RIASSUNTO E SPIEGAZIONE

Simplexa CMV REF MOL2200 Rev. D Saggio basato su PCR in tempo reale per la quantificazione in vitro del citomegalovirus (CMV). Per uso diagnostico in vitro USO PREVISTO Il saggio Simplexa CMV di Focus Diagnostics è destinato alla quantificazione in vitro degli acidi nucleici del citomegalovirus (CMV) in campioni di sangue e/o di plasma mediante il 3M Integrated Cycler. Questo dosaggio, da utilizzarsi insieme all esame clinico e ad altri marcatori di laboratorio della progressione della malattia, è utile nella gestione clinica e nel monitoraggio di pazienti infettati da CMV. Il saggio non è studiato per essere utilizzato come test di screening per la rilevazione della presenza di CMV nel sangue o in emoderivati ed è esclusivamente per uso professionale. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE Il citomegalovirus (CMV) umano, un herpesvirus di tipo beta, appartiene alla famiglia degli herpesvirus umani. 1 L infezione da CMV è comune in tutte le popolazioni umane e il 70% circa degli adulti è sieropositivo agli anticorpi anti-cmv, cioè è stato precedentemente infettato dal virus. L infezione primaria da CMV in individui sani è asintomatica o determina una malattia leggera e aspecifica. Nelle donne in gravidanza l infezione primaria da CMV può causare infezioni congenite del feto o del neonato e nelle persone che ricevono trapianti d organi solidi l infezione primaria può causare una malattia grave. 2,3 Come tutti gli herpesvirus, CMV determina un infezione latente nell ospite dopo guarigione dall'infezione acuta. La riattivazione del virus può avere luogo in caso di immunosoppressione o di altre malattie. CMV è una causa ben nota di morbilità e mortalità nei pazienti immunocompromessi. 4 Per avviare un trattamento preventivo è necessario diagnosticare precocemente la replicazione del CMV misurando i livelli del virus nei pazienti ad alto rischio. Quando viene raggiunto un livello predeterminato del virus nel sangue o nel plasma, prima della comparsa dei sintomi clinici, può essere indicata una terapia antivirale o una variazione dei regimi di immunosoppressione. Una volta effettuata la diagnosi, è fondamentale eseguire un analisi che permetta di monitorare e quantificare la presenza di CMV nel sangue e nel plasma per poter gestire in modo efficiente ed efficace l infezione da CMV in questi pazienti. 5,6 Il saggio Simplexa CMV è stato allineato allo standard OMS per il CMV 7. La carica virale per il saggio CMV Simplexa è riportata in unità internazionali/ml (UI/ml). PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il test è basato su un sistema di amplificazione e identificazione tramite PCR in tempo reale, che sfrutta una sonda-primer bifunzionale fluorescente per il rilevamento del DNA del citomegalovirus nel sangue intero e nel plasma. Il saggio prevede due fasi principali: (1) estrazione del DNA dai campioni ottenuti dai pazienti e (2) utilizzo di una sonda-primer bifunzionale fluorescente che, insieme ad un primer inverso, permette di amplificare un target specifico (per l analita e per il controllo interno). Il saggio fornisce un risultato univoco; per identificare il DNA virale nel campione si utilizza come bersaglio una regione ampiamente conservata del gene UL83 del genoma di CMV. Un controllo interno permette di monitorare il processo di estrazione e rilevare l eventuale inibizione della PCR. Il segnale di amplificazione ottenuto per ogni campione viene messo a confronto con una curva di calibrazione e quantificato.

Simplexa CMV Pagina 2 MATERIALI FORNITI Il kit Simplexa TM CMV di Focus Diagnostics contiene reagenti sufficienti per 100 reazioni. Descrizione del kit Nome del componente REF SIMBOLO CE SULL ETICHE TTA Nome abbreviato Colore del tappo Numero di flaconcin i Reazioni per flaconcin o /kit Volume per flaconcino Simplexa CMV Primer Mix MOL2201 REAG A PM Marrone 2 50/100 50 µl Simplexa Master Mix MOL2000 REAG B MM Verde 2 50/100 200 µl Simplexa Extraction & Amplification Control MOL9001 CONTROL IC IC Blu 3 50/150 250 µl DNA Simplexa CMV Low Positive Control MOL2202 CONTROL + LPC Bianco 6 1/6 200 µl Simplexa CMV High Positive Control MOL2203 CONTROL ++ HPC Rosso 6 1/6 200 µl Componente Simplexa CMV Primer Mix (PM) [miscela di primer] Simplexa Master Mix (MM) [miscela master] Simplexa Extraction & Amplification Control DNA (IC) [DNA di controllo di estrazione e amplificazione] Simplexa CMV Low Positive Control (LPC) [controllo positivo basso] Simplexa CMV High Positive Control (HPC) [controllo positivo alto] Simplexa CMV Barcode Card [card con codice a barre] Descrizione del componente Descrizione Primer marcati con colorante fluorescente specifici per la quantificazione di CMV e per il controllo interno. Fluoroforo sonda Target Eccitazione Emissione Gene bersaglio (colorante) CMV FAM 495 nm 520 nm UL83 gene Controllo interno Q670 644 nm 670 nm A. thaliana gene DNA polimerasi, tampone e dntp Un frammento di DNA di 577 bp derivato dal gene codificante per la N-metiltransferasi della subunità grande della ribulosio-1,5-bifosfato carbossilasi/ossigenasi della pianta di Arabidopsis thaliana. CMV inattivato in una matrice di base di origine umana. CMV inattivato in una matrice di base di origine umana. Parametri specifici per il test. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Simplexa CMV Quantitation Standards REF MOL2210 2. 3M Integrated Cycler con software Integrated Cycler Studio versione 5.0 o superiore 3. Universal Discs (dischi universali) per utilizzo su Integrated Cycler 4. Nastro di copertura per dischi universali 5. a Roche MagNA Pure LC System e materiali di consumo associati. 