digerito con HaeIII Ryskov et al. (1988). FEBS letter 233:388-392 Patenting e Plant breeders right Le moderne tecniche molecolari di analisi del genoma applicate per la protezione dei Diritti del Costitutore (Plant Breeder Rights). Tuttavia, bisogna tenere presente che la normativa vigente nella UE in materia di brevetti afferma chiaramente che le varietà vegetali costituite secondo i metodi tradizionali di selezione sono escluse da tale sistema di protezione giuridica Per ottenere il PBR si deve dimostrare il DUS Problema: minima distanza genetica fra le varietà Differenze per una singola base non garantiscono l iscrizione della nuova varietà 18
Il sistema di caratterizzazione molecolare finalizzato all identificazione varietale deve essere potenziato per tutelare i costitutori, visto anche che per il principio del libero accesso alle risorse genetiche, possono essere ottenute nuove varietà a partire da varietà già iscritte, note come varietà essenzialmente derivate (essentially derived varieties, EDV) a seguito di reincroci o per ingegneria genetica Sono molto simili a quelle protette ma abbastanza diverse da poter avere un loro proprio nome In questo caso, l accertamento della derivazione e della minima distanza genetica tra le varietà richiederà necessariamente l adozione di metodi di analisi a livello molecolare Scarse possibilità di evidenziare polimorfismi tra originale e EDV Esperimenti replicati in più laboratori per annullare l errore sperimentale DNA fingerprinting può diventare parte di un passaporto della nuova varietà ben descritta Difficilmente rimpiazzerà completamente la caratterizzazione morfologica 19
Casi di studio Caratterizzazione molecolare di varietà locali abruzzesi di olivo (Dritta, Gentile di Chieti e Tortiglione) in prospettiva della tutela degli olii monovarietali Distinte nettamente le varietà locali Dritta Gentile di Chieti Gentile dell Aquila Tortiglione 20
21/11/14 Caratterizzazione della lenticchia di castelluccio C- = canadese e turca G r a d o d i s i m i la r i t à g e n e t ic a 0.9 2 0.9 4 0.9 6 0.9 8 1.0 0 L1 L2 L3 L24 L22 L20 L4 L18 L21 L16 L15 L14 L13 L12 L23 L5 L9 L6 L7 L19 L10 L8 L11 L17 Caratterizzazione popolazioni locali di fave siciliane AZ. DUCA DI MISTERBIANCO AZ. TIMPANARO LOCALE DI MODICA AZ. MANNA AZ. VARVERI AZ. LEONFORTE 21
22 Forensic genetic Omicidio di Gubbio (1997) Tribunale di XXX 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 76 77 78 49 50 51 56 57 55 64 65 66 74 75 73 53 54 52 61 62 63 67 68 70 71 72 79 58 59 60 0.02 E D A B C D C B A XXXXX