FORMARSI AGGIORNARSI CONDIVIDERE. I webinar per gli insegnanti di matematica e scienze

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DNA ricombinante Dalla manipolazione del DNA agli OGM 30 marzo 2016 Relatore: Livia Pirovano Docente distaccata presso il CusMiBi

1) Un po di storia DNA ricombinante 2) Tappe della trasformazione - Isolare il DNA esogeno - Inserirlo nel vettore -Tecniche di trasformazione - Selezione dei trasformati 3) Applicazioni (anche sull uomo) INGEGNERIE GENETICA: produzione di nuove combinazioni di materiale ereditabile, ottenute mediante inserzione di molecole di DNA di qualunque provenienza, in un organismo ospite, nel quale tali molecole non sono presenti naturalmente ma nel quale, una volta acquisite, possono propagarsi indefinitamente. (Governo britannico)

Una pietra miliare 1973: primo esperimento di trasformazione batterica (introduzione di un gene eterologo in E. coli), effettuato da Cohen e Boyer. Essi riuscirono a dimostrare che: Si possono creare plasmidi artificiali in grado di replicarsi autonomamente in E. coli. Non esistono barriere specie-specifiche. Infatti il gene che conferisce resistenza alla penicillina prelevato dal batterio Staphylococcus aureus rimane perfettamente funzionale se clonato in E. coli.

Conferenza di Asilomar 1975 Risultati: linee guida che permettevano di utilizzare solo alcuni tipi di batteri ritenuti sicuri e che imponevano restrizioni sull utilizzo di DNA di mammifero. Cinque anni dopo queste restrizioni furono corrette, permettendo un ampliamento della ricerca sui mammiferi. Striscione di protesta nel 1977 al National Academy of Sciences Forum on Recombinant DNA

Ricadute DNA ricombinante L Università di Stanford depose domanda di brevetto per la procedura di clonazione del DNA. Da queste licenze nacquero 125 prodotti vendute per un totale di 35 miliardi di dollari. Boyer fu uno dei fondatori della Genetech, prima società biotec che sviluppo, insieme alla Eli Lilly, la produzione di insulina umana da batteri Produzione di insulina umana mediante trasformazione di batteri (1982)

Tappe importanti per lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante La scoperta di enzimi per manipolare il DNA in vitro: ENZIMI DI RESTRIZIONE; DNA LIGASI, ecc. Lo sviluppo di molecole di DNA in grado di accettare DNA esogeno e propagarsi poi negli ospiti: VETTORI La messa a punto di metodi per introdurre DNA esogeno attraverso la membrana ospite: TRASFORMAZIONE Metodiche per IDENTIFICARE E ISOLARE le cellule/organismi TRASFORMATI e il prodotto genico Metodiche che consentono di identificare, ISOLARE i GENI di interesse

Scoperta degli enzimi di restrizione*(1962-72) 1 2 1) Il fago inietta il suo DNA nel battere 2) Gli enzimi di restrizione lo tagliano 3) Il genoma batterico è metilato per evitare il taglio 3 * premio Nobel 1978 a W. Arber, H. Smith e D. Nathans

Sito di restrizione (sequenza di basi riconosciuta da un enzima di restrizione) forbici molecolari Lascia estremità a singola elica coesive Taglio sfalsato Taglio netto SI CONOSCONO OLTRE 11.000 ENZIMI Taglio sfalsato Taglio sfalsato sequenze palindrome

DNA ligasi Arthur Kornberg identificò un meccanismo per saldare il DNA, un enzima che egli chiamò DNA ligasi e che riforma il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi. DNA ligasi + ATP Lecienze: 1975 n. 87 Cohen

Enzimi di restrizione + DNA ligasi DNA ricombinante + Plasmide tagliato con EcoRI DNA tagliato con lo stesso enzima EcoRI I DNA si uniscono con legami H perché hanno basi complementari La DNA ligasi salda formando legami covalenti fosfodiesterici

Tappe importanti per lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante La scoperta di enzimi per manipolare il DNA in vitro: ENZIMI DI RESTRIZIONE; DNA LIGASI, ecc. Lo sviluppo di molecole di DNA in grado di accettare DNA esogeno e propagarsi poi negli ospiti: VETTORI La messa a punto di metodi per introdurre DNA esogeno attraverso la membrana ospite: TRASFORMAZIONE Metodiche per IDENTIFICARE E ISOLARE le cellule/organismi trasformati e il prodotto genico Metodiche che consentono di identificare, isolare i GENI di interesse