6. at MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche N. Cat. N. 03038505001) 7. b Strumento biomérieux NucliSENS easymag con reagenti e materiali di consumo associati 8. b Pipetta multicanale Biohit/bioMérieux 9. b Piastra con strip per saggio ELISA 10. Micropipette singole, multicanale e/o a ripetizione con range di accuratezza di 1-10 µl, 10-100 µl e 100-1000 µl 11. Congelatore (scongelamento manuale) impostato tra -10 e -30 C (per la conservazione dei componenti del kit) 12. Frigorifero da 2 a 8 C (per i campioni e i componenti del kit scongelati) 13. Cabina di biosicurezza (cappa a flusso laminare) per le estrazioni 14. Microcentrifuga 15. Miscelatore vortex 16. Puntali sterili monouso RNAsi/DNAsi-free con filtro barriera per aerosol per micropipettatore 17. Provette da 1,5 ml in polipropilene per microcentrifuga (provette RNAsi/DNAsi-free consigliate, ma non necessarie) e rack dedicato 18. Guanti monouso senza talco 19. Acqua priva di nucleasi, usata durante l estrazione e come No Template Control (NTC, controllo privo di templato) 20. Rack di raffreddamento per provette da microcentrifuga da 1,5 ml a Da utilizzarsi con la metodica di estrazione Roche MagNA Pure LC b Da utilizzarsi con la metodica di estrazione biomérieux easymag

Simplexa CMV Pagina 3 PERIODO DI VALIDITÀ E MANIPOLAZIONE 1. Conservare i reagenti ad una temperatura compresa tra -10 e -30 C (non usare un congelatore no-frost). 2. Prima dell uso, lasciare scongelare i reagenti a temperatura ambiente (tra 18 e 25 C circa). 3. Non utilizzare i kit o i reagenti dopo la data di scadenza. 4. Utilizzare la miscela di reazione entro un ora dalla preparazione. Conservare la miscela di reazione tra 2 e 8 C fino al momento dell impostazione della PCR. 5. Una volta scongelati, conservare la miscela di primer, la miscela master e il DNA del controllo di estrazione e amplificazione a una temperatura compresa tra 2 e 8 C per non oltre 30 giorni. 6. Non ricongelare la miscela di primer, la miscela master, il DNA del controllo di estrazione e amplificazione o i controlli positivi. 7. Non utilizzare insieme reagenti provenienti da lotti di kit differenti. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Tutti i materiali di origine umana devono essere trattati come potenzialmente infettivi. I materiali di partenza da cui è stato derivato questo prodotto (inclusi i controlli) sono stati sottoposti a screening per l antigene di superficie dell epatite B e per la presenza di anticorpi contro l epatite C e HIV-1/2 (AIDS) tramite metodi approvati dalla FDA, e sono risultati negativi ai test. Siccome, però, nessun metodo conosciuto offre la totale certezza che i prodotti derivati da sangue umano non possano trasmettere questi o altri agenti infettivi, tutti i controlli, i campioni di siero e l attrezzatura che venga a contatto con questi campioni devono essere considerati potenzialmente infettivi e devono essere decontaminati o smaltiti seguendo le precauzioni necessarie per i materiali che pongono un rischio biologico. I CDC (Centers for Disease Control) e i National Institutes of Health statunitensi raccomandano di manipolare gli agenti potenzialmente infettivi in strutture con un livello di biosicurezza 2. 8,9 2. Durante la manipolazione dei reagenti del kit, indossare dispositivi di protezione individuale quali, in modo non limitativo, guanti e camice da laboratorio. Lavarsi bene le mani una volta terminato il test. 3. Non pipettare con la bocca. 4. Non fumare, bere, mangiare, manipolare lenti a contatto o truccarsi nelle aree in cui siano in utilizzo i reagenti del kit e/o campioni umani. 5. Smaltire i reagenti del kit non utilizzati e i campioni umani in base alle normative locali, provinciali e nazionali. 6. Il flusso di lavoro in laboratorio deve procedere in maniera unidirezionale, partendo dalle aree di preamplificazione e spostandosi poi nell'area di amplificazione/rilevamento: segue la sequenza di operazioni da eseguire dall estrazione del campione fino all amplificazione con PCR in tempo reale: Iniziare con l estrazione del campione, quindi configurare lo strumento per la PCR in tempo reale, preparare i reagenti e infine eseguire l amplificazione mediante PCR in tempo reale. Non effettuare spostamenti di forniture e apparecchiature tra un area e l altra. Le forniture e le apparecchiature usate per la preparazione dei campioni non devono essere impiegate per le attività di preparazione dei reagenti o per processare DNA amplificato o altre fonti dell acido nucleico bersaglio. Tutte le forniture e le apparecchiature per l amplificazione devono essere sempre tenute nell area dedicata alla strumentazione per PCR in tempo reale. I dispositivi di protezione individuale, quali guanti monouso e camici da laboratorio, devono essere specifici per ogni area. 7. La contaminazione dei campioni dei pazienti o dei reagenti può determinare risultati errati. Utilizzare tecniche asettiche. 8. Pipettare e manipolare i reagenti con cautela per evitare di mescolare i campioni con quelli dei pozzetti adiacenti. 9. Utilizzare tecniche di pipettamento adeguate e mantenere lo stesso tipo di tecnica per l'intera procedura per assicurare valori ottimali e riproducibili. 10. Non sostituire o miscelare reagenti provenienti da lotti di kit diversi o di altri produttori. 11. Non scambiare i tappi dei flaconcini di reagente. Questo può comportarne la contaminazione e compromettere i risultati del test. 12. Utilizzare unicamente il protocollo descritto nel presente foglio illustrativo. Ogni deviazione dal protocollo o l uso di tempi o temperature diversi da quelli specificati possono comportare risultati errati. 