Plasmidi I vettori di clonaggio in ingegneria genetica Virus Cosmide Inserto fino a 12kb Inserto fino a 25 kb Inserto fino a 45 kb Cromosomi artificiali (YAC o BAC) Inserto fino a 200-2000 kb

COS E UN PLASMIDE Molecola di DNA extracromosomico a doppio filamento circolare contenente geni che conferiscono proprietà particolari (es. resistenza agli antibiotici, ecc.) Si replicano indipendentemente dal cromosoma batterico Microfotografia elettronica del plasmide psc101 isolate dal batterio E.coli e usato da Cohen e Boyer A partire da quelli naturali, sono stati costituiti dei plasmidi artificiali

UN VETTORE PLASMIDICO: puc19 Polylinker: sequenze nucleotidiche riconosciute da vari enzimi di restrizione. Si inserisce all interno del gene lacz + per la betagalattosidasi amp R : marcatore selettivo, conferisce resistenza all ampicillina e permette di selezionare solo i batteri trasformati Ori: origine della replicazione

elettroporazione Metodi di trasformazione

Selezionare i trasformati LB+ antibiotico o erbicida o agente selettivo Si fanno crescere le cellule su un terreno selettivo che permette la crescita solo delle cellule trasformate.

Tappe importanti per lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante La scoperta di enzimi per manipolare il DNA in vitro: ENZIMI DI RESTRIZIONE; DNA LIGASI, ecc. Lo sviluppo di molecole di DNA in grado di accettare DNA esogeno e propagarsi poi negli ospiti: VETTORI La messa a punto di metodi per introdurre DNA esogeno attraverso la membrana ospite: TRASFORMAZIONE Metodiche per IDENTIFICARE E ISOLARE le cellule/organismi trasformati e il prodotto genico Metodiche che consentono di identificare, ISOLARE i GENI di interesse

Isolare il DNA di interesse Genoma umano 3,3 x 10 9 pb Ogni coppia di nucleotidi 1 carattere tipografico

Isolare DNA di interesse A) Sintesi chimica del gene di cui conosciamo la sequenza del gene o della proteina (Sanger negli anni 50 aveva inventato il metodo per sequenziare le proteine e negli anni 70 il metodo per sequenziare il DNA). B) Genoteche a DNA o cdna C) Amplificazione con PCR (sfruttando la conoscenza di geni omologhi)

A) Sintesi chimica del gene della somatostatina Il gene fu sintetizzato a partire da 8 frammenti di DNA, 42 basi codificano per la somatostatina e le altre sono estremità coesive per permettere l inserimento nel vettore e l epressione del gene. Il gene della somatostatina nel plasmide è fuso con il gene della beta galattosodasi che consente la normale trascrizione e traduzione

B) Genoteche genomiche

B) Genoteca a cdna RNasi RNAsi

Selezione clone con gene di interesse 1) Trasferire parte dei cloni su nylon 2) Trattare il nylon con detergenti e NaOh per lisare i batteri e denaturare il DNA 3) Aggiungere la sonda che ibridizza con il gene di interesse 4) Lavaggi e esposizione del nylon a lastra fotografica per identificare il clone che porta il gene

Tappe della trasformazione 1. Isolare il DNA esogeno 2. Inserirlo nel vettore (ligazione) 3. Trasformazione 4. Selezione dei trasformati 5. Controllo

1) Taglio del vettore con enzima di restrizione 2) Inserimento nel vettore 2) Taglio del DNA esogeno con lo stesso enzima di restrizione 3) Miscelare plamide e DNA esogeno e trattare con la DNA ligasi Plasmide ricombinanate

3) Trasformazione batterica www.pinterest.com Attraverso la trasformazione si introduce del DNA estraneo nella cellula batterica Avviene in natura ma MOLTO RARAMENTE Ci sono due metodi artificiali che consentono di introdurre DNA estraneo nei batteri

3) Trasformazione batterica Elettroporazione: Uno shock elettrico rende le membrane cellulari permeabili al DNA Calcium Chloride/Heat-Shock: Cellule competenti assorbono il DNA dopo un trattamento chimico e uno shock termico Tipicamente la resa di trasformazione è di 1 su 10.000 cellule per CaCl 2 ma 1 su 100 per l elettroporazione