13. L impostazione del saggio deve essere eseguita a temperatura ambiente (in un intervallo compreso tra 18 e 25 C). Mentre si miscelano i reagenti, mantenere freddi gli enzimi utilizzando un blocco refrigerante. 14. Non riutilizzare dischi universali già esposti ai campioni dei pazienti o ai reagenti. 15. Smaltire i dischi usati senza rimuovere il nastro di copertura. 16. Se sullo stesso disco sono configurati diversi kit o lotti Simplexa, testare i controlli positivi e i controlli no template di ogni kit. 17. La miscela master contiene una percentuale di glicerolo >1%, che può causare irritazione in caso di inalazione o contatto con la pelle. In caso di inalazione o contatto con la pelle, adottare le misure di primo soccorso. Osservare le consuete misure precauzionali quando si manipolano sostanze chimiche. Il prodotto non è soggetto all obbligo di codifica in base alle direttive sui materiali pericolosi. 18. Si sconsiglia la conservazione protratta dei campioni estratti a temperature comprese tra 2 e 8 C, poiché non sono stati effettuati test per stabilire le prestazioni del dosaggio in queste condizioni. 19. Se la confezione o il suo contenuto appaiono rotti o danneggiati, non usarli e contattare Focus Diagnostics. I recapiti si trovano nell ultima pagina di questo documento.

Simplexa CMV Pagina 4 ISTRUZIONI PER L USO A. RACCOLTA DEI CAMPIONI I tipi di campione accettabili sono sangue intero o plasma prelevati tramite puntura venosa. Non utilizzare, per la raccolta del campione, provette contenenti l anticoagulante eparina. L eparina inibisce la PCR. B. AREA DI ESTRAZIONE DEI CAMPIONI Operare in un area dedicata all estrazione dei campioni e dei controlli. La preparazione dei campioni per l'estrazione deve essere eseguita in una cabina di biosicurezza. Estrazione mediante il metodo Roche MagNA Pure LC 1. Estrarre gli acidi nucleici dai campioni dei pazienti e dai controlli del dosaggio utilizzando il kit Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid Isolation e lo strumento Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Per eseguire l estrazione degli acidi nucleici utilizzando questo kit, fare riferimento alle istruzioni per l'uso del produttore. 2. Nel menu a discesa Protocol [Protocollo] sul sistema MagNA Pure LC, selezionare Total NA [Acidi nucleici totali], quindi Total NA Variable_elution_volume.blk dall elenco. In questo modo verranno caricate le impostazioni adeguate per la sessione. 3. Il Sample Protocol [Protocollo campione] deve essere Total NA Variable_elution_volume. 4. Impostare il Sample Volume [Volume campione] su 200 µl e il volume di eluizione su 50 µl. 5. Impostare il volume di diluizione su zero per tutti i campioni. 6. Verificare che il Post Elution Protocol [Protocollo post-eluizione] sia impostato su None [Nessuno]. 7. Verificare che i campioni e i controlli siano correttamente posizionati sulla cartuccia campione. 8. Miscelare ciascun campione e il controllo positivo alto (HPC) e basso (LPC) per 2-4 secondi con il vortex, quindi centrifugare brevemente per far sì che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 9. Pipettare 200 µl di ciascun campione, di LPC, di HPC e del controllo no template nella posizione corrispondente della cartuccia campione. 10. Controllare visivamente il livello dei campioni e dei controlli nella cartuccia campione per accertarsi che i campioni siano stati effettivamente aggiunti. 11. Miscelare 2 volte con colpi di vortex il controllo interno di estrazione ed amplificazione (IC) e centrifugare brevemente per far scendere il contenuto sul fondo della provetta. 12. Per ciascun set di 16 campioni (campioni 1-16), pipettare 100 µl di controllo interno in 6 ml di tampone di lisi in una provetta conica. Miscelare brevemente con il vortex. Aggiungere al vassoio corretto sullo strumento di estrazione MagNA Pure. o Se per esempio si estraggono più di 16 campioni (campioni 17-32), pipettare 200 µl di controllo interno in 12 ml di tampone di lisi in una provetta conica. Miscelare brevemente con il vortex. Aggiungere al vassoio corretto sullo strumento di estrazione MagNA Pure. 13. Trasferire la cartuccia campione sullo strumento MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor e avviare la sessione di estrazione. 14. Una volta completata l estrazione degli acidi nucleici, la cartuccia contenente i controlli e i campioni dei pazienti estratti può essere rimossa dal MagNA Pure e sigillata. Conservare il DNA estratto ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C fino al suo utilizzo. Si sconsiglia di conservare i campioni estratti a questa temperatura per lunghi periodi. Mantenere i campioni di DNA estratti su un blocco refrigerante durante il caricamento del disco. Estrazione mediante il metodo biomérieux NucliSENS easymag 1. Per il funzionamento dello strumento e del software, fare riferimento al manuale d'uso NucliSENS easymag. 2. Sul software NucliSENS easymag, scegliere Generic template [Templato generico] con le seguenti impostazioni: Default Request [Richiesta Generic 2.0.1 (or equivalent) [o equivalente] predefinita]: Run Name Prefix [Prefisso nome (as appropriate) [come appropriato] sessione]: Sample ID prefix [Prefisso ID (as appropriate) [come appropriato] campione]: Sample Type [Tipo di campione]: Primary [Primario] Workflow Defaults [Valori On-board lysis Incubation [Incubazione di lisi integrata] predefiniti flusso di lavoro]: On-board Silica Incubation [Incubazione silice integrata] Reagent Tracking [Tracciamento reagenti]: Sample Addition Guidance Off [Aggiunta assistita campione disattivata] Lysis, Silica, Internal Control reagent tracking disabled [Tracciamento reagenti di lisi, silice, controllo interno disattivato]

Simplexa CMV Pagina 5 3. Inserire le informazioni sul singolo campione nella schermata Extraction Request [Richiesta estrazione] come indicato di seguito. Sample ID [ID campione]: (Enter sample name) [Inserire il nome del campione] Request [Richiesta]: Generic 2.0.1 (or equivalent) [o equivalente] Volume (ml): 0,200 Eluate [Eluato] (µl): 50 Type [Tipo]: Primary [Primario] Priority [Priorità]: Normal [Normale] Matrix [Matrice]: Other [Altro] 4. Creare una Extraction Run [Sessione di estrazione] nel software NucliSENS easymag in base al manuale d'uso. 5. Miscelare ciascun campione e il controllo positivo alto (HPC) e basso (LPC) per 2-4 secondi con il vortex, quindi centrifugare brevemente per far sì che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 6. Pipettare 200 μl di campione, di LPC, HPC o del controllo no template nei contenitori dei campioni. 7. Miscelare il controllo interno due (2) volte con colpi di vortex e centrifugare brevemente per far scendere il contenuto sul fondo della provetta. 8. Pipettare 5 µl di controllo interno in ogni campione e in tutti i pozzetti di controllo. Sostituire il puntale tra un campione e l altro. 9. Caricare i contenitori dei campioni, i nuovi materiali monouso per l'aspiratore e i reagenti sullo strumento easymag in base al manuale d'uso. 10. Avviare la lisi integrata e incubare i campioni lisati per 10 minuti prima di aggiungere la miscela di silice magnetica. 11. Durante il periodo di incubazione della lisi, preparare la miscela di silice magnetica. Mescolare la silice e diluire in acqua priva di nucleasi aggiungendo 1 parte di silice magnetica a 3 parti di acqua priva di nucleasi (per esempio, 270 μl di silice magnetica + 810 μl di acqua priva di nucleasi). Preparare un minimo di 135 μl di miscela di silice magnetica per campione. 12. Per trasferire la miscela di silice nei pozzetti della strip per ELISA, mescolare la miscela di silice magnetica e usare 1 puntale e la modalità operativa P2 della pipetta Biohit. Premere Start [Inizia].per aspirare 1050 μl di miscela di silice magnetica, quindi premere di nuovo Start [Inizia] scartando il primo colpo nella provetta della miscela di silice. Premere Start [Inizia] per erogare 125 μl di miscela di silice magnetica negli 8 singoli pozzetti della strip per ELISA. Se necessario, ripetere per le altre strip per ELISA. 13. Dopo i 10 minuti dell'incubazione di lisi, utilizzare 8 puntali (per ogni strip per ELISA) e la modalità operativa P3 della pipetta Biohit per trasferire 100 μl di miscela di silice magnetica nel contenitore di ogni campione. Posizionare i puntali nei pozzetti delle strip per ELISA e premere Start [Inizia] per miscelare e aspirare la miscela di silice magnetica. 14. Trasferire la miscela di silice magnetica nell appropriato contenitore del campione e posizionare il puntale nel campione al di sotto del livello del liquido. Premere Start [Inizia] per aspirare, distribuire e mescolare (x3) la silice magnetica e i campioni. Assicurarsi che il puntale rimanga sotto il livello del liquido, per garantire una miscelazione corretta. 15. Ripetere i passaggi 13 e 14 negli altri contenitori dei campioni. 16. Dopo l'aggiunta della miscela di silice magnetica a tutti i contenitori dei campioni, avviare la sessione di estrazione. 17. Al termine della sessione, togliere i contenitori dei campioni dallo strumento. Se i campioni non devono essere utilizzati subito, trasferirli in provette singole per ridurre al minimo la possibilità che la silice magnetica ricada nel campione. Conservare il DNA estratto a una temperatura compresa tra 2 e 8 C fino al suo utilizzo. Si sconsiglia di conservare i campioni estratti a questa temperatura per lunghi periodi. Tenere il DNA estratto su un blocco refrigerante durante il caricamento del disco. C. IMPOSTAZIONE DELLO STRUMENTO PER PCR IN TEMPO REALE 1. Fare riferimento al Manuale dell operatore dell Integrated Cycler per informazioni dettagliate su come configurare il software Integrated Cycler Studio e aggiungere una definizione dell analisi, impostare le sessioni e analizzare le sessioni compiute con l Integrated Cycler. Nota: Prima di eseguire una sessione predittiva, deve essere definita una curva standard valida (sessione di calibrazione). D. AREA DI PREPARAZIONE REAGENTI Area dedicata alla preparazione della miscelazione di reazione per il dosaggio Simplexa CMV. 1. Lasciare scongelare la miscela di primer e la miscela master a temperatura ambiente (tra 18 e 25 C circa). Ogni flaconcino compreso nel kit contiene reagente sufficiente per 50 reazioni. Prima di ogni uso, mescolare delicatamente la miscela di primer e la miscela master, quindi centrifugare brevemente in modo che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 2. Preparare il volume richiesto di miscela di reazione in una provetta in polipropilene per microcentrifuga di dimensioni adeguate, pipettando il volume di ogni componente come indicato nella tabella sotto. Volumi della miscela di reazione Miscela di reazione Miscela di reazione Reagente Volume / 1 reazione Volume / 10 reazioni Simplexa Master Mix 4,0 µl 40 µl Simplexa CMV Primer Mix 1,0 µl 10 µl Volume totale 5,0 µl 50 µl 3. Mescolare delicatamente la miscela di reazione pipettando 8-10 volte. 4. Centrifugare brevemente in modo che il contenuto raggiunga il fondo della provetta.