3) Trasformazione batterica

3) Trasformazione batterica: Elettroporazione Gli impulsi elettrici ad alto voltaggio destabilizzano la membrana cellulare e inducono la formazione transiente di pori che favorisce l ingresso del DNA Funziona per batteri e cellule animali e vegetali

3) Trasformazione batterica: Calcium Chloride/Heat-Shock 1. Trattamento con CaCl 2 : gli ioni Ca ++ schermano le cariche negative del DNA e le cariche negative dei fosfolipidi di membrana 2. Incubare in ghiaccio: rallenta il movimento delle molecole della membrana Ca ++ Ca ++ Ca ++ 3. Heat-shock:incrementa la permeabilità delle membrane

4) Selezione dei batteri trasformati 1 su 10.000 batteri vengono trasformati mediante heat-shock Per selezionare i batteri trasformati si fanno crescere su un terreno selettivo cioè contenente un antibiotico Batterio Lacz- senza plasmide Batterio Lacz - con plasmide LacZ+ LB + Amp Batterio Lacz- con plasmide e inserto

4) Selezione dei batteri trasformati IPTG= analogo lattosio IPTG: isopropyl- β-d-1- thiogalactopyranoside X-Gal IPTG LB + Amp X-Gal:substrato cromogeno X-Gal:5-bromo-4-cloro-3-indolyl- β galatoside LATTOSIO IPTG Il lattosio è un disaccaride formato da una molecola di galattosio e da una di glucosio unite da un legame β-glucosidico. La β-galattosidasi rompe questo legame X-gal:molecola di glucosio unita a un precursore dell indaco: l enzima-β galattosidasi rompe il legame e si produce il colore blu

4) Selezione dei batteri trasformati lacz + Plasmide senza inserto Plasmide con inserto lacz+ inserto -galactosidasi tetramero (funzionale) Colonie blu -galactosidasi monomero (non funzionale) Colonie bianche LB+ Amp + X-gal + IPTG

Metodi di trasformazione nei vegetali Agrobacterium tumefaciens Particle gun o Biolistico Trasferimento chimico elettrico, microiniezione

Particle gun o biolistico Si spara su diversi tessuti vegetali: foglie, calli, embrioni, cotiledoni, ecc.

Agrobacterium tumefaciens in natura Ormoni vegetali Opine Ti:Tumor inducing contiene geni vir T-DNA: transfer DNA contiene geni per opine e ormoni vegetali Un batterio presente naturalmente nel suolo che infetta molti tipi di piante

Citochinine Agrobacterium tumefaciens in laboratorio Left Border Auxine T-DNA Opine Right Border Geni vir Ti plasmide ORI Catabolismo opine A. tumefancies ricombinante DNA esogeno Plamide ricombinante Si eliminano tutti i geni non utili e si inseriscono tra i left e right border i geni nuovi e gene selettivo Geni nuovi Marcatore di selezione

Come si ottengono piante trasformate 1 2 3 4 4 Terreno con ormoni vegetali Alberts et al. (2002) Molecular biology of the cell

Agricoltura: le PGM: perché si fanno? Resistenza agli insetti, virus, funghi, nematodi Tolleranza agli erbicidi Resistenza a stress: siccità, salinità. Miglioramento della qualità nutrizionale e commerciale Mais Bt Produzione di composto ad uso biomedico e industriale (vaccini, ormoni, enzimi, biocarburanti ) Pomodoro transgenico a maturazione ritardata Golden Rice contiene il precursore della vitamina A

Trasformazione animale Microiniezione ovocita fecondato Elettroporazione in ES Vettore virale in ES (staminali embrionali) Maiale transgenico: produce, nel latte, la proteina C umana (controlla la coagulazione)

Perché trasformare organismi Applicazioni Agricoltura-Zootecnica: piante resistenti a parassiti, tolleranti agli erbicidi, miglioramento qualità nutrizionali e commerciali, resistenti a stress, che producono proteine utili Medicina-Farmacologia: produrre farmaci, vaccini, antibiotici, reagenti diagnostici o per terapie contro il cancro o terapie geniche Bioindustria (chimica, alimentare): produzione di enzimi (es. rennina per i formaggi), solventi, detergenti, materie plastiche, reagenti.. Protezione ambientale: biorisanamento di ambienti contaminati, depurazione delle acque e dei reflui, bioindicatori Energia: batteri che producono sostanze tensioattive che ne favoriscono la separazione del petrolio dalle rocce, biocarburanti