Simplexa CMV Pagina 6 5. Procedere all impostazione della PCR. 6. Utilizzare la miscela di reazione entro un ora dalla preparazione. Se l impostazione della PCR non viene eseguita immediatamente, conservare la miscela di reazione preparata ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C. E. AREA DI AMPLIFICAZIONE MEDIANTE PCR IN TEMPO REALE Operare in un area dedicata alla preparazione del Universal Disc a 96 pozzetti per il saggio Simplexa CMV. 1. Aggiungere 5,0 µl di miscela di reazione a ogni pozzetto. 2. Aggiungere 5,0 µl dei controlli positivi estratti ai pozzetti HPC e LPC. 3. Aggiungere 5,0 µl del campione paziente estratto al giusto pozzetto S. 4. Aggiungere 5,0 µl del controllo no template estratto al pozzetto NTC. 5. Coprire il disco con il Universal Disc Cover Tape. 6. Aprire il coperchio dell Integrated Cycler. 7. Posizionare il Universal Disc sigillato sulla piastra. 8. Chiudere delicatamente il coperchio. 9. Fare clic su Run [Esegui]. 10. Fare clic su Start [Inizia]. F. ANALISI DEI DATI 1. Fare riferimento al Manuale dell operatore dell Integrated Cycler per informazioni dettagliate su come eseguire l analisi dei dati e su come esportare le sessioni, se necessario. CONTROLLO DI QUALITÀ Ogni laboratorio deve stabilire i propri intervalli per il controllo qualità e la frequenza di tali controlli, in base alle leggi e ai regolamenti locali applicabili e alle buone pratiche di laboratorio standard. REFERTAZIONE DEI RISULTATI 1. Validità della sessione Determinare se la sessione è valida esaminando i risultati per CMV e per il controllo interno (IC) per i pozzetti del controllo positivo basso (LPC), del controllo positivo alto (HPC) e del controllo no template (NTC). Perché la sessione sia valida, tutti e tre i controlli devono soddisfare i criteri di accettabilità. Se la sessione non è valida, tutti i campioni dei pazienti devono essere nuovamente analizzati. Criteri di accettabilità DNA del controllo di estrazione e Controllo CMV amplificazione (IC) No Template Control (NTC) Non rilevato Rilevato Low Positive Control (LPC) Entro i valori di tolleranza indicati Non applicabile sull etichetta specifica per il lotto High Positive Control (HPC) Entro i valori di tolleranza indicati Non applicabile sull etichetta specifica per il lotto L NTC soddisfa i criteri di accettabilità se CMKV non viene rilevato e il controllo interno viene rilevato. La rilevazione di CMV nell NTC indica che i campioni potrebbero aver subito una contaminazione durante il processamento. L LPC soddisfa i criteri di accettabilità se al suo interno CMV viene rilevato entro i valori di tolleranza (come indicato sull etichetta specifica per il lotto); il controllo interno dovrebbe essere rilevato, ma ciò non rappresenta un requisito indispensabile. L HPC soddisfa i criteri di accettabilità se al suo interno CMV viene rilevato entro i valori di tolleranza (come indicato sull etichetta specifica per il lotto); il controllo interno dovrebbe essere rilevato, ma ciò non rappresenta un requisito indispensabile. 2. Interpretazione dei risultati Interpretazione dei risultati Esempio Valore CMV Valore IC* Interpretazione 1 Non rilevato Rilevato CMV non rilevato CMV rilevato, sotto il limite inferiore di quantificazione (LLoQ, 2 < 713 UI/ml N/A Lower Limit of Quantitation). 3 X UI/ml N/A CMV rilevato ad una specifica concentrazione. 4 > 3,96 x 10 8 CMV rilevato, al di sopra del limite superiore di UI/ml N/A quantificazione (ULoQ, Upper Limit of Quantitation). 5 Non rilevato Non rilevato Non valido, estrarre nuovamente e ripetere. 3. Validità dei risultati ottenuti per i campioni

Simplexa CMV Pagina 7 Un campione è considerato valido se, alternativamente, 1. CMV non viene rilevato e il controllo interno è rilevato. 2. CMV è rilevato. Non è necessario che il controllo interno sia rilevato per risultati positivi per CMV. 3. Per ogni risultato si dovrà esaminare la curva di amplificazione, con particolare attenzione a quelli per cui venga visualizzato il messaggio Data Quality [Qualità dei dati]. Una curva di amplificazione valida mostra un aumento esponenziale uniforme. Fare riferimento al manuale dell operatore per le azioni consigliate. LIMITAZIONI 1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Solo per l'esportazione. 3. Il test deve essere eseguito solo da personale adeguatamente formato e che abbia acquisito familiarità con le procedure d esame e l'interpretazione dei risultati. 4. Il software 3M Integrated Cycler Studio mantiene in memoria il file dell'ultima calibrazione valida per quantificare i campioni ottenuti dai pazienti. L estrazione deve essere eseguita utilizzando per gli standard di quantificazione e i campioni ottenuti dai pazienti la stessa metodica; in caso contrario, si possono ottenere risultati errati. 5. Quando il test venga usato per il monitoraggio di un paziente, deve essere mantenuto lo stesso metodo di estrazione per tutte le determinazioni, altrimenti i risultati potrebbero non essere comparabili. 6. Tutti i risultati derivanti da questo e da altri test devono essere messi in correlazione con l'anamnesi clinica, i dati epidemiologici e gli altri dati in possesso del medico che esamina il paziente. 7. La prevalenza dell infezione influisce sul valore predittivo del test. 8. Come accade per altri test, un risultato negativo non esclude la presenza di infezioni da CMV. 9. Si possono avere risultati falsi negativi quando il microrganismo infettante presenti mutazioni nuove, inserzioni, delezioni o riarrangiamenti del genoma. 10. Si possono avere risultati falsi negativi se il campione contiene un numero inadeguato di microrganismi a causa di basse cariche virali, prime fasi della malattia, prelievo, trasporto o manipolazione non corretti. 11. Come accade per altri test, si possono avere risultati falsi positivi. In alcuni scenari, può essere indicato ripetere il test o eseguirlo con un dispositivo differente. 12. Le prestazioni di questo test nello screening del sangue o degli emoderivati per la rilevazione di CMV non sono state definite. 13. Questo test non può escludere la presenza di malattie causate da altri patogeni batterici o virali.

Simplexa CMV Pagina 8 CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI COMPARAZIONE DEI METODI Il confronto con un dispositivo provvisto di marcatura CE è stato eseguito usando un analisi di regressione lineare di Passing- Bablok sull intervallo di linearità dei due saggi. I parametri di regressione lineare (pendenza e intercetta) all intervallo di confidenza del 95% sono stati calcolati con il metodo di Passing-Bablok.

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Simplexa CMV Pagina 10 RIPRODUCIBILITÀ Gli studi di riproducibilità sono stati condotti usando un pannello costituito da campioni di plasma e di sangue intero preparati ad hoc e addizionati con diverse concentrazioni di un ceppo di CMV. Il pannello conteneva un insieme di campioni negativi (matrice non addizionata), positivi bassi (da 2 a 4 volte circa il LOD), positivi medi (da 8 a 10 volte circa il LOD) e positivi alti (prossimi all intervallo di rilevazione superiore del saggio) per ogni matrice. In aggiunta a questo, si sono inclusi nel pannello tutti i livelli di calibratore ottenuti da un unico lotto di standard di quantificazione per CMV (n = 5) per analizzarli come sconosciuti. Il pannello del campione (n=13) includeva il controllo positivo basso (LPC), il controllo positivo alto (HPC) e un controllo no template (NTC) ed è stato estratto una volta al giorno per ogni operatore con la strumentazione MagNA Pure LC, usando il kit MagNA Pure Total Nucleic Acid Isolation e il sistema NucliSENS easymag, con i corrispondenti reagenti. Il pannello di DNA estratto è stato in seguito analizzato in quattro replicati mediante lo strumento Integrated Cycler. La tabella seguente riepiloga i risultati. Riproducibilità quantitativa - QCMV Componenti della deviazione standard Tipo di campione Nome del campione Metodo di estrazione Livello di concentrazion e atteso (UI/ml) Log del livello di concentrazion e atteso (UI/ml) Media geometrica osservata (UI/ml) Media logaritmica osservata (UI/ml) N. di risultati misurabili Tra strumenti Tra giorni Tra sessioni Nella stessa sessione Totale CONTROLLI PLASMA QS SANGUE INTERO HPC LPC REPRO 6 REPRO 7 REPRO 8 REPRO 2 REPRO 3 REPRO 4 REPRO 5 REPRO 10 REPRO 11 REPRO 9 MagNA Pure 2,00E+06 6,300 80 0,060 0,000 0,056 0,029 0,087 2,00E+06 6,301 2,53E+06 6,402 80 0,022 0,039 0,042 0,016 0,064 MagNA Pure 2,00E+04 4,301 80 0,000 0,000 0,090 0,066 0,112 2,00E+04 4,301 2,14E+04 4,330 80 0,000 0,024 0,045 0,037 0,063 MagNA Pure 1,05E+08 8,021 80 0,048 0,034 0,064 0,023 0,090 5,00E+07 7,699 3,19E+08 8,504 72 0,000 0,053 0,050 0,026 0,077 MagNA Pure 9,72E+03 3,988 80 0,094 0,033 0,063 0,063 0,133 7,10E+03 3,851 3,42E+04 4,534 80 0,000 0,033 0,069 0,036 0,084 MagNA Pure 3,11E+03 3,493 80 0,121 0,042 0,000 0,150 0,197 2,84E+03 3,453 1,26E+04 4,099 80 0,000 0,000 0,065 0,036 0,075 MagNA Pure 2,18E+07 7,338 80 0,000 0,000 0,056 0,020 0,059 2,05E+07 7,312 2,02E+07 7,305 80 0,011 0,018 0,023 0,015 0,035 MagNA Pure 2,24E+05 5,351 80 0,000 0,000 0,046 0,025 0,053 2,10E+05 5,322 2,06E+05 5,313 80 0,013 0,000 0,027 0,023 0,037 MagNA Pure 2,15E+04 4,333 80 0,047 0,000 0,040 0,079 0,100 1,87E+04 4,272 1,91E+04 4,282 80 0,000 0,000 0,029 0,047 0,055 MagNA Pure 4,25E+03 3,629 80 0,000 0,000 0,000 0,138 0,138 4,74E+03 3,676 5,13E+03 3,710 80 0,000 0,022 0,029 0,088 0,095 MagNA Pure 1,47E+04 4,168 80 0,085 0,000 0,090 0,069 0,142 7,10E+03 3,851 4,08E+03 3,611 77 0,060 0,071 0,322 0,093 0,348 MagNA Pure 5,97E+03 3,776 80 0,069 0,000 0,099 0,101 0,157 2,84E+03 3,453 2,23E+03 3,348 73 0,126 0,118 0,162 0,117 0,264 MagNA Pure 1,22E+08 8,087 80 0,083 0,068 0,066 0,038 0,132 5,00E+07 7,699 3,78E+07 7,578 80 0,137 0,000 0,231 0,016 0,269 L NTC, il plasma negativo, il sangue intero negativo e uno standard di quantificazione sono stati analizzati nel quadro del pannello di riproducibilità e sono risultati tutti riproducibili ma fuori dall intervallo riportabile del saggio e quindi non inclusi nella riproducibilità quantitativa.