Medicina e Farmacologia Esempi di prodotti in commercio ottenuti medianti OGM Prodotto Uso Anno Insulina diabete 1982 Ormone della crescita nanismo 1985 Interferone cancro, infezioni virali 1986 Antigene Virus rabbia vaccino 1986 Antigene Virus polio vaccino 1987 Antigene Virus epatite vaccino 1987 TPA (tissue plasminogen activator) dissolve i coaguli 1988 Fattore di necrosi tumorale terapia cancro 1989 Fattore VIII emofilia 1989 Eritropoietina anemia 1989 più economici, abbondanti e sicuri

Medicina e Farmacologia Cricetulus griseus CHO: Chinese Hamster Ovary Mammalian cell Microbial Cell Factories 2014, 13:141 400 PROTEINE Yeast: Saccaromyces cerevisiae

Trasformazione cellule umane Terapia in vivo: si introduce direttamente il gene sano nel corpo del paziente. Terapia ex vivo: si modificano le cellule del paziente all esterno e poi si reintroducono. Vettori: virus (disarmati), liposomi, DNA nudo http://stemcells.nih.gov/staticresources/info/scireport/pdfs/f.%20chapter%204.pdf

TERAPIA GENICA Cenni storici: Primi anni 1980: caso Cline (UCLA) - esperimenti non autorizzati in USA- tentativo di inserire geni per la globina in due talassemici (Italia e Israele) 1984: usato vettore retrovirus per trasformare cellule di mammmifero 1990: prima sperimentazione di terapia genica con finalità terapeutiche linfociti ingegnerizzati con ADA introdotti in due bambine con ADA-SCID (Severe Combined Immune Deficiency)

PRIMA TERAPIA GENICA APPROVATA Culver, Anderson, Blaese con le due bambine affette da immunodeficienza trattate con terapia genica 1990 primi pazienti (4 e 9 anni) ad essere trattata con terapia genica al NIH Clinical Center a Bethesda Avevano una mutazione nel gene dell adenosina deaminasi che causa una severa immunideficienza (ADA-SCID). I loro globuli bianchi sono stati prelevati e trasforamati con il gene corretto, usando vettore retrovirale, selezionati e trasfusi. Le due bambine hanno ricevuta diversi tratamenti di terapia genica nell arco di 2 anni e continuavano a ricevere l enzima ADA come proteina ricombinante.

1) Isolamento dei globuli bianchi del bambino Globuli bianchi con linfociti T Retrovirus contente il gene umano ADA 2) Infezione dei globuli bianchi con il vettore retrovirale ADA+ ADA-SCID ImunoDeficienza Combinata Severa 4) Infusione dei globuli bianchi che esprimono il gene ADA nel sistema circolatorio del paziente 3) Crescita delle cellula in coltura e verifica espressione del transgene umano La sintesi di ADA (enzima: adenosina deaminasi) ripristina la funzione immunitaria solo per la durata della vita dei globuli bianchi, perciò il trattamento deve essere ripetuto.

Cenni storici: TERAPIA GENICA Primi anni 1980: caso Cline (UCLA) - esperimenti non autorizzati- tentativo di inserire geni per la globina in due talassemici in fin di vita (Italia e Israele) 1984: usato vettore retrovirus per trasformare cellule di mammmifero 1989: approvazione del primo protocollo di terapia ex-vivo 1990: linfociti ingegnerizzati con ADA introdotti in due bambine con ADA-SCID (Severe Combined Immune Deficiency) 1990-1999: Approvazione di numerosi protocolli clinici con diversi vettori 1999: Primo decesso (Gelsinger) causato da vettori virali - rivalutazione di tutti i protocolli clinici

Settembre 1999: morte di un paziente maschio di 18 anni (Jesse Gelsinger) affetto da deficit di ornitinatranscarbamilasi (OTC). Incapacità di metabolizzare ammonio. La sua mutazione non era severa e poteva vivere seguendo una dieta restrittiva e uso di medicine appropriate. Decorso Clinico: 12h: febbre, trombocitopenia, 18h: stato mentale alterato SIRS (systemic inflammatory responce syndrome) DIC (disseminated intravascular coagulation), multiple organ failure 98h: morte del paziente vettore usato: adenovirus via di somministrazione: arteria epatica Protocollo sbagliato: iniettati un eccesso di adenovirus, lo stesso trattamento aveva portato a morte delle scimmie, Gelsinger non aveva livelli di ammonio così elevati da includerlo nella sperimentazione