Simplexa CMV Pagina 11 SENSIBILITÀ ANALITICA / LIMITE DI RILEVAZIONE I campioni LoD usati per questo studio erano stati ottenuti ad hoc da uno stock a concentrazione nota di un ceppo di CMV addizionato a matrici di plasma e sangue intero risultate clinicamente negative. Il pannello includeva una matrice negativa non addizionata e diverse concentrazioni di CMV prossime al LoD previsto, determinato in un analisi di verifica. Lo studio è consistito in diverse sessioni di valutazione del LoD del kit sperimentale Simplexa CMV, usando due metodi di estrazione. Per determinare il LoD sono state eseguite 3 diverse estrazioni e sessioni di PCR. Ogni campione estratto è stato testato in otto replicati (un estrazione, 8 pozzetti) insieme ai controlli (in singolo replicato). In totale, ogni membro del pannello è stato testato in 24 replicati. La concentrazione più bassa che ha fornito un tasso di rilevamento 95% secondo l analisi Probit era il LoD. Il protocollo LoD è stato eseguito per ogni tipo di campione, con ciascuno dei due metodi di estrazione. I singoli valori del LoD sono illustrati nella tabella seguente. Il LoD del saggio CMV basato sul LoD più elevato per tutti i tipi di campione e di metodi di estrazione è risultato pari a 711 UI/ml. Plasma Sangue intero MagNA Pure EasyMag MagNA Pure EasyMag UI/ml 711 99* 568 585 Copie/ml 180 25* 145 148 *Il LoD di questo tipo di campione è stato determinato come la concentrazione più bassa con rilevamento >95% su 24 replicati. LIMITE INFERIORE DI QUANTIFICAZIONE (LLoQ, Lower Limit of Quantitation) Il LLoQ è stato definito come il valore di concentrazione più basso per il quale la deviazione standard era 0,3 log UI/ml per tutti i tipi di campione e di metodi di estrazione. Il LLoQ è risultato pari a 713 UI/ml. LINEARITÀ La linearità è stata determinata usando campioni ottenuti ad hoc da uno stock a concentrazione nota di un ceppo di CMV addizionato a matrici di plasma e sangue intero risultate clinicamente negative. Il pannello consisteva di almeno 10 pool di copie note, che coprivano l'intervallo di linearità atteso. In questi pool, almeno 3 concentrazioni erano prossime al limite inferiore di quantificazione (LLOQ), 2 erano prossime al limite superiore di quantificazione (ULOQ) e le rimanenti erano distribuite in modo approssimativamente omogeneo tra il LLOQ e l ULOQ. Ogni campione è stato analizzato in modo casuale, in almeno 3 replicati. Il protocollo di linearità è stato eseguito per ogni tipo di campione, con ciascuno dei due metodi di estrazione. I singoli valori dell intervallo lineare sono illustrati nella tabella seguente. Plasma Sangue intero MagNA Pure EasyMag MagNA Pure EasyMag UI/ml da 713 a 3,96 10 8 da 396 a 3,96 10 8 da 396 a 3,96 10 8 da 396 a 3,96 10 8 Copie/ml da 180 a 1,00 10 8 da 100 a 1,00 10 8 da 100 a 1,00 10 8 da 100 a 1,00 10 8

Simplexa CMV Pagina 12 Grafico della linearità del plasma con estrazione easymag Grafico della linearità del sangue intero con estrazione easymag

Simplexa CMV Pagina 13 Grafico della linearità del plasma con estrazione MagNA Pure Grafico della linearità del sangue intero con estrazione MagNA Pure

Simplexa CMV Pagina 14 INTERVALLO RIPORTABILE Tutti i metodi di estrazione e i tipi di campioni erano lineari fino a <3,96 x 10 8 UI/ml. L intervallo riportabile più basso del saggio era basato sul tipo di campione e sul metodo di estrazione, con il valore più elevato per il limite inferiore di quantificazione (LLoQ) in UI/ml, che rientrava ugualmente nell intervallo lineare. L intervallo riportabile del saggio è risultato di >713 UI/ml - < 3,96 10 8 UI/ml. I campioni che si trovano al di sopra dell intervallo lineare saranno riportati come >3,96 10 8 UI/ml e i campioni che si trovano al di sotto dell intervallo riportabile saranno riportati come <713 UI/ml. REATTIVITÀ ANALITICA / CROSS-REATTIVITÀ È stata valutata la specificità analitica/cross-reattività del saggio Simplexa. Gli studi hanno indicato che i primer sono specifici per CMV e non danno reazioni crociate con altri virus o batteri che causano sintomi clinici simili o che sono presenti nella normale flora dei tipi di campione in questione. Ogni potenziale corss-reagente è stato analizzato in tre replicati. Organismo (plasma) Risultato Organismo (sangue intero) Risultato HBV (Materiali di controllo usati senza diluizioni) Non rilevato NA NA HCV (Materiali di controllo Non rilevato NA NA usati senza diluizioni) Adenovirus Non rilevato Adenovirus Non rilevato HIV-1 Non rilevato HIV-1 Non rilevato HIV-2 Non rilevato HIV-2 Non rilevato HSV-1 Non rilevato HSV-1 Non rilevato HSV-2 Non rilevato HSV-2 Non rilevato HHV-6 