TERAPIA GENICA Cenni storici: 2002-05: 20 pazienti trattati con terapia genica per X-linked SCID (Parigi-Londra, Dr. Fischer), con vettore retrovirale. L integrazione retrovirale in punti sensibili del genoma di 5 pazienti causò leucemia e la morte di un paziente. Il 25% dei pazienti trattati con terapia convenzionale muore Fisher Bordignon stem cell Naldini (lentivirus) deve essere assolutamente chiaro che la terapia genica non è LA TERAPIA è un approccio tra tanti

Trials approvati nel mondo dal 1989 al 2015

dsdna non si integra transiente immunogenico ssdna non si integra Poco immunogenico ssrna si integra Cellule in divisione ssrna si integra Anche cellule non in divisione Terapia genica: vettori usati Non immunogenico Bassa efficienza http://www.nature.com/nbt/journal/v29/n2/full/nbt.1769.html

Patologie in studio nei trials di terapia genica

Terapia genica: fasi 2003: approvato in Cina il primo prodotto per terapia genica contro cancro al capo e collo, la GENDICINA è un adenovirus contenente il gene oncosoppressore p53. 2012: approvato in Europa e USA il GLYBERA, un vettore AAV contenente il gene LPL, una lipasi. Terapia genica per la LPL deficiency

Problemi principali della terapia genica Espressione bassa o transitoria Dimensioni dell inserto rispetto alla capacità del vettore Difficoltà a raggiungere alcuni tessuti (es.snc) Risposte immunitarie dell ospite Incapacità ad infettare cellule quiescenti (retrovirus) Mutagenesi inserzionale (con ruolo oncogeno)

DNA editing 2015: scoperta dell anno per Science CRISPR-Cas: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-cas. Scoperto da Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna è un meccanismo di difesa dei batteri dai virus Formato da un RNA guida che indica il punto preciso dove va tagliato il DNA e una proteina che opera il taglio. Con questo metodo si può fare una inserzione oppure una modificazione mirata del DNA dell ospite Molti scienziati, tra cui gli inventori di CRISPR, chiedono una moratoria, in mancanza di regole condivise, sull uso della tecnica su cellule germinali o embrioni umane a scopo terapeutico ma concordano sulla necessità di continuare la sperimentazione

TERAPIA GENICA è ALLA BASE DI ALCUNI FILM Cultura popolare Io sono leggenda è un film del 2007 di Lawrence, tratto dal romanzo di Matheson e gli zombi sono persone infettate da un virus creato per curare il cancro. L alba del pianeta delle scimmie è un film del 2011di Wyatt, in cui la terapia genica con il virus ALZ-112 riguarda la cura dell Alzheimer capace di potenziare i recettori neurali.

Conclusioni Essenziale è CORRETTA INFORMAZIONE in modo da non creare: -eccessive e false aspettative che possono aprire le porte ai ciarlatani (vedi caso stamina) -nell opinione pubblica anticorpi contro la scienza e le sue possibili applicazioni biotecnologiche (vedi OGM e vaccini)

Siti internet http://stemcells.nih.gov/info/scireport/pages/chapter11.aspx http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jgm.2698/full http://www.asgct.org/general-public/educational-resources/faqs http://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db/ http://archiv.ipn.uni-kiel.de/eibe/home.htm http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp http://croptechnology.unl.edu/pages/index.php?featmed=1 http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/molecularbiology.html http://www.biology.arizona.edu/default.html http://learn.genetics.utah.edu https://www.dnalc.org http://www.nature.com/nature/archive/specials.html

1985 trasformare con successo le cellule (coltivate in vitro) di pazienti affetti da ADA con retrovirus 1986 hanno provato l efficienza e la innocuità della trasformazione di cellule del midollo osseo di animali. Il metodo è innocuo ma l efficacia era molto bassa 1988 provano a trasformare colture in vitro di globuli bianchi animali. L esperimento ebbe così successo che il team pensò di applicarlo all uomo. 1990 a due bambine venne applicata con successo la terapia genica con linfociti trasformati 1992 Bordignon usa cellule staminali ematopoietiche per curare la stessa patologia 1993 altri bambini con questa malattia sono stati trattati con terapia genica usando cellule del sangue immature ricavate dal cordone ombellicale, con questo si è ottenuta una maggior durata.

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