Non rilevato HHV-6 Non rilevato JCV Non rilevato JCV Non rilevato HHV-7 Non rilevato HHV-7 Non rilevato HHV=8 Non rilevato HHV-8 Non rilevato Rubella Non rilevato Rubella Non rilevato Parvovirus Non rilevato Parvovirus Non rilevato Toxoplasma gondii Non rilevato Toxoplasma gondii Non rilevato VZV Non rilevato VZV Non rilevato EBV Non rilevato EBV Non rilevato HTLV-1 Non rilevato HTLV-1 Non rilevato INTERFERENZA Il saggio Simplexa CMV identifica in modo specifico il DNA di CMV in presenza di potenziali agenti interferenti. È stato determinato che le sostanze interferenti sono sostanze probabilmente presenti nei campioni del paziente, possibili sostanze esogene presenti nei campioni o sostanze usate per il prelievo dei campioni. Lo studio è stato condotto su CMV e agenti interferenti addizionati nella matrice negativa del sangue intero e del plasma. Le sostanze interferenti analizzate sono state: azatioprina, ciclosportina, ganciclovir, idrossiclorochina, prednisone, abacavir, efavirenz e darunavir. Non è stata osservata alcuna interferenza. CONTAMINAZIONE DA CARRYOVER Il carryover di amplificato è stato valutato per lo strumento e il Universal Disc utilizzando altri saggi. Questi studi hanno ricercato la presenza di contaminazioni in campioni altamente negativi. Ogni studio è stato impostato posizionando alternativamente su ogni disco un campione altamente positivo ed uno altamente negativo. L effetto da carryover è stato valutato confrontando il tasso di negativi osservato per i campioni altamente negativi con il tasso atteso, nelle normali condizioni di riproducibilità. Nei test eseguiti non è stato osservato alcun effetto dovuto a contaminazioni da carryover.

Simplexa CMV Pagina 15 BIBLIOGRAFIA 1. Mocarski, E. S. (1993) Cytomegalovirus biology and replication, p 173-226 In B. Roizman, R. J. Whitley, and C. Lopez (ed), the Human Herpesviruses. Raven Press, New York, N.Y. 2. Fowler KB, Stagno S, Pass RF, Britt WJ, Boll TJ, Alford CA. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 1992 Mar 5;326(10):663-7. 3. Grundy JE, Lui SF, Super M, Berry NJ, Sweny P, Fernando ON, Moorhead J, Griffiths PD. Symptomatic cytomegalovirus infection in seropositive kidney recipients: reinfection with donor virus rather than reactivation of recipient virus. Lancet. 1988 Jul 16;2(8603):132-5. 4. Griffiths, P. D. and Emery, V.C. (2002) Cytomegalovirus, p 433-461 In D. D. Richman, R. J. Whitley, and F. G. Hayden (ed), Clinical Virology second edition. ASM Press, Washington, D.C. 5. Kalpoe, J. S., et al or (A. C. M. Kroes, M. D. de Jong, J. Schinkel, C. S. de Brouwer, M. F. C. Beersma, and E. C. J. Claas) (2004) Validation of Clinical Application of Cytomegalovirus Plasma DNA Load Measurement and Definition of Treatment Criteria by Analysis of Correlation to Antigen Detection p. 1498 1504 Vol. 42, No. 4 JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY 6. Baldanti F, Lilleri D, Gerna G. Monitoring human cytomegalovirus infection in transplant recipients. J Clin Virol. 2008;41(3):237-41. 7. Fryer JF. Heath AB, Anderson R, Minor PD and the collaborative study group. Collaborative study to evaluate the proposed 1st WHO International Standard for human cytomegalovirus (HCMV) for nucleic acid amplification (NAT)-based assays. WHO ECBS Report 2010; WHO/BS/10.2138. 8. NCCLS H18-A2. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 2nd Ed. 9. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4th ed. And National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A). L uso delle sonde Scorpions per la diagnostica in vitro nell'uomo è coperto da una licenza concessa da DxS, Ltd a Focus Diagnostics, Inc. I coloranti Black Hole Quencher, CAL Fluor e Quasar sono a marchio Biosearch Technologies, Inc. ('BTI'). La tecnologia con colorante Black Hole Quencher, CAL Fluor e Quasar è concessa in licenza ai sensi dell accordo con BTI e tali prodotti sono venduti a solo scopo clinico, diagnostico o di ricerca e sviluppo. Questo foglio illustrativo è disponibile in francese, tedesco, spagnolo e portoghese brasiliano sul sito www.focusdx.com e può essere richiesto in altre lingue al proprio distributore locale. RAPPRESENTANTE AUTORIZZATO mdi Europa GmbH, Langenhagener Str. 71 30855, Langenhagen-Hannover, Germania INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Telefono: Fax: (800) 838-4548 (solo USA) (562) 240-6510 (562) 240-6500 (dall'estero) PI.MOL2200.OUS Rev. D In data: 22 aprile 2013 ASSISTENZA TECNICA Telefono: (800) 838-4548 (solo USA) Fax: (562) 240-6526 Visitate il nostro sito web all indirizzo www.focusdx.com (562) 240-6500 (dall'estero) Cypress, California 90630 USA